檢測(cè)miR-141和KLF9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平及對(duì)細(xì)胞的增殖和侵襲的影響

馬玲 李海明 翟展藝 趙沖 李寧寧 年立全

肺癌是最常見的呼吸道惡性腫瘤，分為小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%[1-2]。盡管治療NSCLC的臨床試驗(yàn)有所進(jìn)展，但結(jié)果仍然不盡人意，患者的5年存活率僅有15%[3]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是導(dǎo)致NSCLC治療失敗的重要因素之一，研究涉及NSCLC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，對(duì)于新型有效的抗NSCLC治療至關(guān)重要[4]。miRNA是一類短的非編碼RNA，是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，通過結(jié)合靶基因的mRNA 3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)影響多種生物學(xué)功能。許多研究顯示，miRNA參與腫瘤進(jìn)展，例如增殖、侵襲和細(xì)胞凋亡。MiR-141是miR-200家族中的一員，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)包括食管癌的鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌和乳腺癌[5-7]。KLF9是SP/KLF家族中的轉(zhuǎn)錄因子，通過與啟動(dòng)子上的GC盒元件結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在多種腫瘤中異常表達(dá)并對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有一定影響[8-9]。生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)，KLF9基因的3′UTR處可能存在miR-141結(jié)合位點(diǎn)，這表明miR-141與KLF9之間存在密切的關(guān)系。因此，本文我們研究miR-141與KLF9在NSCLC中的表達(dá)水平，二者之間存在的關(guān)系，及對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲的影響，對(duì)NSCLC的靶向治療提供一定理論依據(jù)。

資料與方法

一、 研究對(duì)象

收集2017年5月-2019年5月在我院接受手術(shù)治療的62例NSCLC患者，男性45例，女性17例，年齡(56.9±9.2)歲。患者術(shù)前均為未接受化療或其他的手術(shù)治療，收集患者的腫瘤組織及癌旁組織(距離腫瘤組織≥5cm)。排除合并其他腫瘤、支氣管炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等肺部相關(guān)疾病的患者。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者同意并簽署知情同意書。

二、 實(shí)驗(yàn)材料

NSCLC細(xì)胞H160、H460、H1299及正常人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、結(jié)晶紫粉末、多聚甲醛、MTT粉末等購(gòu)于北京鼎國(guó)有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司；對(duì)照質(zhì)粒和KLF9質(zhì)粒由北京華大基因合成；小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。

三、 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

收集組織和細(xì)胞樣品，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取組織和細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以管家基因GAPDH的mRNA水平作為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì)如下： miR-141上游引物序列5′-CACATCCACCTCCTCCACATC-3′,下游引物序列5′-AA TGCGGCCGCAACTCAATCAACATCACCAT-3′， KLF9引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA TACT-3′,下游引物序列5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ 。GAPDH上游引物序列5′-AGAAGGCTGGGG CTCATTTG -3′,下游引物序列5′-AGGGGCCATCCACAG TCTTC-3′。采用ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

四、 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

以健康人DNA為模板，PCR擴(kuò)增miR-141與KLF9結(jié)合區(qū)域WT-3′-UTR和KLF9-MUT-3′-UTR的DNA片段，將PCR產(chǎn)物分別與pMIR-REPORT luciferase報(bào)告載體分別用SpeⅠ和 Hind Ⅲ雙酶切后純化、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，獲得KLF9的含WT-3′-UTR以及MUT-3′-UTR螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將其分別與miR-141 mimic共轉(zhuǎn)染H160細(xì)胞48h，使用Pro-mega公司雙螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒按說(shuō)明書在單光子檢測(cè)儀中檢測(cè)細(xì)胞螢光素酶活性。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值(R/F)。

五、 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密增生長(zhǎng)到80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。H160細(xì)胞以104個(gè)/孔的密度接種于6孔細(xì)胞板，常規(guī)培養(yǎng)24h，細(xì)胞融合度約為70%時(shí)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒)、KLF9組(轉(zhuǎn)染KLF9質(zhì)粒)，按照脂質(zhì)體lipofeetamine 2000說(shuō)明書步驟操作，轉(zhuǎn)染6h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集各組細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

六、 MTT實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組和KLF9組細(xì)胞以每孔2×103的密度接種于96孔板中，接種后每12h檢測(cè)一次，每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)平行孔，20μL MTT溶液加入檢測(cè)孔中，放置恒溫箱中繼續(xù)孵育4h。然后去除上清，每孔加入150μL二甲基亞砜溶液，震蕩5min使細(xì)胞充分裂解，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處的吸光度值(OD)，OD值與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。

七、 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組和KLF9組細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮，以每孔5×103的密度接種于小室中，培養(yǎng)孔中加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放置恒溫箱中孵育48h。將小室取出放置多聚甲醛溶液中固定10min，然后置于0.1%結(jié)晶紫溶液中染色10min，用棉簽輕輕擦掉小室里面為發(fā)生侵襲的細(xì)胞，放置顯微鏡下拍照。

