宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中表面微生物群落演替規(guī)律

鄧祥宜,李繼偉,何立超,張?jiān)?黃國(guó)威,鮑曉龍,邱朝坤

(武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院,湖北 武漢,430205)

宣恩火腿是湖北省恩施自治州一帶特產(chǎn),其在乾隆時(shí)期曾作為貢品,以宣恩縣所產(chǎn)火腿最負(fù)盛名,甚至被譽(yù)為中國(guó)“四大名腿”之一[1-2]。宣恩火腿一直沿用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn),微生物自然接種,在長(zhǎng)達(dá)1～2年的加工過(guò)程中,形成了獨(dú)特的質(zhì)地和風(fēng)味。關(guān)于宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)、脂肪等理化指標(biāo)的變化規(guī)律已有報(bào)道[2-4],但宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的變化規(guī)律有待揭示。

研究微生物群落的方法主要包括分離培養(yǎng)法[5]、Biolog-ECO微平板技術(shù)[6]、變性梯度凝膠電泳法[7]、16S rRNA/18S rRNA/ITS基因克隆文庫(kù)測(cè)序法[8]和高通量測(cè)序法等。高通量測(cè)序技術(shù),又稱下一代測(cè)序技術(shù),通過(guò)測(cè)定細(xì)菌16S rRNA序列、真菌ITS序列等,與對(duì)應(yīng)的物種分類數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),從而確定微生物種類和豐度[9-11]；其雖然不能獲得純培養(yǎng)菌株,但一次可測(cè)得單個(gè)樣本中數(shù)萬(wàn)條菌株序列信息,故能以更高的靈敏度、準(zhǔn)確度和相對(duì)低廉的價(jià)格快速鑒定樣本中的微生物種類和豐度,包括豐度很低的種類[12-13]。

微生物在火腿發(fā)酵過(guò)程中扮演著重要角色,與火腿的風(fēng)味、品質(zhì)和安全性密切相關(guān),研究火腿發(fā)酵過(guò)程中微生物群落組成具有很強(qiáng)的實(shí)際意義。本文利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵期宣恩火腿表面的細(xì)菌、真菌群落多樣性進(jìn)行研究,以期為宣恩火腿建立工業(yè)化生產(chǎn)工藝作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料及取樣

不同發(fā)酵期宣恩火腿表面(肉面)微生物樣本,于2019年11月湖北省思樂(lè)牧業(yè)集團(tuán)有限公司采樣。宣恩火腿加工工藝流程[4, 14]：選腿(豬后腿)→修胚→攤涼→腌制→洗腿→整形→烘腿→入庫(kù)發(fā)酵→洗霉→修割→驗(yàn)收。自“入庫(kù)發(fā)酵”開始計(jì)算發(fā)酵時(shí)間,取樣點(diǎn)為發(fā)酵前期(發(fā)酵40 d,霉菌生長(zhǎng)完全覆蓋火腿表面)、發(fā)酵中期(發(fā)酵90 d,霉菌生長(zhǎng)最旺盛階段)、發(fā)酵后期(發(fā)酵570 d,霉菌生長(zhǎng)消退；發(fā)酵180 d以上為發(fā)酵后期,但發(fā)酵1～2年能更好地保證火腿中病毒失活,增加安全性和品質(zhì)[15])。采樣參照GB 4789.1—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》規(guī)定,各階段樣本分別隨機(jī)選取20個(gè)面積約5 cm×5 cm的取樣區(qū)(肉面),用滅菌棉球反復(fù)擦拭火腿表面(肉面)微生物,并清洗到100 mL無(wú)菌水中,而后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管,6 000 r/min離心15 min,取沉淀備用。

1.2 主要儀器與試劑

GeneAmp?9700型PCR儀,美國(guó)ABI公司；QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng),美國(guó)Promega公司；Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)、TruSeqTM DNA Sample Prep Kit,美國(guó)Illumina 公司；FastDNA?SPIN Kit for Soil土壤DNA快速提取試劑盒,美國(guó)MPbio公司；TransStart Fastpfu DNA 聚合酶,北京TransGen生物；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒,美國(guó)Axygen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物基因組DNA的提取及高通量測(cè)序

