沉默S100A10基因?qū)β殉舶㏒KOV-3和A2780細(xì)胞周期的影響

顏 偉 陳潭琇 王雅琦 王靈芝

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有20～22萬(wàn)人被診斷為卵巢癌，死亡人數(shù)每年10～14萬(wàn)人[1]。盡管卵巢癌可采用手術(shù)切除、化療和放療等治療手段，但預(yù)后依然較差，其中最主要的原因是卵巢癌發(fā)病隱匿，臨床癥狀體征不典型，被發(fā)現(xiàn)時(shí)大部分患者已處晚期[2]。與其他腫瘤類似，卵巢癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，它的發(fā)生發(fā)展涉及腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管生成及趨化等[3]。S100A10屬于S100蛋白家族成員之一，有研究表明S100A10在多種腫瘤(包括乳腺癌，肺癌，胃癌，胰腺癌及結(jié)直腸癌等)中異常高表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥、血管生成以及遷移侵襲的調(diào)控。然而，S100A10在卵巢癌中的作用目前報(bào)道較少[4]。本研究擬改變S100A10在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S100A10對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的影響，探討S100A10在卵巢癌中的作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

山羊抗兔/小鼠的單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白定量試劑盒及化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司；S100A10單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司，cyclinD1、CDK2及CDK4單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，β-actin單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SKOV-3、A2780及HEK293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 S100A10-shRNA的合成 S100A10-shRNA序列及對(duì)照序列shGFP均由上海生物工程股份有限公司合成，分別命名為shS100A10#1、shS100A10#2、shGFP。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV-3和A2780細(xì)胞,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待HEK293T細(xì)胞達(dá)到70%～80%滿后，將合成的shGFP、shS100A10#1和shS100A10#2按照脂質(zhì)體試劑說(shuō)明操作經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，48 h后，收集培養(yǎng)上清病毒液，800 g離心10 min，用0.45 μm濾器過(guò)濾，-80 ℃保存。將過(guò)濾后的病毒上清以1∶3的體積比加入SKOV-3和A2780細(xì)胞培養(yǎng)上清中，另外加入5 mg/ml的polybrene，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命名為shGFP組、shS100A10#1組、shS100A10#2組。

1.2.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 用胰蛋白酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，棄上清，用70%預(yù)冷乙醇固定，用PI在4 ℃染色30 min,最后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(1% Triton X-100;10 mM Tris-HCl,pH 7.4;150 mM NaCl;0.25% 去氧膽酸鈉;5 mM EDTA,pH 7.4)于冰上裂解20～30 min后，12 000 rpm離心15 min，收集蛋白上清，用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，取等量蛋白15 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃一抗(1∶5000)或β-actin(1∶4000)抗體孵育過(guò)夜，TBS-T洗3次，室溫二抗(1∶5000)孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯影，最后曝光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。若P<0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A10基因沉默的SKOV-3細(xì)胞和A2780細(xì)胞系的建立及鑒定結(jié)果

本研究成功構(gòu)建穩(wěn)定的S100A10基因敲降的SKOV-3和A2780細(xì)胞系。為檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，采用Western Blot法檢測(cè)S100A10的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組(shS100A10#1、shS100A10#2轉(zhuǎn)染)SKOV-3和A2780細(xì)胞中S100A10蛋白的表達(dá)強(qiáng)度均明顯低于各自對(duì)照組(shGFP轉(zhuǎn)染)SKOV-3和A2780細(xì)胞。見圖1。該結(jié)果說(shuō)明shRNA質(zhì)粒構(gòu)建有效，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 S100A10敲降卵巢癌細(xì)胞S100A10蛋白表達(dá)水平

2.2 S100A10敲降后SKOV-3和A2780細(xì)胞增殖能力變化

為了檢測(cè)S100A10表達(dá)水平對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，研究采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，S100A10表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖能力明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖2。

圖2 S100A10敲降對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 S100A10敲降后對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的影響

為了檢測(cè)S100A10表達(dá)水平對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制S100A10的表達(dá)后，SKOV-3細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 沉默S100A10表達(dá)水平對(duì)SKOV-3細(xì)胞周期的影響

