抗球蟲藥物殘留的免疫檢測技術

陳瑩嫻，馬月姣，李建成

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

抗球蟲藥物常作為飼料添加劑使用，飼料污染的情況時有發(fā)生[6]。這可能會對非目標動物造成毒性作用，并可能導致食物中含有藥物殘留，在食用抗球蟲藥物殘留的食品后，雖然未觀察到對人體產(chǎn)生急性毒性，但長期暴露于低濃度水平的藥物殘留，人體內(nèi)可能發(fā)生慢性毒性作用[7-8]。因此，許多國家對動物使用該類藥物以及在動物源食品中的殘留情況進行了嚴格監(jiān)控。包括中國(表1)和歐盟[7]在內(nèi)多個國家或組織制定了相關法規(guī)，規(guī)定雞組織中抗球蟲藥物的最高殘留限量(MRLs)。

目前，對抗球蟲藥物的檢測方法主要有色譜(串聯(lián)質譜)檢測法[9-12]，以及免疫分析檢測法。免疫檢測法是基于抗原-抗體相結合的原理，采用不同的信號放大系統(tǒng)對待測物進行定性和定量。抗體的制備是決定檢測技術靈敏度的關鍵因素。免疫分析方法具有開發(fā)簡便、成本低、操作簡單、能夠快速檢測的優(yōu)點，可實現(xiàn)高通量快速篩選，在畜禽養(yǎng)殖場中廣泛應用[13-14]。但其無法達到對多種殘留藥物的同時定量檢測。一個成功的免疫檢測法必須要具備3個要素：性能優(yōu)良的抗體、靈敏且專一的標記物和高效的分離手段。傳統(tǒng)的單克隆抗體制備過程繁瑣，成為免疫分析方法的限制因素之一。

1 酶聯(lián)免疫吸附分析方法

酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是將抗原或抗體結合到固相載體表面，加入待檢測的樣品溶液以及某種酶標記的抗體或抗原，使其與固相載體上的抗體或抗原反應。再通過洗滌去除抗原-抗體復合物以外的物質。加入酶反應底物顯色，結合在固相載體上的酶量與樣品中待測物的量成一定比例[15-17]。該方法可用于診斷疾病和檢測小分子化合物[18]。其原理如圖1A所示。Tian等[19]描述了一種基于免疫磁珠(IMB)凈化的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(icELISA)，檢測雞肉和雞肝中鹽霉素的殘留。將單克隆抗體固定在羧化微球(直徑2.8 μm)的表面上，樣品經(jīng)簡單提取后，待測物被抗體特異性吸附，通過磁分離去除上清，保留在磁珠上的待測物隨后被洗脫釋放。與傳統(tǒng)的親水親脂平衡柱(HLB柱)凈化的icELISA方法相比，該方法的抑制率和靈敏度都有所提高，并且磁珠可重復使用。Li等[20]描述了基于單克隆抗體的icELISA方法，檢測可食用雞組織(肌肉、腎、肝、皮膚和脂肪)中的莫能菌素殘留。該方法與高效液相色譜串聯(lián)質譜法(HPLC-MS)相比，樣品檢測結果成正相關。這些結果表明，作者制備的單克隆抗體和開發(fā)的檢測方法是檢測雞組織中馬杜霉素的有用工具。Li等[21]制備了乙氧酰胺苯甲酯的單克隆抗體，建立icELISA方法檢測雞肌肉和肝中藥物殘留，該方法的IC50為0.66 ng·mL-1，對已發(fā)表的方法提供了一種節(jié)省成本的替代方法。Zhang等[22]使用新型抗體開發(fā)一步式icELISA法，可快速、特異性地檢測動物源食品中地克珠利殘留。Song等[23]建立了基于磁珠凈化的icELISA檢測方法，檢測雞組織中馬杜霉素的殘留量，并對磁珠的性能進行了評估。結果表明，免疫磁珠可以快速、穩(wěn)定地凈化樣品，并且基于免疫磁珠的ELISA檢測方法更簡便、省時且環(huán)保，可廣泛應用于雞組織中馬杜霉素的殘留檢測。ELISA在檢測抗球蟲藥物殘留的應用見表2。

2 免疫層析法

免疫層析法(immunochromatography, ICA)是一種快速有效的檢測方法，該方法大大縮短了整個分析時間,已應用于多個檢測領域，可在非實驗室環(huán)境下操作[24]。與其他較復雜的分析方法相比，該方法的靈敏度較低[25]。免疫層析分析方法結合了特異性抗體、膠體顆粒(金、乳膠、碳等)和層析膜(硝化纖維素膜)。其原理如圖1B所示，采用免疫標記技術將膠體顆粒直接或間接地與特異性抗體結合，標記抗體涂抹在層析膜上，層析膜一端浸潤樣品溶液，通過層析作用與抗體特異性結合。測試結果可根據(jù)T線(test line)和C線(control line)的顯色程度在幾分鐘內(nèi)通過目測或儀器測量確定[26]。

