食用油與氯化鈉模型反應中氯丙醇酯的消長規(guī)律

賈雪穎,黃明泉,張雨萌,張璟琳,孫寶國

(北京工商大學 食品質(zhì)量與安全北京實驗室,北京,100048)

氯丙醇(chloropropanol，CP)是丙三醇的羥基被1個或2個氯取代形成的化合物的總稱[1]，食品加工過程中，單氯丙二醇的生成量通常是雙氯丙醇的100～10 000倍，而單氯丙二醇中3-氯-1,2-丙二醇(3-monochloropropane-1,2-diol, 3-MCPD)通常又是2-氯-1,3-丙二醇(2-monochloropropane-1,3-diol, 2-MCPD)的數(shù)倍至10倍，因此以3-MCPD作為主要指標，可反映食品加工中氯丙醇類物質(zhì)的污染狀況[2]。然而，食品中氯丙醇類化合物僅少數(shù)以游離的3-MCPD的形式存在，大部分以其酯化的形式存在[3]。研究表明3-MCPD酯對腎臟[4]、大腦和潛在的神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性[5-6]，目前，已在餅干[5- 6]、面包[3]、咖啡[8]、食用油[9]、人造奶油[10]等多種食品中檢測出，其中污染水平較為嚴重的是食用油，含量普遍大于1 000 μg/kg[11]。因食用油參與食品加工過程，所以食品易被MCPD酯污染。為了減少食品中的MCPD酯，有必要通過模擬反應來確定其影響因素和變化規(guī)律。

目前，考察MCPD酯變化規(guī)律的多集中在油脂精煉，溫度和時間對生成3-MCPD酯影響較大，在精煉植物油的脫臭環(huán)節(jié)(1～1.5 h，220～260 ℃)生成的3-MCPD酯的量最多[12]，同時Fe3+的存在可以顯著促進3-MCPD酯的形成[13]。此外,3-MCPD酯的形成還取決于油的pH值，pH值從1增加到4，3-MCPD酯的生成量隨之增加[14]，當pH值增加到8時，3-MCPD酯的生成量隨之減少[13]。另一些研究考察了不同加工條件下3-MCPD酯的變化規(guī)律，在油脂微波加熱模型中發(fā)現(xiàn)金屬離子，酸性條件有助于3-MCPD酯的生成，3-MCPD酯含量隨NaCl的質(zhì)量濃度增加而增加[15]。在菜肴模型中發(fā)現(xiàn)不同油脂對3-MCPD酯生成的影響不同[16]。WONG等[17]以炸土豆條的煎炸油為分析對象，連續(xù)5 d檢測3-MCPD酯含量，結(jié)果表明3-MCPD酯隨著油炸時間的增加而減少，隨油溫和NaCl增加而增加。

綜上，影響MCPD酯生成的因素主要為食用油種類、溫度、時間、水含量、鹽含量和pH值。雖然3-MCPD酯受到較多關注，但是研究發(fā)現(xiàn)2-MCPD酯在食用油和奶粉中的含量可達到3-MCPD酯的1/3到1/2[9-10]，同時有文獻對2-MCPD酯進行了毒性研究[18-19]，推測2-MCPD酯可能與3-MCPD酯毒性近似，因此2-MCPD酯的研究越來越受到關注，但對2-MCPD酯在加工過程中的變化規(guī)律鮮有研究。因此，本實驗建立了食品和煎炸油2個食品加工體系模型，通過考察食用油種類、溫度、時間、水含量、鹽含量和pH值等因素的影響，以期揭示2-MCPD酯和3-MCPD酯的消長規(guī)律，為降低食品加工中MCPD酯的含量提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品：菜籽油(編號1)、玉米油(編號2)、花生油(編號3)、棕櫚油(編號4)、大豆油(編號5),特級初榨橄欖油,超市。

試劑：叔丁基甲基醚(t-butyl methyl ether,TBME)、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、NaCl、NaOH、石油醚、甲醇、甲苯、液體石蠟,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司；磷酸、苯硼酸、異辛烷,均為分析純,百靈威科技有限公司；3-氯-1,2-丙二棕櫚酸酯(1,2-distearoyl-3-chloropropanediol, pp-3-MCPD)、d5-3-氯-1,2-丙二棕櫚酸酯(d5-1,2-distearoyl-3-chloropropanediol, d5-pp-3-MCPD)、2-氯-1,3-丙二硬脂酸酯(1,3-distearoyl-2-chloropropanediol, pp-2-MCPD)、d5-2-氯-1,2-丙二棕櫚酸酯(d5-1,2-distearoyl-2-chloropropanediol, d5-pp-2-MCPD),均為標準品,純度>97%,Toronto Research Chemicals公司。