取沉淀樣本,用土壤DNA快速提取試劑盒提取總DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,用NanoDrop 2000 測(cè)定DNA純度和含量。通過(guò)PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū),引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),擴(kuò)增真菌ITS1-ITS2序列,引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS2R(5′-GCTGCGTTC-TTCATCGATGC-3′)；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收、定量分析后進(jìn)行Illumina MiSeq測(cè)序[16],測(cè)序公司為上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3.2 高通量測(cè)序結(jié)果分析

MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果借助美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行分析,主要分析流程為：將測(cè)序原始序列進(jìn)行拼接和質(zhì)控,按樣本進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類分析和物種分類學(xué)分析,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平處理；基于抽平后的OTU進(jìn)行Alpha多樣性分析；基于分類學(xué)信息,在不同分類學(xué)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析；并對(duì)細(xì)菌、真菌優(yōu)勢(shì)種進(jìn)行物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析、系統(tǒng)發(fā)育分析(即進(jìn)化分析)；并對(duì)群落功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

OTU分析使用Usearch平臺(tái)(version 7.0, http://drive5.com/uparse/),相似性在97%以上的序列聚為一類,細(xì)菌比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(Release132, http://www.arb-silva.de),真菌比對(duì)Unite數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 7.2, http://unite.ut.ee/index.php)；物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析使用Networkx軟件；系統(tǒng)發(fā)育分析使用FastTree軟件(version 2.1.3, http://www.microbesonline.org/fasttree/)；功能預(yù)測(cè)分析使用PICRUSt軟件包(version 1.1.0, http://picrust.github.io/picrust/),細(xì)菌使用EggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups,http://eggnog.embl.de/)數(shù)據(jù)庫(kù),真菌使用MetaCyc(https://metacyc.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)；樣本與物種關(guān)系Circos圖用Circos-0.67-7(http://circos.ca/)完成,其他圖使用Excel軟件、R語(yǔ)言工具統(tǒng)計(jì)和作圖。

1.3.3 高豐度未知物種的進(jìn)一步注釋

高通量測(cè)序結(jié)果分析中,一些物種的分類無(wú)法確定(no_rank/unclassified),挑選其中高豐度OTU代表序列,在線比對(duì)NCBI中的16S rRNA或ITS數(shù)據(jù)庫(kù)(如果沒(méi)有高度相似序列,則進(jìn)一步比對(duì)nr數(shù)據(jù)庫(kù)),并基于查詢的16S rRNA或ITS序列,用MEGA7軟件通過(guò)最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹,以對(duì)物種進(jìn)行更精確的注釋(Bootstrap值設(shè)置為1 000次重復(fù))[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本序列統(tǒng)計(jì)

宣恩火腿樣本測(cè)序信息見表1。經(jīng)質(zhì)控、拼接,細(xì)菌(含古菌)16S rRNA序列V3～V4區(qū)共測(cè)得134 721條序列,平均長(zhǎng)度426 bp；真菌ITS1-ITS2序列共測(cè)得111 395條序列,平均長(zhǎng)度231 bp。按最小序列數(shù)抽平處理[18],獲得抽平后的序列數(shù)為細(xì)菌38 829條/樣本、真菌36 268條/樣本。

表1 樣本信息和Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Sample information and Alpha diversity index

2.2 宣恩火腿微生物群落Alpha多樣性分析

宣恩火腿表面微生物群落Alpha多樣性指數(shù)見表1。多樣性指數(shù)中,sobs指數(shù)、ace指數(shù)和chao1指數(shù)可顯示群落物種的豐富度,數(shù)值越大代表物種豐富度越高；shannon指數(shù)和simpson指數(shù)綜合反映群落多樣性,shannon指數(shù)越大代表群落多樣性越高,simpson指數(shù)越小代表群落多樣性越高；coverage指數(shù)顯示物種覆蓋度,值越接近1(即100%)表明測(cè)序越全面,越能代表樣本真實(shí)物種組成情況[19-20]。

