冷應(yīng)激后民豬背脂中差異lncRNA的篩選與分析

馬駿杰，汪 亮，劉 娣，張冬杰*，楊秀芹*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150086)

低溫災(zāi)害是養(yǎng)殖生產(chǎn)中經(jīng)常會(huì)遇到的一種自然災(zāi)害，防范不及時(shí)會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。已有研究表明，哺乳動(dòng)物如果突然暴露在低溫環(huán)境下或長(zhǎng)時(shí)間處于低溫環(huán)境中均會(huì)增加凍傷或患低體溫癥的風(fēng)險(xiǎn)，損害認(rèn)知能力，并引發(fā)心血管死亡[1-3]。機(jī)體在應(yīng)對(duì)低溫傷害時(shí)，首先會(huì)啟用顫栗性產(chǎn)熱維持體溫恒定，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，將轉(zhuǎn)變?yōu)榉穷澙跣援a(chǎn)熱，即代謝產(chǎn)熱，這是一種通過提高組織代謝率來增加產(chǎn)熱的方式。非顫栗性產(chǎn)熱作用最強(qiáng)的組織是褐色脂肪組織，但在機(jī)體內(nèi)含量很少，機(jī)體主要以白色脂肪為主。隨著人們對(duì)脂肪研究的深入，發(fā)現(xiàn)白色脂肪在機(jī)體遭受冷應(yīng)激后也會(huì)發(fā)生褐色化，增加產(chǎn)熱[4]，脂肪組織是研究哺乳動(dòng)物冷應(yīng)激相關(guān)能量代謝的最佳模型[5]。脂肪組織受交感神經(jīng)系統(tǒng)控制，由酪氨酸羥化酶(TH)陽性兒茶酚胺能神經(jīng)元介導(dǎo)，這些神經(jīng)元從椎旁交感神經(jīng)節(jié)向脂肪組織傳導(dǎo)[6-7]。冷暴露刺激交感神經(jīng)釋放兒茶酚胺，兒茶酚胺激活脂肪細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中的腎上腺素能受體，引發(fā)脂解、白色脂肪褐變和適應(yīng)性產(chǎn)熱[8]。

豬與其他哺乳動(dòng)物間存在一個(gè)顯著的不同，即它的解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein, UCP1)基因，一個(gè)決定褐色脂肪細(xì)胞生成的關(guān)鍵基因，在進(jìn)化過程中因未知原因發(fā)生了突變，使其無法產(chǎn)生褐色脂肪[9]。有研究認(rèn)為,UCP1同家族的UCP3可在冷環(huán)境下替代UCP1發(fā)揮功能，促進(jìn)豬白色脂肪代謝產(chǎn)熱[10]。也有人將鼠的UCP1和豬的過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α, PGC-1α)共同過表達(dá)發(fā)現(xiàn)，可將豬的白色前體脂肪細(xì)胞褐色化[11]。民豬是生活在中國(guó)北方地區(qū)的一個(gè)地方豬種，脂肪含量高，具有明顯的耐寒性，在遭受同樣冷刺激的情況下，表型和生理變化都優(yōu)于大白豬[12]，是研究冷應(yīng)激下脂肪代謝的良好素材。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA) 屬于非編碼RNA的一種，在發(fā)育和基因表達(dá)中發(fā)揮著復(fù)雜而精確的調(diào)控功能。目前，人們對(duì)lncRNA的認(rèn)識(shí)還處在初級(jí)階段，起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，lncRNA可參與X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾以及核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。哺乳動(dòng)物基因組序列中4%～9%的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA(編碼蛋白R(shí)NA的比例是1%)。雖然關(guān)于lncRNA的研究進(jìn)展迅猛，但是絕大部分lncRNA的功能仍不清楚。

