提取方法對馬鈴薯渣果膠結(jié)構(gòu)特征及特性的影響

楊月嬌,馬智玲,白英

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010018)

果膠是廣泛存在于高等植物組織細(xì)胞壁之間的天然糖類高分子聚合物,屬于植物膠[1],具有預(yù)防慢性疾病、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[2]。果膠是一種無毒、安全的天然食品成分[3],親水性能比較好[4],同時(shí)具有良好的凝膠性和乳化性[5],在食品、紡織、醫(yī)藥、環(huán)境、生物等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6]。果膠主要生產(chǎn)地為英、法、美、以色列和丹麥等國,亞洲地區(qū)產(chǎn)量極少。我國每年消耗果膠在1 500 t以上,其中約80%為進(jìn)口[7]。高質(zhì)量高產(chǎn)量果膠的研究生產(chǎn)已然勢在必行。

馬鈴薯因其種植歷史悠久、栽培簡易、分布范圍廣泛、產(chǎn)量大等特點(diǎn)，成為世界第四大糧食作物。馬鈴薯渣是馬鈴薯加工過程中產(chǎn)生的一種營養(yǎng)物質(zhì)豐富的副產(chǎn)物,其主要成分是水,其余是細(xì)胞碎片和細(xì)小的淀粉顆粒[8]。馬鈴薯渣含有果膠、纖維素、氨基酸、膳食纖維和少量的蛋白質(zhì)[9]。馬鈴薯渣的不當(dāng)處理會(huì)污染環(huán)境,并且造成資源浪費(fèi)[10],因此可提取馬鈴薯渣中的有效成分,應(yīng)用于各個(gè)加工產(chǎn)業(yè)當(dāng)中。提取的先決條件是保證馬鈴薯渣中果膠的完整分子結(jié)構(gòu),使用溫和的手段將果膠從馬鈴薯渣中提取出來。已有研究表明,可使用微波法、沉淀法、酸法、堿法等方法處理馬鈴薯渣[11],從中提取得到純度較高的果膠樣品。不同提取方法可能會(huì)得到不同性質(zhì)、功能和產(chǎn)率的果膠樣品[12]。

本研究采用鹽沉析提取(salt-treated extraction STE)、酸處理提取(acid-treated extraction, ATE)和酶處理提取(enzyme-treated extraction, ETE)3種方法提取馬鈴薯渣中的果膠,并比較了3種方法提取的果膠的抗氧化活性、顯微結(jié)構(gòu)、單糖組成和分子質(zhì)量及紅外功能團(tuán),為進(jìn)一步提取、開發(fā)和利用馬鈴薯渣果膠提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯渣,內(nèi)蒙古康萊納食品有限責(zé)任公司；耐高溫α-淀粉酶(10 000 U/g)、堿性蛋白酶(100 000 U/g)、纖維素酶(100 000 U/g),和氏璧生物工程有限公司；半乳糖醛酸,上海源葉生物科技有限公司；Tris,Amresco公司；DPPH、單糖標(biāo)品,sigma公司；鹽酸、濃H2SO4、無水乙醇、NaOH、Al2(SO4)3、FeSO4,均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH.S11-Ni2恒溫水浴鍋,北京長安科學(xué)儀器廠；T6新世紀(jì)紫外分光光度儀,北京普析通用儀器有限公司；AB 204-N電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司；pHS-3C數(shù)顯酸度計(jì),杭州雷磁分析儀器廠；GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FDU-2200冷凍干燥機(jī),日本Eyela公司；CL-21R高速冷凍離心機(jī)、Haake RS6000流變儀,美國Thermo Fisher公司；島津LC-10A高效液相色譜儀、Shimadzu GCMS-QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；SEM掃描電鏡,德國Sartorius公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將馬鈴薯渣烘干,取一定量的馬鈴薯渣干樣加入蒸餾水混勻,用耐高溫α-淀粉酶去淀粉,用堿性蛋白酶去蛋白,過濾,烘干粉碎,過篩得到樣品備用。