表1中,所有樣本真菌和細(xì)菌測(cè)序的覆蓋率(coverage)指數(shù)均大于99.9%,同時(shí)樣品稀釋曲線趨于平緩(圖1),說(shuō)明增加測(cè)序量只能發(fā)現(xiàn)極少量的物種,即測(cè)序結(jié)果能很好地反應(yīng)樣本微生物多樣性。宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中,細(xì)菌(含古菌)的sobs、ace和chao1指數(shù)持續(xù)增加,顯示物種豐富度不斷提高；shannon指數(shù)持續(xù)顯著增加,simpson指數(shù)持續(xù)顯著減小,顯示細(xì)菌多樣性持續(xù)提高。發(fā)酵過(guò)程中,真菌sobs、ace和chao1指數(shù)變化較小,顯示真菌物種豐富度變化相對(duì)較??；真菌的shannon指數(shù)先減小后增大,simpson指數(shù)先增大后減小,但變化幅度均較小,顯示真菌多樣性波動(dòng)較小,呈現(xiàn)微弱的先減小后增大的趨勢(shì)。另外,比較sobs指數(shù)、ace指數(shù)和chao 1指數(shù)可發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌物種豐富度整體大于真菌。因此,在發(fā)酵過(guò)程中,宣恩火腿表面細(xì)菌豐富度和多樣性持續(xù)增加,真菌的豐富度和多樣性波動(dòng)較小,且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌物種豐富度大于真菌。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of samples注：A-b、B-b、C-b依次為發(fā)酵前期、中期、后期火腿樣本的細(xì)菌群落；A-f、B-f、C-f分別為發(fā)酵前期、中期、后期火腿樣本的真菌群落

2.3 宣恩火腿微生物群落組成分析

2.3.1 細(xì)菌(含古菌)群落組成分析

在97%的相似水平上對(duì)宣恩火腿表面細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行OTU分析,通過(guò)Venn圖展示宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中共有和獨(dú)有的細(xì)菌(含古菌)物種數(shù)如圖2-a所示。所有樣本中共測(cè)得133個(gè)細(xì)菌OTUs,其中發(fā)酵前期、中期、后期的火腿樣本依次測(cè)得19、64、123個(gè)OTUs；說(shuō)明宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中,細(xì)菌群落豐富度逐漸增加,不斷有新的細(xì)菌種類參與發(fā)酵過(guò)程。

在門水平上,所有樣本共檢出11個(gè)門的細(xì)菌,除1個(gè)豐度很低的古細(xì)菌門(Euryarchaeota,廣古菌門,占比<0.01%)外,其余10個(gè)為真細(xì)菌門,主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)等。發(fā)酵前、中期,厚壁菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(>99%)；發(fā)酵后期,變形菌門占69%,而厚壁菌門下降到27%(圖2-b)。宣恩火腿表面細(xì)菌在屬水平(共96個(gè))、種水平(共125個(gè))上的組成分別見圖2-c和圖2-d。圖2-d為Circos圖,是一種描述樣本與物種之間對(duì)應(yīng)關(guān)系的可視化圈圖,其不僅反映了每個(gè)樣本的優(yōu)勢(shì)物種組成比例,同時(shí)也反映了各優(yōu)勢(shì)物種在不同樣本(分組)中的分布比例[21]。發(fā)酵前、中期,葡萄球菌屬的木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(>98%)；發(fā)酵后期,沙雷氏菌屬(Serratia)未知種unclassified_g_Serratia(OTU61)占比最大,為42.2%,前期占優(yōu)勢(shì)的木糖葡萄球菌下降到24.9%,根瘤菌科未知屬未知種s_uncultured_Rhizobiales_bacterium(OTU113)占20.8%,甲基菌屬的藤黃亞甲基桿菌(Methylobacteriumfujisawaense)占3.9%,Solitalea屬未培養(yǎng)菌s_uncultured_bacterium_g_Solitalea占1.9%(OTU72),芽孢桿菌科未知種s_unclassified_f_Bacillaceae占1.6%(OTU37),其他占4.7%。

