• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    羅非魚原核表達基因研究進展

    2021-04-26 01:23:48賀揚余巧玲王均覃川杰李華濤
    生物技術(shù)通報 2021年2期
    關(guān)鍵詞:原核羅非魚載體

    賀揚 余巧玲 王均 覃川杰 李華濤

    (1. 內(nèi)江師范學院生命科學學院,內(nèi)江 641100;2. 長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室,內(nèi)江 641100)

    原核表達即在原核生物體內(nèi)的基因表達,是借助基因克隆技術(shù)把外源目的基因與特定載體相結(jié)合構(gòu)建表達載體,再將表達載體導入表達菌株中,使外源基因在表達菌株中得以表達。原核表達系統(tǒng)包括表達載體和表達菌株,根據(jù)不同的分類方式可以對表達系統(tǒng)進行分類,從表達調(diào)控的方式,可分為組成型和誘導型;從表達產(chǎn)物的定位,可分為分泌型和不分泌型;從產(chǎn)物純化的方式,可分為融合蛋白和非融合蛋白。隨著基因序列測定技術(shù)的成熟,各種基因的序列被測定出來,研究人員把目光轉(zhuǎn)向各種基因的功能,原核表達為基因功能的研究奠定了基礎(chǔ),為人、動物、植物和微生物基因體外表達提供了技術(shù)支撐,為某基因的蛋白功能研究提供了原材料,也可為藥物、疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

    全球人口預計到2050 年將達到96 億[1]。傳統(tǒng)的畜牧和捕獲漁業(yè)生產(chǎn)幾乎無法滿足人類對動物蛋白質(zhì)的需求。為適應(yīng)當前和未來的需求,水產(chǎn)養(yǎng)殖正穩(wěn)步發(fā)展并以每年全球年增長率超過7%的速度進行增長[2]。全球魚類年消費量已增至19 kg/人[3]。羅非魚被指定為人類飲食的一個理想組成部分,尤其是孕婦和正在成長的孩子。2018 年,羅非魚已成為產(chǎn)量僅次于鯉魚的第二大養(yǎng)殖品種[4]。而且羅非魚不僅是重要的養(yǎng)殖品種,也是魚類生理學和生態(tài)學的重要研究模型。

    國內(nèi)外,關(guān)于羅非魚營養(yǎng)、養(yǎng)殖、免疫的研究報道十分豐富,其中羅非魚相關(guān)基因的原核表達對這些基因的功能研究、免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)等都具有重要意義。因此,本論文對現(xiàn)有羅非魚原核表達基因進行了綜述,以期為進一步深入研究羅非魚奠定基礎(chǔ)。

    1 原核表達技術(shù)

    原核表達是借助基因重組技術(shù)得以實現(xiàn)。基因重組技術(shù)始建于1972 年,Jackson 等[5]用同一種限制性內(nèi)切酶對猿猴某病毒的DNA 和λ 噬菌體DNA進行剪切后,利用DNA 連接酶把上述兩種DNA 分子重新連接,產(chǎn)生了一種新的DNA 分子,即重組DNA。在1973 年,Cohen 等[6]利用相同技術(shù)將一段外源DNA 片段與質(zhì)粒DNA 連接起來,構(gòu)成了一個重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒又進一步轉(zhuǎn)入大腸桿菌,成功構(gòu)建了完整的基因克隆體系。

    最先被應(yīng)用且目前最成熟的表達體系是大腸桿菌表達體系。它具有快速、高產(chǎn)量、IPTG 簡易快速誘導表達等特點。PET 表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用較為廣泛的表達系統(tǒng),可以滿足研究者對載體融合標簽、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)外運等需求。pET 載體的各種啟動子及宿主為各類不同蛋白表達產(chǎn)量的最大化提供了重要的選擇。而帶有His 標簽的pET 載體可增加目的蛋白的溶解性,減少包涵體的形成,為后續(xù)的蛋白檢測、純化及蛋白相關(guān)功能研究奠定基礎(chǔ)。