表1 中國規(guī)定可食用動物組織中抗球蟲藥的MRLs

表2 ELISA法檢測抗球蟲藥物殘留的應用

最常見的方法是將單克隆抗體與膠體金(colloidal gold, CG)偶聯(lián)制備免疫層析試紙條，檢測樣品溶液中藥物的殘留[27-34]。膠體金具有制備穩(wěn)定、摩爾消光系數(shù)高、顏色明顯的特點[35-36]。膠體金免疫層析試紙條制備簡便，使用方便，不需配備昂貴的設備和專業(yè)的技術人員，因此，能夠在畜牧養(yǎng)殖場中廣泛應用。Fitzgerald等[37]建立了多殘留檢測的測流免疫分析方法，通過化學偶聯(lián)法在特異性抗體上連接有色的羧化微球，可同時檢測雞蛋中常山酮、妥曲珠利和地克珠利3種藥物的殘留。采用像素分析的方式，通過測量檢測區(qū)域帶的像素強度，將該方法從一步定性轉變?yōu)榭闪炕治?，簡單且?jīng)濟高效，為將來更有效地同時監(jiān)測小分子藥物鋪平了道路。免疫層析法在檢測抗球蟲藥物殘留的應用見表3。

表3 免疫層析法檢測抗球蟲藥物殘留的應用

3 熒光偏振免疫分析法和時間分辨熒光免疫測定法

熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)原理(圖1C)是熒光標記抗原與特異性抗體結合形成大分子復合物后，使熒光素的熒光偏振信號強度增強，當目標待測物存在時，待測物與抗原競爭性結合特異性抗體，使熒光偏振值減小[38-39]。此反應是均相反應，減少了多次洗滌的步驟和反應時間，并且不受溶液顏色和儀器靈敏度變化的影響[40]。該方法常用來檢測小分子化合物在樣品中的含量[41]，并且可用于現(xiàn)場檢測[42]。

Wang等[43]建立并優(yōu)化了用特異性多克隆抗血清檢測雞組織(脂肪和肌肉)和雞蛋中馬度米星的熒光偏振免疫分析法(FPIA)。采用N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法合成熒光標記物來標記馬度米星(示蹤劑)，并用薄層色譜法(TLC)純化。該方法的IC50值比最敏感的ELISA方法低4倍。同一團隊開發(fā)并優(yōu)化了測定緩沖液中鹽霉素的FPIA，表明所用的抗鹽霉素單克隆抗體與其他藥物無明顯交叉反應，與甲基鹽霉素的交叉反應率為67.6%，并預測該分析方法可用于食品樣品篩選，但還未證實[44]。

時間分辨熒光免疫測定法(time-resolved fluoroimmunoassay, TrFIA)是利用鑭系絡合物,如銪(Eu)、鋱(Tb)、釤(Sm)和鏑(Dy)的三價稀土離子及其螯合物作為標記物的免疫分析技術[45]，鑭系絡合物很穩(wěn)定，具有熒光壽命長、stokes位移大、馳豫時間長且能夠克服背景吸收的優(yōu)勢[46]。TrFIA旨在降低非特異性背景熒光的干擾，解決放射性同位素使用時的問題,使設計超靈敏的生物分析方法成為可能性[46-48]，具有安全、費用低、操作簡便、可實現(xiàn)床旁快速檢測的優(yōu)勢[49-50]。

Peippo等[51]建立了快速TrFIA檢測法，用于篩選家禽肌肉和雞蛋樣品中是否存在甲基鹽霉素和鹽霉素，由于甲基鹽霉素與鹽霉素具有100%的交叉反應，所以Peippo等僅評估了甲基鹽霉素的檢測性能。此方法的一個缺點是需要對肌肉樣品使用SPE柱進行額外的固相萃取的純化步驟。以此為基礎，Peippo等[52]對前處理方法進行進一步優(yōu)化，建立了家禽血液和肌肉中甲基鹽霉素的TrFIA檢測法以及進行血液中的動力學研究。Hagren等[53]將時間分辨熒光測定法與新型的一體化干燥化學概念相結合來進行進一步創(chuàng)新，檢測雞肝和雞蛋中尼卡巴嗪的殘留量。將抗尼卡巴嗪的特異性抗體固定在單個微量滴定孔中，并用絕緣層覆蓋。樣品提取液自動加入干燥的微量滴定孔中，結果可在18 min內(nèi)獲得。該方法快速、簡單，可用作高通量篩選方法。Godoy-Navajas等[54]描述了一種新型的熒光測定技術并運用了新的替代標簽檢測牛奶中的莫能菌素，示蹤劑由功能化納米顆粒與抗體組成。使用納米顆粒進行長波長熒光測量，可以提供光譜選擇性從而避免樣品基質的干擾。實踐證明，該方法具有自動化程度高、樣品和試劑體積小等優(yōu)點。