1.2 儀器與設備

T-403電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；EF9697 Pipetman M精密移液器,法國Gilson公司；TSQ8000三重串聯(lián)四極桿氣相質(zhì)譜儀,美國Thermo Fisher公司；BF-2000氮氣吹干儀,北京八方世紀科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

pp-3-MCPD溶液和pp-2-MCPD溶液均用甲苯稀釋至10.0 μg/mL；d5-pp-3-MCPD和d5-pp-2-MCPD溶液均用甲苯稀釋至5.0 μg/mL；甲醇鈉溶液配制：0.25 g NaOH溶解于100 mL甲醇中,搖勻至全部溶解,放置于-22 ℃冰箱中；溴化鈉溶液配制：600 g溴化鈉與3.0 mL磷酸定容于1.0 L水中,移取600 μL,加入350 μL甲醇鈉溶液,放置于-22 ℃冰箱中；乙醚/乙酸乙酯溶液配制：將30 mL乙醚與20 mL乙酸乙酯混合放置于存儲瓶中；苯硼酸溶液配制：稱取200 mg苯硼酸溶解于10 mL丙酮中。

1.3.2 模型反應建立

(1)食品模型反應的建立。分別稱取100 mg油,10 mg NaCl,100 mg水(總質(zhì)量為210 mg,質(zhì)量不足時用液體石蠟補齊),而在考慮NaCl為影響因素時,總質(zhì)量為250 mg,質(zhì)量不足時用液體石蠟補齊。放入耐壓管中,在160 ℃下反應30 min,通過改變同一因素下的不同水平,確定不同因素對2-MCPD酯和3-MCPD酯的影響程度,單因素實驗條件如表1所示。

表1 食品模型反應的實驗條件Table 1 Experimental conditions for food model reaction

(2)煎炸油模型反應的建立。分別稱取1 000 mg油,10 mg NaCl,60 mg水放入耐壓管中(總計為1 110 mg,質(zhì)量不足時用液體石蠟補齊),在160 ℃下反應30 min,通過改變同一因素下的不同水平,確定不同因素對2-MCPD酯和3-MCPD酯的影響程度,單因素實驗條件如表2所示。

表2 煎炸油模型反應的實驗條件Table 2 Experimental conditions for frying oil model reaction

1.3.3 MCPD酯的前處理

模型反應結(jié)束后,拿出耐壓管放至常溫,加入1.0 mL 5.0 mol/L NaCl溶液和1.0 mL正己烷,充分振蕩。靜置移取上層正己烷溶液至10 mL離心管,再加入1.0 mL正己烷至反應管,重復提取1次。合并2次提取液旋蒸氮吹至干,加入50.0 μL內(nèi)標物d5-pp-3-MCPD,d5-pp-2-MCPD和600 μL乙醚,搖晃直到溶解。樣品在-22～-25 ℃下保持15 min后再加入350 μL甲醇鈉溶液,在-22 ℃條件下反應16 h。然后取出反應液,加入600 μL溴化鈉溶液在-22 ℃下停止反應后氮吹至干。加入正己烷600 μL,振蕩,在室溫下靜置5 min后用吸管移去有機相,再用600 μL正己烷清洗1次,隨后移去有機相。用600 μL乙醚/乙酸乙酯(體積比3∶2)溶液提取3次,轉(zhuǎn)移有機相然后用無水硫酸鈉除去水,再加入80 μL衍生溶液,常溫超聲5 min,氮吹至干,最后用500 μL的異辛烷復溶[20]。

1.3.4 儀器分析條件

(1)氣相色譜條件。HP-5MS毛細管柱(30 m × 0.25 mm,0.25 μm)；升溫程序：初溫60 ℃,以6 ℃/min升至150 ℃,保持2 min；再以10 ℃/min升至280 ℃,保持5 min；載氣He,純度99.999%；流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣,進樣量1.0 μL。

(2)質(zhì)譜條件。EI源,電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃,選擇反應掃描模式(selective reaction monitoring, SRM)參數(shù)如表3所示。

表3 MCPD酯的保留時間和二級質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Retention times and m/z of native and stable isotope labelled MCPDEs for GC-MS/MS analysis

1.4 MCPD酯含量計算

內(nèi)標標準曲線建立：3-MCPD酯和2-MCPD酯的定量結(jié)果均以游離態(tài)3-MCPD、2-MCPD計算[21]。換算系數(shù)如表4所示。

