Xpert MTB/RIF對結核菌利福平耐藥的診斷價值及rpoB基因突變特點的分析

高春景 楊洋 闞宗衛(wèi) 成松 魏素梅 胡凱

目前，耐多藥結核病(Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和利福平耐藥結核病(Rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)仍然是全球結核病控制工作所面臨的嚴峻問題。據世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)估算，2018年全球新增約50萬利福平耐藥結核病病例，估算其中中國新增利福平耐藥結核6.6萬例，我國也是MDR-TB和RR-TB 30個高負擔國家之一，MDR-TB和RR-TB的疫情非常嚴重[1]，因此利福平(Rifampicin,RIF)耐藥的早期診斷尤其重要。Xpert MTB/RIF檢測是一種自動半巢式實時PCR系統(tǒng)，使用覆蓋rpoB基因RRDR核心區(qū)的五個重疊的分子信標探針來實現結核病和利福平耐藥的檢測，約2h可以得到結果[2]。2014年WHO推薦該技術用于多種結核病的診斷及利福平耐藥檢測[3]。本研究旨在分析Xpert MTB/RIF檢測對利福平耐藥的診斷價值及rpoB基因的突變特點，現匯報如下。

資料與方法

一、研究對象

回顧性納入2016年1月至2020年6月期間來院就診患者相同標本同時進行了結核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗和Xpert MTB/RIF檢測，且任一種方法檢出MTB。

二、研究方法

1.結核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗：采用改良羅氏培養(yǎng)基分枝桿菌培養(yǎng)并行菌種鑒定及比例法藥物敏感試驗(培養(yǎng)藥敏)，具體步驟按照《手冊》[4]進行。

2.Xpert MTB/RIF檢測：具體操作步驟按照Cepheid公司的Gene Xpert儀器說明書[5]進行。結果判讀：①5條探針結合的是野生型結核分枝桿菌，至少兩條探針結合到標本提取出的DNA上，就表示檢測到結核分枝桿菌，MTB這一項檢測結果就會報告陽性；②A-E探針有1條或者多條探針陰性，即該探針沒有結合到患者樣本DNA上進行擴增，則代表患者樣本中的結核分枝桿菌的探針相對應的rpoB基因片段有發(fā)生突變，阻止利福平對結核分枝桿菌起作用，即對利福平產生了耐藥結果；③當5條探針均結合到患者樣本DNA上，擴增，均為陽性時，代表MTB檢出，同時對利福平敏感。

3.治療史：根據中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS 196-2017[6]分為初治和復治。

4. 統(tǒng)計方法:根據SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析,計數資料采用率表示,組間采用χ2檢驗及Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；兩種檢驗方法的一致率=(觀察符合例數/觀察總例數)×100%；兩種檢驗方法的一致性采用Kappa檢驗。

結 果

一、收集2016年1月至2020年6月期間來院就診患者相同標本同時進行了培養(yǎng)藥敏和Xpert MTB/RIF檢測共7659例, Xpert MTB/RIF法檢出MTB 4236例，培養(yǎng)法檢出MTB 3752例；兩種方法檢測MTB的結果對比分析(見表1)。兩種方法同時檢出MTB共3621例：培養(yǎng)藥敏法檢出利福平耐藥238例，Xpert MTB/RIF法檢出利福平耐藥262例；兩種方法檢出利福平耐藥的結果對比分析(見表2)。

表1 Xpert MTB/RIF法與培養(yǎng)法檢測MTB結果的比較

通過配對χ2檢驗，兩種方法差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), Xpert MTB/RIF檢測的陽性檢出率高。

表2 Xpert MTB/RIF法與培養(yǎng)藥敏法利福平耐藥結果的比較

兩種檢驗方法的一致率為99.01%；采用Kappa 檢驗，K值=0.92，兩種方法的檢測結果完全符合，一致性很好。

二、Xpert法檢出利福平耐藥262例，其中男性190例，年齡16～83歲，中位數34.5歲；女性72例，年齡14～82歲，中位數28.5歲。其中有19例未發(fā)現A-E探針突變，但結果示利福平耐藥；243例發(fā)現探針突變，探針突變的發(fā)生率分別為E探針63.37%(154/243)、D探針20.16%(49/243)、B探針8.23%(20/243)、A探針4.53%(11/243)、C探針0.82%(2/243)、聯(lián)合探針突變2.88%(7/243)；7例聯(lián)合探針突變分別為BE、CE、AB、AD、ACE各1例及2例DE。Xpert法利福平耐藥探針突變與培養(yǎng)藥敏法利福平耐藥的結果對比分析(見表2)。