本研究擬以遭受24 h冷應(yīng)激后的民豬為試驗(yàn)材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析背脂內(nèi)lncRNA的表達(dá)變化情況，對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并開展聯(lián)合分析，探討民豬耐寒性強(qiáng)的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇6月齡雌性民豬6頭，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬養(yǎng)殖場(chǎng)提供。試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成兩組，一組置于正常舍內(nèi)飼養(yǎng)，設(shè)為對(duì)照組，樣品編號(hào)為MC1、MC2和MC3；另一組置于室外半敞篷舍內(nèi)飼養(yǎng)，設(shè)為試驗(yàn)組，樣品編號(hào)為ML1、ML2和ML3。對(duì)照組環(huán)境溫度控制在(18±2)℃，試驗(yàn)組環(huán)境溫度控制在(-18±5)℃，兩組飼喂相同的飼糧，均為自由采食、飲水。處理24 h后，屠宰，取背部皮下脂肪，置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 背部脂肪總RNA的提取與檢測(cè) 采用常規(guī)的Trizol法提取總RNA，每個(gè)個(gè)體提取1份，共6份樣品。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品是否有降解及雜質(zhì)，凱奧K5500分光光度計(jì)檢測(cè)樣品純度，安捷倫2100 RNA Nano 6000 試劑盒檢測(cè)RNA樣品的完整性和濃度。

1.2.2 lncRNA文庫的構(gòu)建及測(cè)序 每個(gè)樣品取3 μg總RNA作為起始量構(gòu)建lncRNA文庫。使用Ribo-ZeroTMMagnetic Gold試劑盒去除rRNA，向反應(yīng)體系中加入碎片化緩沖液(fragmentation buffer)使RNA成為短片段，再以片段后的RNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA Polymerase I 合成cDNA第二鏈。使用QiaQuick PCR試劑盒純化合成的cDNA，經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測(cè)序接頭后，再次回收目的片段。加入U(xiǎn)NG酶消化cDNA 第二鏈，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和回收純化。最后用構(gòu)建好的文庫進(jìn)行Illumina測(cè)序。

1.2.3 民豬背脂內(nèi)受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的lncRNA的篩選與分析 本研究中l(wèi)ncRNA的基本篩選條件：1)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于等于200 bp，外顯子個(gè)數(shù)大于等于2；2)計(jì)算每條轉(zhuǎn)錄本的reads覆蓋度，篩去所有樣本中均小于5的轉(zhuǎn)錄本；3)利用gffcompare同豬的基因組注釋文件進(jìn)行比較，篩除已知的mRNA及其他非編碼RNA(rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA等)；4)根據(jù)比較結(jié)果中的class_code信息(如果class_code="u",則表明是lincRNA；如果class_code="i",則表明是intronic lncRNA；如果class_code="x"，則表明是anti-sense lncRNA)篩選潛在的各類lncRNAs。篩選完成后，同時(shí)使用4個(gè)編碼潛能分析軟件CNCI、CPC、PFAM和CPAT判斷所篩選出的lncRNA是否具有編碼潛能。

采用DEseq軟件包進(jìn)行差異表達(dá)分析，選取|log2Ratio|≥1和q<0.05的基因作為顯著差異表達(dá)篩選條件，得到上、下調(diào)基因個(gè)數(shù)。利用R軟件(版本號(hào)：V3.1.1)對(duì)不同樣本中差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行層次聚類分析，利用NCBI、Uniprot、GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋，獲得差異表達(dá)基因詳細(xì)描述信息。利用Ensembl、NCBI、GENCODE和HGCN等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行l(wèi)ncRNA的注釋。

1.2.5 民豬背脂內(nèi)受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的差異表達(dá)mRNA 的GO功能分析及KEGG通路分析 利用豬的GO注釋數(shù)據(jù)庫直接進(jìn)行GO分析。統(tǒng)計(jì)GO數(shù)據(jù)庫中第三層條目中差異表達(dá)基因(區(qū)分上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá))在該條目里的個(gè)數(shù)，并計(jì)算百分比。對(duì)KEGG中每個(gè)Pathway應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，找出差異表達(dá)基因顯著性富集的Pathway。