2.4 S100A10敲降后SKOV-3和A2780細(xì)胞CyclinD1、CDK2及CDK4表達(dá)水平變化

CyclinD1、CDK2及CDK4是目前比較公認(rèn)的可影響細(xì)胞周期的蛋白分子，在細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。為了進(jìn)一步確認(rèn)S100A10可以影響卵巢癌細(xì)胞周期，采用Western Blot法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A10敲降后，轉(zhuǎn)染組(shS100A10#1、shS100A10#2轉(zhuǎn)染)SKOV-3和A2780細(xì)胞CyclinD1、CDK2及CDK4表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(shGFP轉(zhuǎn)染)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。該結(jié)果說(shuō)明S100A10敲降通過(guò)抑制CyclinD1、CDK2及CDK4蛋白的表達(dá)從而將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。

圖4 S100A10敲降后卵巢癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化

3 結(jié)果

卵巢癌在女性常見腫瘤中發(fā)病率居第九位，病死率居第五位，嚴(yán)重影響女性健康。在我國(guó)，卵巢癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前盡管外科手術(shù)切除、化療和放療已被證實(shí)有較好療效，但卵巢癌發(fā)現(xiàn)時(shí)大部分處于進(jìn)展期或者已發(fā)生轉(zhuǎn)移。近二十年來(lái)，在提高卵巢癌患者生存期方面沒(méi)有實(shí)質(zhì)的進(jìn)展，預(yù)后依然較差[5]。因此，闡明參與卵巢癌進(jìn)展的分子機(jī)制是臨床亟需解決的重要難題。

S100A10屬于S100家族成員之一，與其他20種已知的S100蛋白家族分子不同的是，S100A10一直處于活性狀態(tài)且對(duì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)不敏感[6-7]。S100A10在胞質(zhì)中可與Annexin A2相互作用形成異源復(fù)合體，從而使其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜。目前，研究表明S100A10在多種細(xì)胞類型中表達(dá)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞，它被認(rèn)為是癌基因，有多項(xiàng)研究探討S100A10表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系[8]。

癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)是癌癥進(jìn)展的主要原因之一，Ken Katono等報(bào)道S100A10在肺腺癌中高表達(dá)，且S100A10表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)。S100A10在球面鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，參與邊緣上皮細(xì)胞增殖和分化[9]。miR-590-5P過(guò)表達(dá)能夠有效降低S100A10的表達(dá)，從而抑制HepG2細(xì)胞增殖[10]。在本研究中，我們通過(guò)敲降SKOV-3和A2780細(xì)胞中S100A10的表達(dá)水平，以此檢測(cè)S100A10對(duì)SKOV-3和A2780細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A10敲降后，SKOV-3和A2780細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，且細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。這與目前在其他腫瘤中的研究結(jié)果相似，由此提示S100A10在卵巢癌中可能是癌基因。

CyclinD1、CDK2及CDK4是影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白分子，在細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期過(guò)程中起著非常重要的作用[11]。本研究在改變了S100A10表達(dá)的SKOV-3和A2780細(xì)胞中應(yīng)用了Western Blot法檢測(cè)了CyclinD1、CDK2及CDK4的表達(dá)水平，結(jié)果證明S100A10的表達(dá)與CyclinD1、CDK2及CDK4的表達(dá)水平一致，這與細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果相一致，同時(shí)也證明了S100A10在卵巢癌中是一個(gè)癌基因。

綜上所述，課題組通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)S100A10敲降抑制SKOV-3和A2780細(xì)胞增殖并阻滯SKOV-3細(xì)胞處于G0/G1期，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK2、CDK4及CyclinD1表達(dá)下調(diào)，從而抑制卵巢癌細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，使其無(wú)法啟動(dòng)有絲分裂，因此抑制了細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)初步揭示了S100A10表達(dá)水平對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖具有調(diào)節(jié)作用，為尋找卵巢癌臨床治療靶點(diǎn)提供了新思路。