1.3.2 提取方法

1.3.2.1 酸法提取工藝

將預(yù)處理樣品按料液比1∶15(g∶mL)的比例溶解在蒸餾水中,調(diào)節(jié)溶液pH到2,90 ℃反應(yīng)1 h后過濾取清液旋蒸,3 000 r/min離心10 min后收集上清液。使用4倍體積的95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇沉淀上清液,4 000 r/min離心20 min,收集沉淀,用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌沉淀物3次,并在65 ℃下蒸發(fā)殘余乙醇,將樣品溶解在蒸餾水中并凍干,獲得ATE果膠。

1.3.2.2 酶法提取工藝

將預(yù)處理樣品按料液比1∶15(g∶mL)溶解在蒸餾水中,調(diào)節(jié)溶液pH到5,按5 mg/g添加纖維素酶,50 ℃下保存4 h, 過濾取清液旋蒸,3 000 r/min離心10 min后收集上清液。使用4倍體積的95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇沉淀上清液,4 000 r/min離心20 min,收集沉淀,使用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌沉淀物3次,并在65 ℃下蒸發(fā)殘余乙醇,將樣品溶解在蒸餾水中并凍干,獲得ETE果膠。

1.3.2.3 鹽沉析法提取工藝

將預(yù)處理樣品按料液比1∶15(g∶mL)溶解在蒸餾水中,調(diào)節(jié)溶液pH到2,90 ℃下反應(yīng)1 h,過濾取清液旋蒸,3 000 r/min離心10 min后收集上清液。將上清液pH調(diào)節(jié)到5,50 ℃下加入150 g/L的Al2(SO4)3沉析40 min取上清液,4 000 r/min離心20 min，收集沉淀,脫鹽過濾,將樣品溶解在蒸餾水中并凍干,獲得STE果膠。

1.4 試驗(yàn)指標(biāo)及測定方法

1.4.1 果膠得率

馬鈴薯渣果膠得率的測定采用重量法,果膠得率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：m1,樣品馬鈴薯渣的質(zhì)量,g；m2,干燥后得到的果膠的質(zhì)量,g。

1.4.2 果膠單糖組成測定

取2 mg多糖,1 mL的2 mol/L三氟乙酸水解90 min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。殘基加入2 mL雙蒸水和100 mg硼氫化鈉還原,加入冰醋酸中和,旋蒸后于110 ℃烘箱中烘干,加入1 mL乙酸酐于100 ℃反應(yīng)1 h,冷卻后加入3 mL甲苯,減壓濃縮蒸干,重復(fù)4～5次,以除去多余的乙酸酐。將以上處理后的產(chǎn)物用3 mL氯仿溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗,加入少量蒸餾水充分振蕩后,除去上層水溶液,如此重復(fù)5次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥,定容10 mL,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定乙?；a(chǎn)物樣品。

GC-MS條件：Rxi-5 SIL MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫條件：起始溫度120 ℃,以3 ℃/min升溫至250 ℃/min,保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃,檢測器溫度為250 ℃/min,載氣He,流速為1 mL/min。

1.4.3 果膠分子質(zhì)量組成測定

樣品配制成5 mg/mL的溶液,進(jìn)樣量為20 μL。以不同分子質(zhì)量的葡聚糖(1 152,5 200,11 600,23 800,148 000,273 000,410 000 Da)作為標(biāo)準(zhǔn)品,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用高效液相色譜儀測定多糖的純度及相對分子質(zhì)量。

1.4.4 果膠SEM微觀結(jié)構(gòu)測定

取適量馬鈴薯果膠粉末,鍍金后觀察果膠的微觀結(jié)構(gòu),掃描功率為15 kV,在放大2 000倍條件下檢測。

1.4.5 果膠紅外光譜檢測

精密稱取果膠樣品，同KBr壓制成片,空白對照采用KBr粉末壓片而成,分別置于FI-IR儀中進(jìn)行掃描。

1.4.6 初始黏度測定

將不同方法提取的馬鈴薯果膠樣品溶解于去離子水中,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的果膠溶液,混勻平衡12 h后,使用Haake RS6000 流變儀測定果膠初始黏度,試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.4.7 果膠溶液抗氧化性質(zhì)測定