三、243例存在探針突變的RR-TB病例中，初治為65.02%(158/243)，復治為34.98%(85/243)；初治RR-TB病例中，探針突變的發(fā)生率分別為E探針61.39%(97/158)、D探針21.52%(34/158)、B探針8.23%(13/158)、A探針5.70%(9/158)、C探針0.63%(1/158)、聯(lián)合探針突變2.53%(4/158)；復治RR-TB病例中，探針突變的發(fā)生率分別為E探針67.06%(57/85)、D探針17.65%(15/85)、B探針8.24%(7/85)、A探針2.35%(2/85)、C探針1.18% (1/85)、聯(lián)合探針突變3.53%(3/85)；初治4例聯(lián)合探針突變分別為ACE、DE、BE、CE,復治3例聯(lián)合探針突變分別為AD、AB、DE；RR-TB不同探針突變特點與治療史的關聯(lián)性分析(見表3、4)。

表3 Xpert探針突變與培養(yǎng)藥敏法利福平耐藥結果的對比

以培養(yǎng)藥敏結果為利福平耐藥的金標準，兩組比較，χ2=34.26，P<0.01,差異有顯著統(tǒng)計學意義，Xpert無探針突變組利福平耐藥的準確性要顯著低于有探針突變組。

表4 不同探針突變特點與治療史的關聯(lián)性分析

兩組間比較采用Fisher確切概率法，P<0.01,初治與復治組不同探針突變比較有顯著統(tǒng)計學差異。

四、Xpert MTB/RIF檢測不同樣品探針的曲線是不同的，與樣品中結核菌的DNA模板起始濃度有關。Gene Xpert儀器顯示的不同探針突變的代表性曲線(見圖1-6)。

討 論

目前耐多藥結核病正在成為全球性的威脅，WHO報道利福平耐藥結核中78%為耐多藥結核[1]，WHO《耐藥結核病治療指南》[7]中推薦RR-TB及MDR-TB的化療方案是一樣的，因此早期診斷利福平是否耐藥對結核病治療方案的制定尤為重要。Xpert MTB/RIF檢測作為一種能同時對結核病診斷及利福平耐藥檢測的快速簡便的方法,在臨床上得到了廣泛的應用。國內外許多研究[8-10]顯示Xpert MTB/RIF檢測對結核病的診斷有很高的敏感度和特異度。本研究未再對Xpert MTB/RIF檢測對結核病的診斷的敏感度和特異度進行分析，但是在7659例標本中Xpert MTB/RIF的陽性檢出率要高

圖1 C探針突變的曲線

1.無探針突變的曲線；2.A探針突變的曲線；3.B探針突變的曲線；4.C探針突變的曲線；5.D探針突變的曲線；6.E探針突變的曲線

于培養(yǎng)，且有統(tǒng)計學意義，這與王啟明等[11]的研究不一致，這可能與本研究的培養(yǎng)方法為改良羅氏培養(yǎng)法，而王啟明等的研究采用的液體培養(yǎng)法有關，因為液體培養(yǎng)的陽性率要高于改良羅氏培養(yǎng)法。本研究顯示Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥與培養(yǎng)藥敏的一致率達到99.01%，采用Kappa 檢驗，兩種方法的檢測結果完全符合，而且Xpert MTB/RIF檢測用時較短，一般僅需2h左右，因此Xpert MTB/RIF可以快速有效的診斷利福平耐藥結核，對方案的早期制定有重要價值。