綜上,宣恩火腿發(fā)酵中,細(xì)菌群落豐富度不斷增加,各物種相對(duì)豐度呈動(dòng)態(tài)變化,發(fā)酵前、中期主要為木糖葡萄球菌,發(fā)酵后期的主要優(yōu)勢(shì)屬為葡萄球菌屬、沙雷氏菌屬和甲基菌屬。

2.3.2 真菌群落組成分析

在97%的相似水平上對(duì)真菌ITS1-ITS2測(cè)序結(jié)果進(jìn)行OTU分析,通過(guò)Venn圖展示宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中共有和獨(dú)有的真菌物種數(shù)目信息(圖2-f)。3個(gè)發(fā)酵期樣本中真菌群落共測(cè)得21個(gè)OTUs,其中發(fā)酵前、中、后期的火腿樣本依次測(cè)得16、19、16個(gè)OTUs。所有發(fā)酵期共有OTUs為12個(gè),占57%；發(fā)酵前期沒(méi)有獨(dú)有OTUs,發(fā)酵中、后期分別獨(dú)有1、2個(gè)OTUs。因此,宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中真菌種類較為穩(wěn)定,57%的種類在整個(gè)發(fā)酵期始終存在。

宣恩火腿真菌包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和未分類的門(unclassified_k_Fungi)。發(fā)酵過(guò)程中,子囊菌門占比持續(xù)增加,擔(dān)子菌門占比不斷減少,未分類門呈先增加后減少的趨勢(shì)(圖2-g)。宣恩火腿表面真菌在屬水平(共8個(gè))、種水平(共12個(gè))上的組成分別見圖2-h和圖2-e。曲霉屬(Aspergillus)在發(fā)酵過(guò)程中較為穩(wěn)定,發(fā)酵前、中、后期占比依次為37.9%、43.2%和41.0%,但在種水平上有物種更替,發(fā)酵前、中期Aspergilluscibarius占優(yōu)勢(shì),而發(fā)酵后期帚狀曲霉(Aspergilluspenicillioides)占優(yōu)勢(shì)；未分類真菌s_unclassified_k_Fungi(OTU7)在發(fā)酵前、中、后期占比依次為24.3%、46.5%和25.6%；節(jié)菌屬(Wallemia)在發(fā)酵過(guò)程中逐漸下降,發(fā)酵前、中、后期占比依次為37.6%、9.9%和1.5%；未分類酵母unclassified_o_Saccharomycetales(OTU20)由發(fā)酵前期未檢出、中期占0.01%,到發(fā)酵后期占31.1%,說(shuō)明酵母是發(fā)酵后期優(yōu)勢(shì)類群之一。

a-細(xì)菌OTU水平Venn圖；b-細(xì)菌門水平相對(duì)豐度；c-細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度；d-細(xì)菌種水平circos圖；e-真菌種水平Circos圖；f-真菌OTU水平Venn圖；g-真菌門水平相對(duì)豐度；h-真菌屬水平相對(duì)豐度圖2 宣恩火腿的微生物區(qū)系Fig.2 The microbiota of Xuanen ham注：A、B、C依次為發(fā)酵前、中、后期的火腿樣本

綜上,宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中,真菌種類相對(duì)穩(wěn)定,但各物種相對(duì)豐度存在動(dòng)態(tài)變化,發(fā)酵前、中期主要是Aspergilluscibarius、未分類真菌(OTU7)、節(jié)菌屬占優(yōu)勢(shì),發(fā)酵后期主要優(yōu)勢(shì)種為帚狀曲霉、未分類真菌(OTU7)、未分類酵母(OTU20)等。