表4 MCPD酯及其同位素折算系數(shù)Table 4 Conversion coefficient of MCPDE and d5-MCPDE

樣品中3-MCPD酯或2-MCPD酯的含量計算(以MCPD計)如公式(3)所示:

(3)

式中：X,試樣中2-MCPD酯或3-MCPD酯的含量,mg/kg；m1,試樣色譜峰峰面積與內(nèi)標物面積比值在標準曲線上對應2-MCPD酯或3-MCPD酯的質(zhì)量,μg；m2,試樣的取樣量,mg。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件,應用方差分析Duncan檢測進行顯著性分析,以P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。利用Origin 9.0軟件繪制柱形圖和折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法驗證

研究表明,特級初榨橄欖油中MCPD酯含量低于檢出限[22],因此本實驗在100 mg特級初榨橄欖油中添加不同質(zhì)量濃度梯度的標準溶液(相當于3-MCPD或2-MCPD含量的0.000、0.026、0.052、0.104、0.207、0.311、0.518、0.725和0.932 μg)進行標準曲線繪制,結(jié)果如表5所示。2條標準曲線的相關系數(shù)分別為0.999 9和0.999 8,線性良好；以信噪比(S/N)=3確定3-MCPD酯和2-MCPD酯的檢出限分別為0.002 1和0.003 2 mg/kg,以信噪比(S/N)=10確定定量限分別為0.004 3和0.005 2 mg/kg。

表5 MCPD酯的標準曲線、定量限及檢出限結(jié)果Table 5 Standard curves LOD and LOQ of MCPDE

檢測方法的準確度可以通過添加已知含量的標準物來確定。在100 mg特級初榨橄欖油中分別添加3個不同質(zhì)量濃度標準溶液,重復進行6次,以回收率對準確度進行評估,以相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)對精密度進行評估,結(jié)果如表6所示。MCPD酯的回收率為90.4%～97.7%,相對標準偏差為2.2%～8.8%。這說明該方法的準確度和精密度良好。

表6 MCPD酯的回收率和相對標準偏差Table 6 Accuracy and relative standard deviation of MCPDE

2.2 食品模擬反應中MCPD酯的變化規(guī)律

如圖1所示,不同種類的食用油中3-MCPD酯的含量均具有顯著性差異(P<0.05),花生油和菜籽油中的2-MCPD酯的含量差異不顯著,而其他幾種油中2-MCPD酯的含量差異顯著。棕櫚油食品模型中2-MCPD酯(1.96 mg/kg)和3-MCPD酯(4.55 mg/kg)的含量最高,且明顯高于其他4種油。棕櫚油食品模型2-MCPD酯含量是其他4種油的3～24倍,3-MCPD酯的含量為2～13倍。實驗結(jié)果與ARISSETO等[23]的結(jié)果一致,該實驗用不同精煉油煎炸同批土豆,結(jié)果表明,精煉棕櫚油煎炸后的土豆3-MCPD酯的污染較為嚴重。在5種不同油脂的食品模型中,3-MCPD酯的含量為2-MCPD酯的2～4倍。這與ERMACORA等[24]發(fā)現(xiàn)植物油中3-MCPD酯的含量為2-MCPD酯的2～3倍的研究結(jié)果一致。有研究表明所有精制油在加熱處理后的3-MCPD酯含量均增加,但3-MCPD酯的含量在不同的油中變化卻不同[13]。這些研究與本實驗結(jié)果一致,說明食品中MCPD酯的污染程度與所使用植物油的污染程度高度相關。

圖1 不同食用油種類中MCPD酯的含量Fig.1 Content of MCPDE in different types of edible oil

不同反應時間對MCPD酯含量的影響如圖2所示,3-MCPD酯的含量隨時間的延長具有顯著性差異,其含量最初是1.51 mg/kg,最后降低到1.22 mg/kg,隨著反應時間的增多而降低。這說明3-MCPD酯在長時間加熱時不穩(wěn)定并且分解,而2-MCPD酯在15、60和75 min無顯著變化,其分解速率與合成速率大體相當,含量維持在0.62 mg/kg左右；然而在45 min顯著升高,這可能與3-MCPD酯在降解的時候轉(zhuǎn)化為了2-MCPD酯有關,ERMACORA等[25]在研究3-MCPD酯降解時,發(fā)現(xiàn)隨著3-MCPD酯含量的降低,2-MCPD酯含量增加。

