基于AGEs的糖尿病在牙周病發(fā)展過程的影響機(jī)制研究

徐孟丹 孫珍 陶庭亮 鮑利紅 鄒多宏

牙周病的引起原因有很多，主要包括菌斑、結(jié)石、不當(dāng)刷牙等均可加速牙周病的形成，此外還受到遺傳因素及基礎(chǔ)病的影響，最新的研究表明患者的基礎(chǔ)病如糖尿病等可能在牙周病的發(fā)展過程中其推進(jìn)作用[1-2]，臨床報(bào)道顯示糖尿病和牙周病相互作用并相互影響，糖尿病患者牙周病的發(fā)病率顯著增加。牙周治療后,可以適當(dāng)控制和改善糖尿病的癥狀，晚期糖基化終末產(chǎn)物 (advanced glycationend products，AGEs) 水平可能與糖尿病牙周病患者有一定的關(guān)聯(lián)，最新研究表明血漿AGEs水平與T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[3]，但具體尚不明確。

基于以上研究背景，本研究擬通過構(gòu)建大鼠牙周病模型及糖尿病模型，明確糖尿病在牙周病的誘導(dǎo)過程中起到的作用，并初步探索其作用機(jī)制[4]。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

水合氯醛、鏈脲佐菌素(Sigma 公司，美國)；正畸結(jié)扎絲(長沙天天齒科器材有限公司)； 葡萄糖檢測試劑盒(上海碧云天)；白介素6、腫瘤壞死因子、晚期糖基化終末產(chǎn)物ELISA檢測試劑盒 (武漢service-bio)； AGEs抗體(Abcam，英國)； GAPHD抗體、BCA定量試劑盒、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液(北京康為世紀(jì)生物有限公司)； 反轉(zhuǎn)錄及定量試劑盒(北京全式金生物試劑有限公司)。

1.2 主要儀器

臺式離心機(jī)(ALLEGA X-12，貝克曼，美國)； -80 ℃冰箱(902-ULTS)、酶標(biāo)儀(Multiskan FC)(Thermo Scientific，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

60 只SPF級雄性SD大鼠，體重180～220 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，并飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)條件： 12 h循環(huán)黑白，溫度20～24 ℃，相對濕度 50%～55%，每籠4 只，無菌條件飼養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)動物分組情況，60 只SD大鼠隨機(jī)分為4 組，每組15 只，即正常組(C)：正常飲食不干預(yù)；大鼠糖尿病模型組(T2DM)：通過注射鏈脲佐菌素 (STZ) 的方式構(gòu)建大鼠糖尿病模型；牙周病模型組(CP)：正畸結(jié)扎絲加醫(yī)用縫合線結(jié)扎下頜磨牙牙頸部構(gòu)建牙周病模型；糖尿病結(jié)合牙周病模型組(T2DM & CP)：大鼠糖尿病模型的基礎(chǔ)上正畸結(jié)扎絲加醫(yī)用縫合線結(jié)扎下頜磨牙牙頸部。

1.4 大鼠血糖測定

每周稱取大鼠體重，造模后4、8 周抽取各組大鼠空腹血液，按照試劑盒方法檢測各組大鼠血糖水平。

1.5 牙周探診深度與菌斑指數(shù)

于模型4、8 周后，測量大鼠實(shí)驗(yàn)區(qū)牙周探診深度(probing depth，PD) 和菌斑指數(shù)(mycelium index，MI)，取大鼠血液用于檢測血糖，

1.6 大鼠血清中IL-6、TNF-α、AGEs水平檢測

取各組大鼠血清，用ELISA方法檢測血清中IL-6，TNF-α、AGEs 水平。在酶標(biāo)儀上，于450 nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔A值。

1.7 Q-PCR

用Q-PCR法檢測大鼠牙周組織中AGEs基因表達(dá)水平，TRIZO提取RNA，加入引物反轉(zhuǎn)錄采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，于42 ℃，30 min，85 ℃加熱5 min后再降溫至4 ℃反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 保存至-20 ℃?zhèn)溆?。?shí)時(shí)定量PCR采用兩步法進(jìn)行第一步： 90 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s 約45 個(gè)循環(huán)，第二步： 95 ℃ 15 s。

1.8 Western-blot

用Western-blot法檢測大鼠牙周組織中AGEs 蛋白表達(dá)水平，RIPA提取組織蛋白，用BCA法按照試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，并用PBS緩沖液調(diào)整濃度。配制凝膠，電泳采用70 V電壓20 min，120 V至電泳結(jié)束。切膠，制作三明治后300 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上。 5%的脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3 次每次5 min，加入一抗孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3 次每次5 min，二抗孵育1 h，加入顯影液，曝光。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠基本情況及體重變化

對照組大鼠毛發(fā)、進(jìn)食、精神狀態(tài)均正常，T2DM及T2DM & CP在模型建立8 周時(shí)精神狀態(tài)差、毛發(fā)沾染較多液體，飲水量增加明顯，飼養(yǎng)墊料出現(xiàn)惡臭，大鼠行動明顯減少。各組大鼠體重變化情況如圖1所示，T2DM、T2DM & CP與正常組大鼠相比體重明顯下降，其中T2DM在第8 周出現(xiàn)一只大鼠死亡，T2DM & CP在模型構(gòu)建第8 周出現(xiàn)3 只死亡。

Fig 1 各組大鼠體重變化(與對照組比較，① P<0.05; 與CP組比較，② P<0.05)

2.2 各組大鼠血糖水平

如圖2所示，與對照組相比，STZ給藥4 周后，大鼠血糖明顯高于正常組(P<0.05)；給藥STZ 8 周后，給藥大鼠血糖繼續(xù)升高(17.9 mmol/L)，明顯高于正常對照組(4.6 mmol/L)。