相關方法的總結見表4。

表4 FPIA和TrFIA法在檢測抗球蟲藥物殘留中的應用

4 生物傳感器

生物傳感器(biosensor)是一種將生物識別元件(酶[55-56]、抗體[57]、抗原、細胞、核酸等)、理化換能器和信號放大裝置緊密結合的儀器[58](圖1D)。生物傳感器的特點是生物分子之間的特異性結合，例如抗原與抗體，底物與酶，受體與其特異性配體，為了檢測這些生物分子之間的相互作用，生物傳感器使用感測裝置或換能器將生物信號轉換成電信號，該電信號由處理器放大、存儲和量化[59]。對于獸藥殘留檢測，最常用的生物元素是抗體-抗原親和對，在這種情況下，生物傳感器稱為免疫傳感器[60]。Huet等[61]詳細地描述了用不同類型的生物傳感器檢測和定量抗微生物化合物。

抗球蟲藥物的免疫傳感器檢測方法報道較少。McCarney等[62]用表面等離子體共振(SPR)生物傳感器檢測雞肝和雞蛋中尼卡巴嗪的殘留量。他們使用DNC(尼卡巴嗪的組成成分之一)的結構模擬物在兔中產(chǎn)生抗血清，并將同一化合物的另一種模擬物固定在CM5傳感器芯片上?？梢詸z測到抗體與芯片表面結合，當有DNC時結合被抑制。芯片表面是使用堿和有機溶劑的組合再生的，并且在數(shù)百次進樣中非常穩(wěn)定。一個分析周期(樣品進樣、芯片再生和系統(tǒng)清洗)需要7 min就能完成。同時，他們介紹了生物傳感器技術與LC-MS的對比研究結果。兩種方法對于DNC含量的測定顯示出良好的一致性，該方法可快速去除陰性樣品，確認陽性樣品，而LC-MS分析所需的時間更長。該程序具有良好的選擇性和靈敏度，可檢測出遠低于既定的MRL或差動限制(differential action limit, DAL)水平的家禽肝和雞蛋中的尼卡巴嗪殘留標記物DNC。Hu 等[63]首次開發(fā)了一種基于AuNPs/Zn/Ni-ZIF-8-800 @石墨烯復合材料的高效、靈敏的電化學免疫傳感器，用于檢測牛奶中的莫能菌素。AuNP具有良好的兼容性，可用于固定抗莫能菌素的單克隆抗體，并起到放大信號的作用。這種新型的信號放大免疫傳感器檢測方法具有高靈敏度和優(yōu)異的選擇性，與其他藥物無明顯的交叉反應，但該方法并沒有應用到實際樣本的檢測。詳見表5。

表5 生物傳感器分析技術檢測抗球蟲藥物殘留的應用

5 小結與展望

抗球蟲藥物的種類繁多，且養(yǎng)殖場中常作為飼料添加劑使用，長期食用含有低劑量抗球蟲藥的動物性食品會危害人類的健康，建立靈敏度高、成本低、操作簡便、可同時檢測的快速檢測方法成為發(fā)展趨勢?？骨蛳x藥物的樣品前處理過程一般選用乙腈或甲醇進行液-液萃取。免疫檢測方法操作簡便，方法設計較為靈活，通過不同的信號放大系統(tǒng)，如熒光信號，能量變化，分子量大小的改變，這些都能使儀器檢測到藥物信號從而對樣品進行快速的高通量篩選。如今適用性高，應用廣泛的免疫檢測技術為傳統(tǒng)的ELISA檢測方法和試紙條。對于需要進行生物信號轉換的免疫檢測方法，其靈敏度以及選擇性高于傳統(tǒng)的檢測方法，但在實際樣品檢測過程中有一定的限制，并且很少能夠廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖場中。目前，各種免疫檢測技術都要依賴于抗體的特性，性能優(yōu)異的抗體對免疫檢測技術的效果起到了關鍵性作用，而如今同時檢測多種抗球蟲藥物殘留的快速檢測方法報道較少。因此，可以將以下幾個方面作為研究重點：1)建立非均相體系的免疫檢測方法，實現(xiàn)多殘留檢測。2)通過基因重組技術設計可識別多種藥物的抗體。3)設計半抗原并合成抗原，以得到特異性強、靈敏度高的抗體。