1.4.7.1 DPPH自由基清除能力測定

制備10 mg/mL的多糖溶液。參考LIM等[13]的方法測定馬鈴薯渣果膠樣品的DPPH自由基清除能力。

1.4.7.2 ·OH清除能力測定

制備10 mg/mL的多糖溶液。參考CHEN等[14]的方法測定馬鈴薯渣果膠樣品的·OH清除能力。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 19對均值進(jìn)行單因素ANOVA分析和最小顯著差數(shù)法多重比較,P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法的果膠提取率

采用3種提取方法得到的果膠提取率：STE>ATE>ETE(圖1)。STE沉析是在ATE方法的基礎(chǔ)上,將醇沉的方式用適量硫酸鋁沉析進(jìn)行替換。Al3+與果膠酸生成果膠酸鋁,通過脫鹽液進(jìn)行脫鹽,得到果膠。實(shí)驗(yàn)表明,鹽析法較醇沉的方式更顯著提高果膠得率(P<0.05)。ATE果膠較ETE果膠得率高,可能是溫度對果膠產(chǎn)率有較大影響。杭瑜瑜等[16]在菠蘿皮渣果膠的鹽析法提取及理化性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn),如果溫度過低,果膠分子熱運(yùn)動(dòng)緩慢,不利于果膠向溶液轉(zhuǎn)移,溫度過高會(huì)發(fā)生果膠分子解聚現(xiàn)象。應(yīng)姍姍[17]在提取火龍果果膠時(shí)發(fā)現(xiàn)提取果膠所用酶的種類、添加量及自身純度對果膠提取率有很大影響。

圖1 提取方法對馬鈴薯渣果膠得率的影響Fig.1 Effect of extract methods on extraction rates of potato residue pectin注:組間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 單糖組成

不同方法提取的馬鈴薯果膠的單糖組成如表1所示,STE果膠主要的單糖組成為葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖,葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖摩爾比為1.68∶3.53∶1.00；ATE果膠是一種由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖以及少量的鼠李糖和木糖組成的果膠,葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖摩爾比為28.36∶10.12∶1.00∶0.26∶0.19；ETE果膠主要的單糖組成為葡萄糖和半乳糖,葡萄糖、半乳糖摩爾比為1.65∶1.00。3種馬鈴薯果膠均含有葡萄糖和半乳糖,ATE中的葡萄糖含量最高,STE中的半乳糖含量最高。單糖組成和比例的變化與所用提取方法有關(guān)[18]。酶處理會(huì)改變多糖的單糖組成和摩爾比[19]。

表1 不同提取方法的馬鈴薯果膠的主要單糖組成Table 1 Main monosaccharide composition of potato pectin with different extraction methods

2.3 分子質(zhì)量

多糖的重量平均分子量(Mw)通常是評價(jià)多糖質(zhì)量的重要指標(biāo)[20-21]。經(jīng)Breeze GPC軟件計(jì)算,如圖2-a所示,STE多糖有1個(gè)洗脫峰,分子質(zhì)量為11 669.1 Da,主峰Mw為 11 669.1 Da。如圖2-b所示,ATE多糖出現(xiàn)3個(gè)不同的峰,分子質(zhì)量分別為1 494 503、51 481和10 240 Da,主峰的Mw為51 481 Da。如圖2-c所示,ETE多糖有2個(gè)明顯的峰,分子質(zhì)量分別為1 122 173和14 593 Da,其中主峰Mw為 14 593 Da。結(jié)果表明,ETE和STE果膠的分子質(zhì)量比ATE果膠的小。ATE果膠是多相多糖,因?yàn)樗鼈冇?個(gè)以上的分子量分布峰[22]。此外,果膠分子質(zhì)量分布的多樣性與提取方法有關(guān)系。