圖2 反應時間對MCPD酯含量的影響Fig.2 Effect of processing time on the content pf MCPDE

不同含水量對MCPD酯含量的影響如圖3所示,不同含水量條件下3-MCPD酯含量無顯著性差異,而2-MCPD酯呈現(xiàn)先增加后下降趨勢,最終含量與初始含量無顯著性差異。2-MCPD酯的變化可能是因為隨著含水量增加促進了甘油酯水解,增加了形成2-MCPD酯的前體物所致。

圖3 含水量對MCPD酯含量的影響Fig.3 Effect of water content on the content of MCPDE

不同反應溫度對MCPD酯含量的影響如圖4所示,在100～160 ℃,2-MCPD酯含量無顯著性差異(P<0.05)；在130～160 ℃,3-MCPD酯的含量無顯著性差異,160 ℃繼續(xù)升溫后兩者含量開始下降,達到190 ℃時,3-MCPD酯和2-MCPD酯含量與之前具有顯著性差異(P<0.05),2-MCPD酯的含量較初始含量減少了5%；3-MCPD酯的含量減少了20%。這說明溫度提高加速了2-MCPD酯和3-MCPD酯的降解,同時 3-MCPD酯的降解速度大于2-MCPD酯。

圖4 反應溫度對MCPD酯含量的影響Fig.4 Effect of processing temperatures on the content of MCPDE

圖5為不同NaCl含量對MCPD酯含量的影響,隨著NaCl的增加3-MCPD酯含量不斷增加,從初始的1.56 mg/kg增加到1.66 mg/kg；而2-MCPD酯有輕微減少,從初始的0.68 mg/kg減至0.64 mg/kg。說明在較短的時間內(nèi),NaCl的存在對3-MCPD酯形成的促進作用大于2-MCPD酯。隨著前體物的增加,3-MCPD酯的含量不斷增加。但總體來說,NaCl對3-MCPD酯與2-MCPD酯的影響均不明顯,含量變化在5.8%～6.4%。但2-MCPD酯和3-MCPD酯含量隨著NaCl含量變化具有顯著性差異(P<0.05),但該結(jié)論與煎炸面團的模型反應中的結(jié)果不一致,該研究認為鹽含量不會顯著影響油炸面團中3-MCPD酯的量[26],這可能與NaCl取值范圍不同有關。

圖5 NaCl含量對MCPD酯含量的影響Fig.5 Effect of sodium chloride content on the content of MCPDE

圖6為不同pH值對MCPD酯含量的影響。3-MCPD酯含量在不同pH值(4～8)模型中無顯著性差異,然而2-MCPD酯含量在pH值4～7與8有顯著性差異,pH為8時,2-MCPD酯含量更低。有研究表明,酸性會促進MCPD酯形成[13],在酸性條件下,Cl-的電離度比H+大,有利于3-MCPD酯的形成。在油中加入碳酸鹽或碳酸氫鹽會極大減少3-MCPD酯的含量[27]。

圖6 pH值對MCPD酯含量的影響Fig.6 Effects of pH values on the content of MCPDE

2.3 煎炸油模型反應中MCPD酯的變化規(guī)律

不同食用油種類對MCPD酯含量的影響如圖7所示,不同種類的食用油中2-MCPD酯和3-MCPD酯的含量均具有顯著性差異(P<0.05),兩類MCPD酯含量的變化規(guī)律與食品模擬反應中幾乎完全一致,棕櫚油中MCPD酯含量最高,3-MCPD酯含量為其他4種油的2～14倍,2-MCPD酯為3～24倍。不同模型反應對不同食用油的影響程度是近似的,因此最終食品中MCPD酯的含量很大程度上來自原料中MCPD酯前體物的含量。

圖7 不同食用油種類中MCPD酯的含量Fig.7 Content of MCPDE in different types of edible oil

不同反應時間對MCPD酯含量的影響如圖8所示。隨著反應時間的變化,3-MCPD酯的含量一直在降低,從最初的1.792 mg/kg降低到1.483 mg/kg。2-MCPD酯的含量先增大后逐漸減小,從最初0.726 mg/kg,加熱1 h后升高到0.752 mg/kg,最后降低到0.715 mg/kg。3-MCPD酯的變化規(guī)律與TURAN等[26]的發(fā)現(xiàn)一致,他們在第0～5天的范圍內(nèi)研究了油炸持續(xù)時間對3-MCPD酯的形成的影響,發(fā)現(xiàn)在160 和180 ℃的油炸溫度下3-MCPD酯含量隨時間增加而下降。2-MCPD酯的變化規(guī)律與食品模型反應中近似,含量隨時間增加均表現(xiàn)為先小幅上升后下降的趨勢,但峰值所對應的時間點不同。