2.4 物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

2.4.1 單因素網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)宣恩火腿表面細(xì)菌、真菌優(yōu)勢(shì)種分別進(jìn)行單因素網(wǎng)絡(luò)分析,當(dāng)物種之間的相關(guān)系數(shù)符合某一閾值(P<0.05)時(shí)就用線連接,用不同顏色表示物種之間正、負(fù)相關(guān)性[22],結(jié)果見圖3-a和圖3-b。細(xì)菌群落中,木糖葡萄球菌與其他種類呈負(fù)相關(guān),其他種之間互為正相關(guān)(圖3-a)。真菌群落中,曲霉屬Aspergilluscibarius和節(jié)菌屬s_unclassified_g_Wallemia呈正相關(guān)；這兩者與發(fā)酵后期占優(yōu)勢(shì)的帚狀曲霉(A.penicillioides)、巴恩曲霉菌(A.baarnensis)、三角山氏酵母(Yamadazymatriangularis)和未分類酵母s_unclassified_o_Saccharomycetales(OTU20)均為負(fù)相關(guān)；后4種真菌互為正相關(guān)(圖3-b)。雖然發(fā)酵過(guò)程中,未分類真菌(OTU7)豐度一直很高,但它與其他種類真菌的豐度沒(méi)有顯著相關(guān)性,故未在圖3-b中顯示。

a-細(xì)菌種水平單因素網(wǎng)絡(luò)分析；b-真菌種水平單因素網(wǎng)絡(luò)分析；c-細(xì)菌與真菌種水平雙因素網(wǎng)絡(luò)分析圖3 宣恩火腿微生物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析Fig.3 Network analysis for microbiota of Xuanen ham注：節(jié)點(diǎn)大小與種的豐度成正比,紅色連線代表正相關(guān),綠色連線代表負(fù)相關(guān);a與b中節(jié)點(diǎn)顏色代表門類別,c中節(jié)點(diǎn)顏色代表綱類別

2.4.2 雙因素網(wǎng)絡(luò)分析

將主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種和真菌優(yōu)勢(shì)種(作為其他因子)進(jìn)行雙因素網(wǎng)絡(luò)分析,結(jié)果見圖3-c。曲霉屬Aspergilluscibarius與木糖葡萄球菌呈正相關(guān),與其他細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)；帚狀曲霉(A.penicillioides)、未分類酵母(OTU20)與木糖葡萄球菌呈負(fù)相關(guān),與其他細(xì)菌呈正相關(guān)(圖3-c)；其他主要真菌與細(xì)菌種類沒(méi)有顯著相關(guān)性,故未在圖3-c中顯示。

2.5 進(jìn)化分析

在種水平上對(duì)宣恩火腿主要細(xì)菌和真菌分別進(jìn)行進(jìn)化分析,結(jié)果見圖4。主要細(xì)菌種類來(lái)自厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門等4個(gè)門(圖4-a)；主要真菌種類來(lái)自子囊菌門、擔(dān)子菌門和未分類的門(圖4-c)。將OTU分析中沒(méi)有成功注釋到種的OTU代表序列,與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相似度最高的序列一起構(gòu)建個(gè)性化系統(tǒng)發(fā)生樹(圖4-b、4-d),以對(duì)物種進(jìn)行更精確的注釋。

細(xì)菌(圖4-b)中,根瘤菌科未知種uncultured_Rhizobiales_bacterium(OTU113)與Methylobacteriumbrachiatum和M.phyllostachyos聚為一類,16S rRNA序列一致度為100%,所以O(shè)TU113能進(jìn)一步鑒定到甲基菌屬(Methylobacterium),可能為兩者之一；同理,芽孢桿菌科未知屬未知種unclassified_Bacillaceae(OTU37)可鑒定為Corynebacteriumtuberculostearicum,Solitalea屬未知種uncultured_bacterium_Solitalea(OTU72)可鑒定為Oceanobacilluspicturae,葉桿菌屬未知種uncultured_bacterium_Phyllobacterium(OTU84)可鑒定為Phyllobacteriummyrsinacearum。沙雷氏菌屬未知種unclassified_g_Serratia(OTU61)與未培養(yǎng)細(xì)菌序列KF632521聚為一類,序列一致度100%,其目前還不能鑒定到種；同理,腸桿菌科未知屬未知種unclassified_norank_ Enterobacteriaceae(OTU124)不能鑒定到屬。