1.2.6 民豬背脂內(nèi)受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的lncRNA與mRNA的聯(lián)合分析 對(duì)lncRNA和mRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)、表達(dá)量和組織特異性的比較分析。對(duì)差異表達(dá)的lncRNA的靶基因開展cis和trans兩種方式的靶標(biāo)預(yù)測(cè)，通過靶基因間接預(yù)測(cè)其功能。將lncRNA 相鄰位置(上、下游50 kb)的蛋白編碼基因篩選出來作為以cis方式作用的靶基因，根據(jù)lncRNA 同mRNA表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)(相關(guān)系數(shù)corr≥0.9)篩選以trans方式作用的靶基因。對(duì)差異lncRNA的靶基因進(jìn)行功能富集分析，分析方法同差異mRNA的分析。根據(jù)識(shí)別出的靶基因，利用Cytoscape軟件繪制lncRNA-mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.7 民豬背脂內(nèi)受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的差異lncRNA的qPCR驗(yàn)證 利用Roche實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀LightCycler480Ⅱ?qū)υ囼?yàn)組顯著高表達(dá)的10個(gè)lncRNAs進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，引物信息見表1。反應(yīng)體系：cDNA樣品0.5 μL，2×SYBR Green PCR Mixture 10 μL，特異性上、下游引物各0.5 μL，滅菌水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各模板中目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因β-actin的表達(dá)量。

表1 qPCR檢測(cè)用引物序列

2 結(jié) 果

2.1 冷應(yīng)激下民豬背脂的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

為了全面分析民豬在遭受冷應(yīng)激后背脂中表達(dá)發(fā)生變化的lncRNA，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組共計(jì)6個(gè)個(gè)體的RNA開展了全轉(zhuǎn)錄組去rRNA測(cè)序。每個(gè)樣品平均獲得87.5百萬個(gè)raw reads，質(zhì)量控制后獲得約83.0百萬個(gè)clean reads。與豬的參考基因組序列(Sus scrofa 11.1)比對(duì)，平均94.4%的clean reads可以比對(duì)到基因組上，大約有75.7百萬個(gè)reads可比對(duì)到唯一位置。通過轉(zhuǎn)錄本的富集和重建總計(jì)獲得了24 305個(gè)轉(zhuǎn)錄本(FPKM≥0.01)，包括18 772個(gè)已知的轉(zhuǎn)錄本。

2.2 民豬背脂內(nèi) lncRNA的篩選與鑒定

是否具有編碼潛能為判斷新轉(zhuǎn)錄本是否為lncRNA 的關(guān)鍵條件，將CNCI、CPC、PFAM和CPAT軟件篩選出的lncRNA的交集作為后續(xù)分析的數(shù)據(jù)集，共計(jì)7 856個(gè)(圖1)。將本研究所獲得的lncRNA與mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度、外顯子個(gè)數(shù)、組織特異性以及表達(dá)量的對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA和mRNA的長(zhǎng)度都集中在2 900 bp左右，整體趨勢(shì)一致(圖2A)。主要的lncRNA有2個(gè)外顯子(最多可達(dá)31個(gè)外顯子，平均是2.99個(gè))，顯著低于編碼蛋白基因(最高可達(dá)118個(gè)外顯子，平均為9.64個(gè))[14](圖2B)。與mRNA相比，lncRNA表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的組織特異性(圖2C)。同等條件下，mRNA的表達(dá)水平要相對(duì)高于lncRNA(圖2D)。 這與以往在豬、鼠和人上的研究結(jié)果一致[15-17]。