圖8 反應時間對MCPD酯含量的影響Fig.8 Effect of processing time on the content of MCPDE

不同含水量對MCPD酯含量的影響如圖9所示。2-MCPD酯的含量無顯著差異,而3-MCPD酯含量先上升后緩慢下降至初始含量。由圖9可知,含水量達到20 mg時,3-MCPD酯含量最高,高出初始含量11%?？赡苁堑秃康乃龠M了甘油酯水解,甘油二酯或單酯與NaCl結(jié)合更易產(chǎn)生MCPD酯；而當含水量繼續(xù)增加,NaCl濃度降低,減少了產(chǎn)生MCPD酯的可能[28]。

圖9 含水量對MCPD酯含量的影響Fig.9 Effect of water content on the content of MCPDE

不同反應溫度對MCPD酯含量的影響如圖10所示。3-MCPD酯在160 ℃時的含量為1.867 mg/kg,而220 ℃時的含量為9.302 mg/kg,是160 ℃的5倍。2-MCPD酯也有相同的規(guī)律,100 ℃時含量為0.776 mg/kg,190 ℃時達到1.001 mg/kg后迅速增加,220 ℃時達到3.482 mg/kg。190 與220 ℃條件下,MCPD酯的含量具有顯著性差異(P<0.05),這與油脂精煉反應中的脫臭環(huán)節(jié)的條件近似,而脫臭已被認為是產(chǎn)生MCPD酯的重要環(huán)節(jié)。在溫度低于250 ℃時,3-MCPD酯的生成速率大于降解速率[27],隨溫度的上升,3-MCPD酯含量上升。

圖10 反應溫度對MCPD酯含量的影響Fig.10 Effect of processing temperatures on the content of MCPDE

不同NaCl含量對MCPD酯含量的影響如圖11所示。隨著NaCl含量的增加,MCPD酯的含量呈現(xiàn)增加趨勢,且低含量與高含量NaCl所對應的MCPD酯含量具有顯著性差異(P<0.05)。2-MCPD酯的含量增加3.9%,3-MCPD酯的含量增加9.0%。說明NaCl對3-MCPD酯的影響多于2-MCPD酯,在相同條件下更易生成3-MCPD酯。LI等[13]發(fā)現(xiàn)隨著NaCl質(zhì)量濃度(72～144 g/L)的增加,3-MCPD酯急劇增加。當NaCl質(zhì)量濃度超過144 g/L時,3-MCPD酯的含量幾乎沒有明顯變化。然而本實驗結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)3-MCPD酯后面有平緩趨勢,這可能與NaCl含量的取值范圍有關。值得注意的是,在食品模擬體系中,NaCl對2-MCPD酯和3-MCPD酯的作用是相反的,而煎炸油模擬體系中NaCl作用是近似的。這可能是因為油的比例不同造成的,煎炸模型體系中油的用量大,所含有的前體物濃度大,使得在此模型條件下,隨著NaCl的增加,MCPD酯的生成速率占有主導地位,從而含量也增加。所以去除氯離子和減少前體物濃度是降低2-MCPD酯和3-MCPD酯的一種重要手段。

圖11 NaCl含量對MCPD酯含量的影響Fig.11 Effect of sodium chloride content on the content of MCPDE

3 結(jié)論

通過對食品模型反應和煎炸油模型反應的研究,發(fā)現(xiàn)油的種類、反應時間、溫度和NaCl含量對2-MCPD酯和3-MCPD酯的含量變化有著較大的影響。其中,食品模型反應中MCPD酯的含量變化幅度較小,而煎炸油模型反應中變化幅度較大。由此推測,外源性的煎炸油的遷移為食品中MCPD酯污染的主要因素。2-MCPD酯和3-MCPD酯雖然結(jié)構(gòu)近似,但變化趨勢并不完全一致。在煎炸油模型反應中,隨時間增長,3-MCPD酯含量不斷下降,而2-MCPD酯含量先增加后減少。這可能是3-MCPD酯在降解時轉(zhuǎn)化為2-MCPD酯所致。而食品模型反應中,隨著NaCl含量增加,3-MCPD酯含量增加,而2-MCPD酯含量減少。這可能是在生成MCPD酯時,優(yōu)先生成3-MCPD酯,而非2-MCPD酯。本實驗可為2-MCPD酯和3-MCPD酯的變化提供參考,同時3-MCPD酯和2-MCPD酯的遷移變化有望進一步研究。