真菌(圖4-d)中,未分類真菌unclassified_Fungi(OTU7)與未培養(yǎng)真菌ITS序列KF221761聚為一類,序列一致度99%,其目前還不能進(jìn)一步鑒定到門。節(jié)菌屬未知種unclassified_Wallemia(OTU3、OTU4)分別與Wallemiasebi、Wallemiatropicalis一致度達(dá)99%,所以u(píng)nclassified_Wallemia包括這2個(gè)種；酵母目未分類種unclassified_Saccharomycetales(OTU20)與嗜糖假絲酵母(Candidaglucosophila)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)聚在一起,但序列一致度不高(分別為93%、83%),故不能確定該酵母的種屬。

a-細(xì)菌種水平系統(tǒng)發(fā)生樹及物種測(cè)序豐度圖；b-細(xì)菌未分類OTU的進(jìn)化分析；c-真菌種水平系統(tǒng)發(fā)生樹及物種測(cè)序豐度圖；d-真菌未分類OTU的進(jìn)化分析圖4 宣恩火腿主要微生物的進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of major microorganisms of Xuanen ham注：a～d中,樹枝長(zhǎng)度為進(jìn)化距離,分支節(jié)點(diǎn)處顯示1 000次重復(fù)檢驗(yàn)的置信值(%)；a和c中,進(jìn)化樹樹枝顏色代表不同門,右邊柱狀圖展示的是物種在不同樣本中的測(cè)序數(shù)(reads),A、B、C依次為發(fā)酵前、中、后期的火腿樣本

2.6 功能預(yù)測(cè)分析

通過(guò)PICRUSt對(duì)16S rRNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行細(xì)菌群落功能的預(yù)測(cè),獲得OTU對(duì)應(yīng)的COG家族相對(duì)豐度,結(jié)果見圖5。忽略未知功能后,宣恩火腿表面細(xì)菌功能主要包括氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝(相對(duì)豐度11.2%～11.6%)、碳水化合物運(yùn)輸及代謝(7.3%～8.0%)、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換(6.4%～6.6%)、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝(7.1%～7.5%)、脂類運(yùn)輸及代謝(3.4%～3.5%)等方面,這表明細(xì)菌群落對(duì)火腿蛋白質(zhì)、脂肪的降解有重要作用。

圖5 PICRUSt推斷的細(xì)菌COG功能相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of inferred bacterial COG functions by PICRUSt

通過(guò)PICRUSt對(duì)ITS測(cè)序結(jié)果進(jìn)行真菌群落的功能預(yù)測(cè),獲得真菌MetaCyc pathway豐度(表2)。根據(jù)功能預(yù)測(cè)的豐度值,真菌群落主要功能包括有氧呼吸、乙醛酸循環(huán)、脂肪酸β氧化、GDP甘露糖生物合成、三羧酸循環(huán)、鳥氨酸降解Ⅱ等途徑。

表2 PICRUSt 推斷的真菌MetaCyc pathway豐度(前10)Table 2 Abundance of inferred MetaCyc pathways by PICRUSt

其中,乙醛酸循環(huán)和脂肪酸β氧化都與脂肪降解密切相關(guān),脂肪酸β氧化分解為乙酰CoA之后,在乙醛酸體內(nèi)生成琥珀酸、乙醛酸和蘋果酸,從而進(jìn)一步代謝；鳥氨酸降解Ⅱ與蛋白質(zhì)降解途徑相關(guān)。因此,宣恩火腿表面真菌群落對(duì)脂肪、蛋白質(zhì)的降解有重要作用。