    2 羅非魚中原核表達的基因使用的載體及菌株

    羅非魚品種非常多,約有40-50 種。其中部分羅非魚已經(jīng)引種至世界各地的熱帶和亞熱帶地區(qū),作為動物蛋白的重要供應(yīng)來源。1956 年羅非魚被首次引入我國,目前我國已成為羅非魚養(yǎng)殖的第一大國。然而,隨著羅非魚的大量養(yǎng)殖也出現(xiàn)了一些問題,比如雌雄成熟時間的不同、各種病害頻發(fā)。為更好的服務(wù)羅非魚養(yǎng)殖業(yè),研究者們對羅非魚生長、性別調(diào)控、繁殖以及免疫相關(guān)基因都做了大量的研究,其中原核表達特定基因應(yīng)用非常廣泛(表1)。在眾多羅非魚品種中,以尼羅羅非魚的研究最為廣泛,其他羅非魚如奧利亞羅非魚、吉富羅非魚也有少量研究。原核表達的基因以免疫相關(guān)因子為主,也有與繁殖相關(guān)的因子。大多數(shù)的原核表達蛋白均用于功能研究或制備單/多克隆抗體。從表達體系來看,原核表達的載體以pET 系列為主。

    3 羅非魚中原核表達重組蛋白的應(yīng)用與價值

    原核表達具有操作簡便、產(chǎn)量豐富、價格低廉等特點,是生產(chǎn)大量目的重組蛋白質(zhì)的簡單且廉價的方法,是替代天然獲取的有效手段[41]。使用原核表達技術(shù)進行基因的表達,在動物、植物、微生物基因功能的研究和蛋白利用中都得到了廣泛的應(yīng)用:在動物多用于研究疾病或生長相關(guān)基因的表達,以大量獲得蛋白制備抗體,用于后續(xù)機制研究。在植物多用于生長調(diào)控有關(guān)的基因和一些有巨大價值的蛋白基因的表達。在微生物研究主要圍繞毒力基因或致病基因進行表達用于致病機制研究或亞單位疫苗制備。歸納羅非魚的原核表達基因的用途主要可分為以下3 個方面。

    3.1 抗體制備

    原核表達技術(shù)可大量獲得目的蛋白,易于純化,且具有較好的免疫原性是作為抗原的首選。原核表達的mIgD 具有較強的免疫原性,皮下注射免疫大白兔57 d 后,可產(chǎn)生效價約1∶512 000 的抗體[8]。原核表達的AMH 免疫ICR 小鼠4 次后,血清效價可達1∶2 000[9]。原核表達的Hsc70 免疫日本大耳兔的抗體效價為1∶204 800,且能特異性的識別尼羅羅非魚Hsc70 蛋白[12]。原核表達Ly75 獲得的兔抗Ly75 多克隆抗體成功用于了檢測Ly75 在尼羅羅非魚體內(nèi)的分布情況[13]。Rentier-Delrue 等[39]參照鮭鱒魚類的cDNA 文庫成功獲得了尼羅羅非魚的GH基因,并實現(xiàn)了GH 的克隆表達,為Melamed 等[42]建立GH 放射免疫測定法提供了兔抗-GH 抗體的原材料,為研究下丘腦和甲狀腺對GH 的調(diào)節(jié)作用奠定了重要基礎(chǔ)。丁煒東等[7]利用原核表達技術(shù)首次表達了魚類GnRH 前體蛋白,并獲得了高效價的抗體,為后續(xù)研究免疫抑制控制魚類性成熟奠定了基礎(chǔ)。當?shù)鞍仔蛄羞^大時,截短表達的蛋白也可作為抗原用于制備特異性抗體。使用原核表達的截短IgM 蛋白制備獲得多克隆抗體,可特異性檢測尼羅羅非魚組織和血清中IgM 的含量[43]。因此,無論是全序列還是截短序列經(jīng)原核表達后,均可作為抗原,免疫動物,獲得抗血清。

    表1 羅非魚原核表達基因

    3.2 目的蛋白功能分析

    蛋白的功能研究對于目的蛋白的純度和濃度都具有極高的要求。天然的目的蛋白是研究功能的最佳選擇,但其提取方法十分復雜,甚至無法提取。如Kaiya 等[44]在研究生長激素釋放肽對生長激素和催乳素的影響時,首先需要將生長激素釋放肽從胃提取、純化、并鑒定出來,然后進行后續(xù)實驗。該過程操作復雜,對試劑和儀器的要求很高,而且純度和濃度往往難以達到要求。而如若采用直接合成大分子蛋白質(zhì)的辦法,將花費昂貴。因此如果原核表達的蛋白具有活性,研究者們將優(yōu)選原核表達獲得蛋白進行活性研究。Hu 等[38]研究pET -BL21(DE3)表達IGF-2 表達量發(fā)現(xiàn):每114.5 g/L 的干細胞可產(chǎn)生9.69 g/L IGF-2,即IGF-2 的表達量高達總蛋白含量的11.3%,且保有活性。周林燕[24]分析原核表達的17β-羥類固醇脫氫酶1 的酶活發(fā)現(xiàn):重組蛋白能高效催化A 和T 之間的轉(zhuǎn)化,也能高效催化E1 和E2 之間的互相轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率高達98.5%。原核表達tiPRLs 可用于生物學功能研究[35]。因此,原核表達技術(shù)在蛋白功能分析上,可作為重要的蛋白供應(yīng)途徑。