2.3 受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的lncRNA和mRNA的篩選與分析

利用FPKM值定量估計(jì)基因表達(dá)值，以對(duì)照組為參照，篩選出受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的166個(gè)lncRNAs，其中上調(diào)表達(dá)的78個(gè)，下調(diào)表達(dá)的88個(gè)。但僅有2個(gè)下調(diào)表達(dá)的為已知lncRNAs，其余全部為新發(fā)現(xiàn)的lncRNAs。269個(gè)mRNAs發(fā)生了顯著變化，其中上調(diào)表達(dá)的141個(gè)，下調(diào)表達(dá)的128個(gè)。顯著上調(diào)表達(dá)基因中，雙孔K+通道蛋白(KCNK3)變化倍數(shù)最大，為7.49倍，其次是激酶非催化C-葉結(jié)構(gòu)域蛋白(KNDC1)和減數(shù)分裂特異性端粒結(jié)合蛋白(TERB1)，分別達(dá)到了5.92倍和5.44倍。顯著下調(diào)表達(dá)基因中，果糖二磷酸醛縮酶B(ALDOB)變化倍數(shù)最大，為6.24倍，其次是Slit引導(dǎo)配體1(SLIT1)和微管相關(guān)蛋白6(MAP6)，分別下調(diào)了5.98倍和5.20倍。

聚類分析往往用于反映不同試驗(yàn)條件下樣本差異表達(dá)RNA的變化模式，可以很直觀反映出不同條件下RNA的表達(dá)量變化情況。利用R軟件(v3.1.1)對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組間差異表達(dá)的RNA進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果見圖3，表達(dá)量的變化用顏色的變化表示，藍(lán)色表示表達(dá)量較低，黃色表示表達(dá)量較高。由聚類圖可知，組內(nèi)個(gè)體間表達(dá)模式基本一致，說明重復(fù)性較好，但組間差異較大，尤其是lncRNA 變化明顯，說明冷應(yīng)激對(duì)lncRNA的影響較大。

2.4 差異表達(dá)基因的GO注釋與KEGG通路分析

GO富集分析結(jié)果表明，153個(gè)基因被富集到生物過程(BP)，7個(gè)基因被富集到分子功能(MF)，細(xì)胞組分(CC)中無顯著富集的基因。在生物過程里，57個(gè)條目被顯著富集，很多基因被富集到防御反應(yīng)、對(duì)生物刺激的反應(yīng)以及病毒的反應(yīng)等條目下(圖4)。在分子功能里只有“雙鏈RNA結(jié)合”條目被富集。

KEGG通路富集分析表明，269個(gè)基因富集到156個(gè)信號(hào)通路中，但均未達(dá)到顯著富集的程度。按照q值大小，排在前5位的信號(hào)通路分別是PPAR信號(hào)通路、視黃醇代謝通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路、果糖和甘露糖的新陳代謝通路和糖酵解/糖異生通路，這5個(gè)通路基本都與脂類和糖類代謝相關(guān)。

2.5 受冷應(yīng)激誘導(dǎo)lncRNA的靶基因預(yù)測(cè)與功能分析

通過相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，208個(gè)差異表達(dá)的mRNAs與144個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs共表達(dá)，其中193個(gè)靶基因預(yù)測(cè)為受lncRNA的反式調(diào)控(trans)，僅有15個(gè)靶基因預(yù)測(cè)為順式調(diào)控(cis)。對(duì)這208個(gè)靶基因開展GO功能分析和KEGG通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MF分類下富集6個(gè)條目，分別是poly(A)RNA結(jié)合、RNA結(jié)合、SMAD結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合和核酸結(jié)合；CC分類下富集27個(gè)條目，排在前5位的是細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)部分、膜結(jié)合細(xì)胞器、核斑點(diǎn)、核質(zhì)部分；BP分類下富集52個(gè)條目，排在前5位的是RNA加工、mRNA加工、RNA剪接、細(xì)胞代謝過程和初級(jí)代謝過程。KEGG通路分析中，顯著富集的通路有2個(gè)，分別是真核生物的核糖體生物發(fā)生(ribosome biogenesis in eukaryotes)和基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma)。