3 結(jié)論與討論

發(fā)酵食品雖然種類繁多,但一般都具有各自相對(duì)穩(wěn)定的微生物生態(tài)系統(tǒng)[23]。本文通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究了宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中表面細(xì)菌和真菌的多樣性,揭示了群落演替規(guī)律。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),宣恩火腿表面細(xì)菌主要為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、甲基菌屬(Methylobacterium)(包括根瘤菌科未知屬g_norank_f_Rhizobiaceae,其經(jīng)進(jìn)化分析也鑒定為甲基菌屬)等；其中,木糖葡萄球菌(S.xylosus)在發(fā)酵前、中期占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(>98%),發(fā)酵后期下降到24.9%。有研究表明,金華火腿發(fā)酵中葡萄球菌是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[24-25]；云腿主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)等[26]；木糖葡萄球菌能轉(zhuǎn)換氨基酸,使得亮氨酸和其他游離氨基酸含量增加從而提升火腿風(fēng)味[27],發(fā)酵后期細(xì)菌群落多樣性的增加可能有利于火腿形成更加豐富的風(fēng)味。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)宣恩火腿表面真菌主要為曲霉屬(Aspergillus)、節(jié)菌屬(Wallemia)、未分類真菌unclassified_Fungi(OTU7)和酵母；曲霉屬在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均有較高豐度,節(jié)菌屬在發(fā)酵中豐度逐漸降低,而酵母僅在發(fā)酵后期占據(jù)優(yōu)勢(shì)。有研究表明,霉菌和酵母是眾多火腿的優(yōu)勢(shì)真菌。宣威火腿表面和內(nèi)部主要真菌為曲霉屬、酵母和節(jié)菌屬[7]；云腿中的優(yōu)勢(shì)真菌是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和酵母[26]；金華火腿發(fā)酵前期青霉屬占優(yōu)勢(shì),后期曲霉屬占優(yōu)勢(shì),酵母菌也發(fā)揮了很重要的作用[24]；Istrian火腿中分離的真菌主要來(lái)自散囊菌屬(Eurotium)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)[28]。

以上結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地火腿的微生物群落組成雖然存在差異,但在屬水平上具有很高的一致性。這些微生物會(huì)分泌蛋白酶、脂肪酶等,促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂肪水解產(chǎn)生游離氨基酸、脂肪酸,同時(shí)代謝產(chǎn)生各種特殊風(fēng)味成分和保護(hù)火腿顏色等[29]。本文通過(guò)功能預(yù)測(cè)也發(fā)現(xiàn),細(xì)菌和真菌均對(duì)宣恩火腿中蛋白質(zhì)、脂肪的降解有重要作用。

通過(guò)高通量測(cè)序研究微生物多樣性時(shí),常常會(huì)出現(xiàn)因物種數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息不足而導(dǎo)致物種不能準(zhǔn)確注釋的情況。本研究中,未分類真菌unclassified_Fungi(OTU7)無(wú)法準(zhǔn)確注釋到門,進(jìn)一步的進(jìn)化分析顯示其與未培養(yǎng)真菌ITS序列的一致度為99%。隨著時(shí)間的推移,物種注釋的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)會(huì)不斷更新,這種問(wèn)題應(yīng)該會(huì)逐漸解決。后續(xù)試驗(yàn)中也可嘗試?yán)酶鞣N培養(yǎng)基對(duì)unclassified_Fungi(OTU7)進(jìn)行分離培養(yǎng)和進(jìn)一步鑒定。

本文對(duì)宣恩火腿發(fā)酵過(guò)程中表面細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行了研究,對(duì)細(xì)菌、真菌優(yōu)勢(shì)種之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析,有利于了解主要微生物種類及共存關(guān)系,可為后續(xù)研發(fā)宣恩火腿發(fā)酵劑和開展人工接種生產(chǎn)火腿作參考,以便進(jìn)一步改善火腿品質(zhì)、縮短加工周期和提升安全性。本文沒(méi)有研究火腿內(nèi)部微生物,雖然內(nèi)部微生物會(huì)受到表面微生物的抑制,但其也發(fā)揮了重要作用[24],后續(xù)可以開展相關(guān)工作。