    3.3 目的蛋白開發(fā)利用

    原核表達蛋白對于開發(fā)生產(chǎn)新型藥物、綠色抗菌劑等都具有重要意義。羅非魚Hepcidin 抗菌肽早在2009 年和2011 年就被證實具有抗腫瘤、抗乙腦功能[45-46]。然而這些研究都是基于合成肽的基礎(chǔ)完成的。雖然抗菌肽分子量小,氨基酸數(shù)量僅有20 余個,但合成肽的價格依然昂貴,難以實現(xiàn)大量生產(chǎn)。2012 年,文雅等[30]研究發(fā)現(xiàn)原核表達的羅非魚Hepcidin 對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌都具有抑菌活性,表明原核表達的Hepcidin 同樣具有抗菌活性。瞿蘭等[40]應(yīng)用原核表達技術(shù)大量獲得了奧利亞羅非魚的3 種C 型溶菌酶,比較分析了原核表達的3 種C 型溶菌酶與斑節(jié)對蝦C 型溶菌酶和草魚C 型溶菌酶的活性,發(fā)現(xiàn)原核表達的溶菌酶具有較強的抗菌活性。

    原核表達的細胞因子為研究新型免疫佐劑提供新思路。魚類的某些細胞因子如IL-1、干擾素能作為免疫佐劑,增加魚體的特異性免疫。吳杰等[47]研究發(fā)現(xiàn)原核表達的斑點叉尾鮰IL-1β 可作為疫苗佐劑,提高亞單位疫苗PSCPI 的免疫效果。陳德芳等[48]研究也表明原核表達的IL-8 可作為免疫佐劑。在羅非魚上,Suhee[34]研究發(fā)現(xiàn)原核表達的尼羅羅非魚的IL-1β 具有生物學活性,有望作為免疫佐劑進行開發(fā)利用。王瑞等[49]研究發(fā)現(xiàn)真核表達的Hsp70 可作為羅非魚的免疫佐劑,如若原核表達的Hsp70 也具有活性,則有望開發(fā)免疫佐劑。

    因此,原核表達蛋白在新型藥物研發(fā)和免疫調(diào)節(jié)劑開發(fā)中都具有較好的應(yīng)用前景。

    4 原核表達的局限性

    隨著原核表達的廣泛應(yīng)用,研究者們創(chuàng)造了多種多樣的原核表達系統(tǒng)。就以有史以來大腸桿菌表達系統(tǒng)中最強的pET 為例。Novagen 公司單pET 系統(tǒng)就推出了pET 載體41 種、融合標簽14 種、表達宿主37 種。研究者可根據(jù)要求選擇二硫鍵形成、高嚴謹表達、串聯(lián)序列表達、提供稀有密碼子、控制表達水平、營養(yǎng)缺陷等。如莫桑比羅非魚的IGF-2蛋白,雖然在pGEX-2T 和pET28 中都能進行表達,且均具有生物學活性,但pET28 表達體系的產(chǎn)量遠高于pGEX-2T[42-43]。原核表達系統(tǒng)的優(yōu)化雖然最大限度的滿足了研究者的需求,但如果堅持使用原核表達系統(tǒng),那么對于載體和宿主的選擇和優(yōu)化,將費時費力費錢。

    而且,盡管有大量的宿主和載體進行選擇,對于真核生物——羅非魚而言,無法表達和表達后無活性依然是研究者最為擔憂的問題。由于原核表達系統(tǒng)常常無法實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后糖基化、甲基化等修飾,因此真核基因在原核系統(tǒng)里可能出現(xiàn)表達后沒有活性的現(xiàn)象。而且原核表達系統(tǒng)的密碼子偏愛性與真核表達系統(tǒng)存在差異,這也使得許多基因在原核系統(tǒng)中不能表達或表達量低。另外,原核表達系統(tǒng)表達十分高效,這也使得蛋白質(zhì)在表達過程中難以正確折疊,最終以包涵體的形式表達出來,使得蛋白失活。