2.6 受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的lncRNA與關(guān)鍵靶基因的信號(hào)通路

利用Cytoscape軟件繪制的lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)表明，47個(gè)lncRNAs處于網(wǎng)絡(luò)的中心，調(diào)控114個(gè)基因(圖5)，1個(gè)lncRNA可同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因，如MSTRG.90687可同時(shí)調(diào)控UCP3、TTC39A、SLC37A4、KLF11、ADAMTS18和PLIN5；多個(gè)lncRNAs也可同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因，這些lncRNA和基因可能在機(jī)體應(yīng)對(duì)冷應(yīng)激方面起到關(guān)鍵作用。

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確度，隨機(jī)選擇10個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行 qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，qPCR定量檢測(cè)值與測(cè)序值相比，變化趨勢(shì)基本一致(圖6)，表明測(cè)序結(jié)果可信。

3 討 論

lncRNA一般指不具有蛋白編碼能力，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子，與細(xì)胞周期和分化、發(fā)育、生殖、性別調(diào)控、衰老以及多種人類疾病密切相關(guān)。其在白色脂肪沉積及褐色脂肪代謝產(chǎn)熱方面均起著重要的調(diào)控作用[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激下lncRNA uc.417的表達(dá)顯著下調(diào)，可解除對(duì)p38-MAPK信號(hào)通路磷酸化水平的抑制，促進(jìn)線粒體產(chǎn)熱基因的表達(dá)和氧化呼吸[20]，AK079912和GM13133的表達(dá)水平顯著上調(diào)，促進(jìn)白色脂肪棕色化[21]。由此可見，冷應(yīng)激下，不同lncRNA行使著不同的生物學(xué)功能。

本研究以冷應(yīng)激下民豬的背部脂肪為試驗(yàn)材料，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)lncRNAs的表達(dá)變化情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激后上調(diào)表達(dá)的lncRNA數(shù)量(78個(gè))略低于下調(diào)表達(dá)的lncRNA數(shù)量(88個(gè))，但mRNA上調(diào)表達(dá)的數(shù)量(141個(gè))略高于下調(diào)表達(dá)的數(shù)量(128個(gè))，兩者的變化趨勢(shì)并不完全一致。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，多個(gè)干擾素刺激基因(ISGs)，如RSAD2、ISG20、ISG15、MEGF6、DDX60、MX2、MX1和IFI6等均發(fā)生了顯著上調(diào)，它們?cè)谒拗骺共《痉烙^程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22]。此外，還有與病毒感染、血液中免疫細(xì)胞的數(shù)量和分布相關(guān)的DHX58[23]，與先天免疫應(yīng)答相關(guān)的PTX3[24]和抗豬瘟病毒的OASL基因[25]的轉(zhuǎn)錄水平也出現(xiàn)了顯著上升。前人在急性冷暴露的大鼠白色脂肪細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與免疫相關(guān)的基因受到誘導(dǎo)[26]，表明冷刺激誘發(fā)了機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)。GO注釋結(jié)果也提示，民豬在遭受冷應(yīng)激24 h后，并沒有馬上啟動(dòng)非顫栗性產(chǎn)熱過程，而是先啟動(dòng)了機(jī)體的防御和免疫應(yīng)答反應(yīng)，抵抗冷刺激的同時(shí)，提升機(jī)體免疫力。