Fig 2 各組大鼠血糖變化(與對照組比較，① P<0.05，② P<0.01; 與CP組比較，③ P<0.05，④ P<0.01)

2.3 各組大鼠牙周探診深度與菌斑指數(shù)

如表1所示，與對照組相比，STZ給藥4 周后，大鼠牙周探診深度明顯高于正常組(P<0.01)；給藥STZ 8 周后，給藥大鼠牙周探診深度繼續(xù)加深，明顯高于正常對照組。且與CP組相比，T2DM & CP組大鼠牙周探診深度明顯加深，菌斑指數(shù)升高。

2.4 大鼠血清中IL-6、TNF-α、AGEs水平

如圖3所示，與對照組相比，STZ給藥4 周后，大鼠IL-6、TNF-α、AGEs水平明顯高于正常組(P<0.05)；給藥STZ 8 周后，給藥大鼠IL-6、TNF-α及AGEs水平水平繼續(xù)升高，且與CP組相比，T2DM & CP組大鼠IL-6、TNF-α及AGEs水平更高(P<0.01，P<0.05，P<0.01)。

2.5 大鼠牙周組織中AGEs基因及蛋白表達(dá)水平

如圖4所示，與對照組相比，STZ給藥4 周后，大鼠AGEs基因與蛋白水平明顯高于正常組(P<0.05)； 給藥STZ 8 周后，給藥大鼠AGEs水平繼續(xù)升高，且與CP組相比，T2DM & CP組大鼠AGEs水平顯著高(P<0.01)。

表1 各組大鼠牙周探診深度與菌斑指數(shù)情況

圖3 各組大鼠血清中IL-6 (A)、TNF-α(B)和AGEs(C)水平變化(與對照組比較，① P<0.05，② P<0.01; 與CP組比較，③ P<0.05，④ P<0.01)

3 討 論

雖然T2DM和CP的相關(guān)性已被廣泛報(bào)道，但是CP與T2DM之間何種關(guān)聯(lián)尚不清楚[5]。本研究中，模型組大鼠在STZ給藥8 周時(shí)精神狀態(tài)差、毛發(fā)沾染較多液體、飲水量增加明顯，飼養(yǎng)墊料出現(xiàn)惡臭，大鼠行動明顯減少等癥狀。牙周探診深度和菌斑情況是牙周病發(fā)病過程中主要評價(jià)指標(biāo)，通過檢查牙周探診深度和菌斑指數(shù)可以更直觀的觀察大鼠牙周情況，在給藥STZ給藥8 周后，大鼠牙周探診深度繼續(xù)加深，明顯高于正常對照組。且與CP組相比，T2DM & CP組大鼠牙周探診深度明顯加深，菌斑指數(shù)升高(表1)，顯示糖尿病癥狀會加速牙周病的進(jìn)展。

牙周病的發(fā)病過程常伴隨機(jī)體全身反應(yīng)，如炎性因子的變化等研究認(rèn)為微生物刺激牙周發(fā)炎可引起促炎癥因子IL-6和TNF-α發(fā)生變化[6]，并進(jìn)入體循環(huán)干擾胰島素的功能進(jìn)而擾亂胰島素受體及胰島素信號傳導(dǎo)。其中，TNF-α作為第一個(gè)炎性因子參與肥胖誘導(dǎo)的胰島素耐受。TNF-α在胰島素功能受損后通過外周攝取葡萄糖增加絲氨酸胰島素受體底物磷酸化 (IRS-1)，從而抑制易位葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞膜[7]。因此IL-6和TNF-α作為常用炎性因子可以反應(yīng)出機(jī)體炎癥變化水平，ELISA結(jié)果顯示STZ加上結(jié)扎下頜磨牙手術(shù)后，大鼠體內(nèi)的IL-6和TNF-α水平遠(yuǎn)高于單獨(dú)STZ或結(jié)扎下頜磨牙手術(shù)組(圖3)，糖尿病可以加重結(jié)扎下頜磨牙手術(shù)引起的大鼠全身炎癥反應(yīng)癥狀。研究報(bào)道牙周治療可以降低牙周炎患者伴高血糖患者血糖水平，反應(yīng)出牙周病的進(jìn)展與血糖水平的相關(guān)性。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠單純正畸線結(jié)扎并不會引起血糖發(fā)生明顯變化，但是STZ給藥結(jié)合正畸線結(jié)扎大鼠的血糖水平高于單純STZ給藥組(圖2)，說明單純牙周病患者并不會出現(xiàn)血糖升高現(xiàn)象，但是糖尿病基礎(chǔ)病患者在發(fā)生牙周炎癥癥狀時(shí)可能會加重其血糖水平。但是其具體的機(jī)制仍不明確。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體 (RAGE)[8-10]是一種多配體受體，研究報(bào)道稱其可通過與相應(yīng)的配體結(jié)合后信號，影響機(jī)體的免疫防御和創(chuàng)傷面的愈合，并參與多種炎癥反應(yīng)，可調(diào)控多條免疫相關(guān)通路[11-13]。在牙周組織中, 本次研究表明在AGEs在病理狀態(tài)下 (模型) 的表達(dá)顯著增加，且在糖尿病伴牙周病大鼠體內(nèi)的表達(dá)量顯著高于單純牙周病大鼠，提示AGEs有可能參與糖尿病伴牙周病或牙周組織損傷過程，促進(jìn)牙周炎的發(fā)生發(fā)展。

圖4 各組大鼠組織中AGEs基因(A)與蛋白(B、C)水平變化情況(n=6)(與對照組比較，① P<0.05，② P<0.01; 與CP組比較，③ P<0.05，④ P<0.01)