八、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、 miR-141和KLF9在NSCLC組織中的表達(dá)水平和相關(guān)性

miR-141在NSCLC組織中的表達(dá)水平為2.21±0.26，顯著高于癌旁組織中miR-141的表達(dá)水平1.04±0.27，t=24.720，P<0.001。KLF9在NSCLC組織中的表達(dá)水平0.56±0.14，低于癌旁組織KLF9的表達(dá)水平1.21±0.23,t=19.418，P<0.001。NSCLC組織中miR-141和KLF9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，r=-0.318,P=0.012(見圖1)。

二、 miR-141靶向結(jié)合KLF9

熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-141 mimic可減弱KLF9野生質(zhì)粒熒光素酶活性，結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-141 mimic對(duì)KLF9突變質(zhì)粒熒光素酶活性的抑制作用消失，miR-141可靶向結(jié)合KLF9(見圖2)。

三、 KLF9在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

NSCLC細(xì)胞H460、H1650、H1299中KLF9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平低于人正常支氣管上皮細(xì)胞(見圖3A)。KLF9和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H460細(xì)胞中經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)到KLF9組KLF9 mRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照組(見圖3B)。

圖1 miR-141和KLF9在NSCLC組織中的表達(dá)水平和相關(guān)性(A、B) ***表示NSCLC組與癌旁組織相比P<0.001

圖2 miR-141靶向結(jié)合KLF9(A)miR-141可靶向結(jié)合KLF9(B)miR-141 mimic可減弱KLF9野生質(zhì)粒熒光素酶活性 ***表示KLF9 WT+miR141 mimic與KLF9 WT組相比，t′=12.035，P<0.001.

圖3 miR-141在在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平

A:***表示H460、H1650、H1299與BEAS-2B細(xì)胞相比，t′=13.987、11.125、11.176，P均<0.001;B:***表示KLF9組與對(duì)照組相比，t=10.084，P<0.001.

四、 KLF9對(duì)H460細(xì)胞增殖和侵襲的影響

培養(yǎng)72h后KLF9組細(xì)胞OD值為0.80±0.07，顯著低于對(duì)照組細(xì)胞OD值1.56±0.06(t=6.041，P<0.001)(見圖4A)。細(xì)胞培養(yǎng)48h后KLF9組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)為45.2±5.3，明顯低于對(duì)照組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)72.5±6.8(t=4.965，P=0.008)(見圖4B)。

討 論

NSCLC占所有肺癌的85%，在全世界癌癥死亡率中位居第一，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是造成患者5年生存率較低的主要原因之一，miRNA通過調(diào)節(jié)多種癌基因或抑癌基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[10]。miRNA參與多種生物過程包括細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲、血管生成和DNA損傷修復(fù)等[11]。miR-141在鼻咽癌患者活檢組織中的表達(dá)水平上調(diào)，影 響腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因表達(dá)，可能為鼻咽癌患者的潛在生物標(biāo)記物[12]。然而，miR-141在胃癌和胰腺癌中的表達(dá)水平降低，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[13-14]。在本研究中，miR-141在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平上調(diào)，通過調(diào)節(jié)蛋白KLF9的表達(dá)影響細(xì)胞的增殖和侵襲。

圖4 KLF9對(duì)H460細(xì)胞增殖和侵襲的影響(×400)

KLFs是與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可控制細(xì)胞的基本生物過程，包括增殖、分化和遷移等。KLF6通過增加c-Jun降解抑制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)降低細(xì)胞增殖，從而在乳腺癌中起著抑癌作用[15]。KLF8作為肺腺癌的癌基因，與患者的不良預(yù)后相關(guān)[16]。KLF15同樣報(bào)道在肺腺癌中表達(dá)異常，與患者的腫瘤分期相關(guān)，為患者預(yù)后的潛在標(biāo)記物[17]。KLF11在乳腺癌中被甲基化，可能與其低表達(dá)和癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。KLF9與基因啟動(dòng)子區(qū)域中的轉(zhuǎn)錄元件GC盒特異性結(jié)合，與多種癌癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括子宮內(nèi)膜癌和其他女性生殖組織的內(nèi)分泌反應(yīng)性癌癥[19]。在乳腺癌患者中KLF9 mRNA表達(dá)水平顯著降低，參與細(xì)胞的遷移影響乳腺癌的發(fā)生和多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)途徑。在本研究中KLF9在NSCLC組織中的表達(dá)水平降低，其表達(dá)水平與miR-141的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)過熒光素酶基因報(bào)告結(jié)果顯示，miR-141可直接靶向結(jié)合KLF9。增加KLF9的表達(dá)水平后，NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯減弱。綜上所述，miR-141可靶向結(jié)合KLF9，增加KLF9的表達(dá)可減弱NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲。另外降低miR-141的表達(dá)后，miR-141對(duì)KLF9的靶向作用減弱，可增加KLF9的表達(dá)水平，同樣可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲，miR-141和KLF9均有望成為治療NSCLC有效靶點(diǎn)。