Xpert MTB/RIF檢測和培養(yǎng)藥敏檢測利福平耐藥結果亦存在不一致的情況，本研究有6例Xpert利福平敏感而培養(yǎng)藥敏示利福平耐藥，這是因為Xpert MTB/RIF檢測僅僅覆蓋了rpoB基因RRDR核心區(qū)，而Musser等報道[12]只有95%利福平耐藥突變位于rpoB序列中RRDR核心區(qū)。本研究有30例Xpert利福平耐藥而培養(yǎng)藥敏示利福平敏感，胡族瓊等[13]研究發(fā)現rpoB有8種無意義的錯義突變存在于4 株利福平敏感株中,認為這種無意義的突變,將導致利用分子診斷技術檢測利福平耐藥出現假陽性的可能；而Noura等[14]及Singhal等[15]研究發(fā)現rpoB 81bp核心區(qū)的L511P、D516Y、H526N、H526L、H526S和L533P等突變可能提示利福平耐藥，而培養(yǎng)藥敏結果是利福平敏感的，通過檢查耐多藥結核菌株的利福平耐藥基因型，以便對患者進行最佳治療是有必要的。

Xpert MTB/RIF檢測是通過覆蓋rpoB基因RRDR核心區(qū)A-E五條探針是否突變來實現利福平耐藥的檢測的，五條探針覆蓋的密碼子分別為：A(密碼子507-511)，B(密碼子512-518)，C(密碼子518-523)，D(密碼子523-529)和E(密碼子529-533)[2]。本研究顯示利福平耐藥結核探針突變發(fā)生的頻率為E>D>B>A>聯(lián)合探針>C，其中E探針突變率最高達到63.37%，其次是D探針20.16%、B探針8.23%，而C探針突變最少。Zaw等的一篇綜述分析顯示rpoB基因的RRDR中最常見的突變密碼子是531、526和516[16],而三個密碼子分別位于E、D、B三個探針的覆蓋區(qū)，本研究顯示E、D、B三條探針突變頻率與531、526和516密碼子突變頻率是一致的，三條探針的總突變率占91.76%。本研究顯示利福平耐藥結核不管是初治還是復治A-E五條探針突變的頻率大小順序是一致的，均為E>D>B>A>C。但兩組比較，探針突變的頻率有統(tǒng)計學差異，A、D探針突變初治組要高于復治組，E探針突變初治組要低于復治組，B探針突變兩組頻率基本一致，C探針兩組各一例，聯(lián)合探針突變初治組低于復治組，初治組的4例聯(lián)合探針突變均含有E探針突變，而復治3例聯(lián)合探針突變僅有1例合并E探針突變；而Uddin等的研究顯示初治患者只有E探針突變，且聯(lián)合探針突變僅見于復治患者[17]，這可能與不同國家和地區(qū)耐藥的原因有一定關系，本研究顯示本院原發(fā)耐藥占65.02%，原發(fā)感染占比較高，進一步表明早期發(fā)現并治療耐藥結核，控制傳染源，有助于本地區(qū)控制耐藥結核病疫情的傳播。

本研究顯示XpertXpert MTB/RIF法檢出利福平耐藥的262例中存在有19例未發(fā)現A-E探針突變，但結果示利福平耐藥,這種結果是存在的，其原因是：機器判讀結果除了根據探針是否結合，有沒有突變存在之外,也會判讀Ct值最高的一條探針和Ct值最低的一條探針之間的差值，如果差值>4.0，則認為濃度差異明顯，有一條探針存在突變可能，就會報告利福平耐藥的結果[2]。但本研究顯示19例未發(fā)現探針突變，而結果示利福平耐藥病例中，有10例培養(yǎng)藥敏結果為利福平敏感，如果以培養(yǎng)藥敏結果為利福平耐藥的金標準， Xpert無探針突變組利福平耐藥的準確性要明顯低于有探針突變組。由于本研究為回顧性研究，19例病例未進行復檢，也未進行其它分子生物學檢測，是否存在利福平耐藥基因突變不得而知，需要進一步的研究。

總之，本研究結果顯示利福平耐藥結核探針突變主要發(fā)生在E探針和D探針，C探針突變最少。利福平原發(fā)耐藥比例較高，Xpert MTB/RIF檢測可以快速有效的診斷利福平耐藥結核，有助于早發(fā)現、早治療，有利于阻止耐藥結核病的傳播，減少原發(fā)感染的可能。