2.4 SEM微觀結(jié)構(gòu)

圖3為不同處理的馬鈴薯渣果膠的SEM分析結(jié)果。STE果膠表面光滑、結(jié)構(gòu)致密,呈大小較為均勻的立體塊狀結(jié)構(gòu),因?yàn)楝F(xiàn)在工藝不能達(dá)到完全除鹽,表面有鋁鹽晶體附著；ATE果膠結(jié)構(gòu)疏松,表面有粗糙感,呈棉絮片狀,片層邊緣卷曲；ETE果膠表面為不規(guī)則褶皺卷曲半緊密狀態(tài),褶皺光滑且連續(xù),中間孔洞大小不均。由此可見,不同方法制備的馬鈴薯果膠的微觀結(jié)構(gòu)是存在明顯區(qū)別的,果膠提取劑的性質(zhì)和沉析方法極大影響果膠的微觀結(jié)構(gòu)。

a-STE;b-ATE;c-ETE圖2 馬鈴薯渣果膠分子質(zhì)量圖譜Fig.2 Molecular weight of residue pectin

a-STE;b-ATE;c-ETE圖3 馬鈴薯渣果膠SEM掃描圖Fig.3 SEM micrographs of potato residue pectin

2.5 傅立葉紅外光譜圖

a-STE;b-ATE;c-ETE圖4 馬鈴薯渣果膠紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of potato residue pectin

2.6 黏度的測定結(jié)果

不同方法提取的果膠表觀黏度如圖5所示,相同質(zhì)量濃度下,3種提取方法的表觀黏度：ATE>ETE>STE (P<0.05)。3種方法的分子質(zhì)量大小排序?yàn)锳TE>ETE>STE,微觀結(jié)構(gòu)也對黏度有一定影響,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較強(qiáng)的果膠,表現(xiàn)出較高的初始黏度。溶液黏度還由有效顆粒濃度決定。在SEM結(jié)果中發(fā)現(xiàn)STE有晶體結(jié)晶,導(dǎo)致樣品溶解后實(shí)際果膠質(zhì)量小于稱量質(zhì)量,果膠濃度相對較低,所以STE果膠的黏度小于其他2組。同樣,分子質(zhì)量對果膠初始黏度也有影響,分子質(zhì)量越大,其表觀黏度值也越高。這與田玉霞等[31]的蘋果果膠分子質(zhì)量越大黏度越高研究結(jié)果相似。

圖5 提取方法對馬鈴薯渣果膠黏度的影響Fig.5 Effect of extract methods on viscosity of potato residue pectin

2.7 果膠抗氧化活性測定結(jié)果

2.7.1 DPPH自由基清除率

如圖6-a所示,ATE果膠對DPPH自由基清除能力最高。馬鈴薯渣果膠DPPH自由基清除活性為：ATE>ETE>STE(P<0.05)。多糖對DPPH自由基的清除活性由其化學(xué)性質(zhì)決定[32]。有研究表明,多糖的抗氧化活性與其平均分子質(zhì)量(10～1 000 kDa)和單糖(葡萄糖、甘露糖和半乳糖)組成有關(guān),分子質(zhì)量越大,葡萄糖和甘露糖、半乳糖比例越高,物質(zhì)抗氧化活性越強(qiáng)[33]。ATE果膠的單糖組成結(jié)果顯示,葡萄糖和甘露糖占很大比例(表1),并且其分子質(zhì)量大于其他兩種果膠。

2.7.2 ·OH清除率

如圖6-b所示,STE多糖對·OH的清除活性最高。馬鈴薯渣果膠清除·OH活性順序?yàn)椋篠TE>ETE>ATE (P<0.05)?；钚匝踔饕伞H和H2O2組成。過高的活性氧水平會(huì)攻擊組織,導(dǎo)致氧化應(yīng)激[34]。STE多糖可能含有具有還原能力的半縮醛羥基,阻止自由基的連鎖反應(yīng)。衍生物多糖對·OH的清除作用還與取代基的類型、位置和程度有關(guān)[35]。

a-DPPH自由基；圖6 提取方法對馬鈴薯渣果膠抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of extract methods on free radical scavenging capacity of potato residue pectin

3 結(jié)論