機(jī)體在遭受冷刺激后，會(huì)發(fā)生局部血液循環(huán)不暢，組織缺血缺氧，甚至發(fā)生壞死。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，大白豬在遭受重度冷應(yīng)激后，其耳組織和體表會(huì)發(fā)生紅腫與壞死。本研究同樣篩選到多個(gè)與呼吸、氧化應(yīng)激和血液循環(huán)相關(guān)的基因。如差異倍數(shù)最大的KCNK3基因(log2fold change=7.49)，該基因功能喪失是肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的關(guān)鍵所在[27]。CCDC38基因在支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)，與一秒率(FEV1/FVC，第一秒用力呼氣量占所有呼氣量的比例)相關(guān)[28]。GAS2L2的變異會(huì)導(dǎo)致纖毛不動(dòng)綜合征，明顯特征為呼吸道反復(fù)感染[29]。與氧化應(yīng)激相關(guān)的KNDC1和LIPG[30-31]，與血管生成相關(guān)的C1QL3和與造血相關(guān)的ETV7均發(fā)生了顯著上調(diào)[32-33]。但是，與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的多個(gè)基因則發(fā)生了顯著下調(diào)，如誘導(dǎo)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的重要導(dǎo)向分子Slit1[34]，誘導(dǎo)神經(jīng)元微管卷曲的腔內(nèi)蛋白MAP6[35]，與阿爾茲海默癥相關(guān)的TREM2[36]，與突觸可塑性相關(guān)的Irfn2[37]等。促進(jìn)細(xì)胞增殖的DUSP4、HK2和S100A4也發(fā)生了顯著下調(diào)。

與糖代謝相關(guān)的基因，如調(diào)節(jié)糖異生過程的限速酶PCK1[38]和對(duì)葡萄糖消耗和脂肪酸轉(zhuǎn)換起重要作用的PDK4[39]發(fā)生上調(diào)，但介導(dǎo)果糖代謝的ALDOB則發(fā)生下調(diào)。與脂類代謝相關(guān)的基因，僅發(fā)現(xiàn)了ANGPTL4、KLF11、NUPR1、HERC5等發(fā)生了上調(diào)，差異倍數(shù)在2～3倍之間，但脂解和白色脂肪褐色化的一些標(biāo)志基因并未檢測(cè)到顯著變化。促進(jìn)脂肪代謝的UCP3上調(diào)了1.26倍，但調(diào)節(jié)脂肪儲(chǔ)存、加快新陳代謝的Leptin卻下降了3.2倍?？梢姡浯碳さ拇_改變了民豬皮下脂肪的代謝，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究通過對(duì)lncRNA和mRNA的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，僅有7%的靶基因受lncRNA的順式調(diào)控，更多的靶基因是受lncRNA反式調(diào)控，這與Zhan等[40]在對(duì)山羊發(fā)育過程中骨骼肌lncRNA靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致(6.8%)。據(jù)此推測(cè)，lncRNA與靶基因間更多的是反式作用調(diào)控。lncRNA與mRNA構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，既存在1個(gè)mRNA可以結(jié)合多個(gè)lncRNAs，也存在1個(gè)lncRNA可以與多個(gè)mRNAs發(fā)生作用，導(dǎo)致它們彼此之間的作用關(guān)系非常復(fù)雜。以lncRNA MSTRG.90687為例，它可以同時(shí)與6個(gè)基因發(fā)生作用，包括與脂肪代謝相關(guān)的UCP3、KLF11和PLIN5，與繁殖相關(guān)的TTC39A、ADAMTS18，與糖原代謝病相關(guān)的SLC37A4。而與脂肪代謝相關(guān)的Leptin基因也可同時(shí)與6個(gè)不同的lncRNAs (MSTRG.79145、MSTRG.109887、MSTRG.157809、MSTRG.27578、MSTRG.29107和MSTRG.67063)結(jié)合。本研究所篩選的多為新發(fā)現(xiàn)的lncRNAs，哪些lncRNAs 在冷應(yīng)激下發(fā)揮脂肪代謝調(diào)控作用，還需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

冷應(yīng)激會(huì)造成民豬皮下脂肪內(nèi)lncRNA與mRNA表達(dá)水平的變化，對(duì)機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)、呼吸、氧化應(yīng)激、血液循環(huán)和神經(jīng)系統(tǒng)的敏感性等生理過程造成影響，使脂類代謝發(fā)生改變。受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的lncRNA與靶基因之間存在復(fù)雜的互作關(guān)系。