    因此,如果不能使用常規(guī)的原核表達體系實現(xiàn)蛋白表達和活性。研究者們通常會考慮使用真核表達系統(tǒng)進行試驗,如酵母表達系統(tǒng)、絲狀真菌表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)等。Harel 等[50]使用畢赤酵母成功表達了尼羅羅非魚黃體激素(LH),并對其結(jié)構(gòu)和功能進行了分析。王瑞等[49]使用畢赤酵母表達的Hsp70 蛋白ATPase 與抗原多肽結(jié)合具有免疫增強作用。

    5 總結(jié)與展望

    雖然原核表達還存在一些缺點,但是原核表達在分子基礎(chǔ)研究中已經(jīng)是一項不可缺少的技術(shù)。即使表達的蛋白無生物學活性,但在多克隆抗體的制備研究中依然表現(xiàn)出很大的優(yōu)越性,為蛋白的定位定量分析奠定了基礎(chǔ)。如果表達的蛋白具有活性,將為蛋白的功能研究與開發(fā)提供極大的便利。因此,原核表達蛋白在羅非魚的研究和應(yīng)用中占有重要的地位。

    猜你喜歡
    原核羅非魚載體
    創(chuàng)新舉措強載體 為僑服務(wù)加速跑
    華人時刊(2022年9期)2022-09-06 01:02:44
    堅持以活動為載體有效拓展港澳臺海外統(tǒng)戰(zhàn)工作
    華人時刊(2020年15期)2020-12-14 08:10:36
    羅非魚養(yǎng)殖模式
    貿(mào)易戰(zhàn),羅非魚首當其沖!面臨眾多不利因素,昔日的王者羅非魚還能打一場翻身戰(zhàn)嗎?
    羅非魚 年總產(chǎn)量全國第三位
    TiO_2包覆Al_2O_3載體的制備及表征
    結(jié)核分枝桿菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表達、純化及ELISPOT檢測方法的建立與應(yīng)用
    癌癥標記蛋白 AGR2的原核表達及純化
    牛分支桿菌HBHA基因的克隆及原核表達
    人巨細胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表達與IgM捕獲ELISA方法建立和應(yīng)用
    在线观看av片永久免费下载| 久久热精品热| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品影院久久| 波多野结衣高清作品| 在线免费观看的www视频| 直男gayav资源| 欧美乱妇无乱码| 国产高清有码在线观看视频| 热99在线观看视频| 精品国产三级普通话版| 亚洲国产精品999在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久国产乱子免费精品| 久久亚洲精品不卡| 亚洲18禁久久av| 久久久精品欧美日韩精品| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲av一区综合| 欧美成人a在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 免费观看精品视频网站| 亚洲av二区三区四区| eeuss影院久久| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 日韩欧美在线乱码| 男人舔奶头视频| 成年女人永久免费观看视频| 久99久视频精品免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产视频一区二区在线看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 精品免费久久久久久久清纯| 成人性生交大片免费视频hd| 脱女人内裤的视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美成狂野欧美在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本 av在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中出人妻视频一区二区| 欧美精品啪啪一区二区三区| www日本黄色视频网| 精品免费久久久久久久清纯| 色av中文字幕| 老熟妇乱子伦视频在线观看| av欧美777| 亚洲国产精品成人综合色| 免费看日本二区| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 老司机深夜福利视频在线观看| 日本五十路高清| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 三级毛片av免费| 免费在线观看日本一区| 国产免费男女视频| 精品欧美国产一区二区三| 哪里可以看免费的av片| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久九九热精品免费| 久久久久精品国产欧美久久久| 中文资源天堂在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲第一电影网av| 一本一本综合久久| 男插女下体视频免费在线播放| 日韩高清综合在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产高清激情床上av| 亚洲熟妇熟女久久| 宅男免费午夜| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲av.av天堂| 热99在线观看视频| 十八禁网站免费在线| 亚洲av一区综合| 日韩欧美精品免费久久 | 国产av一区在线观看免费| 女人被狂操c到高潮| av在线老鸭窝| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品av视频在线免费观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 午夜老司机福利剧场| 女人被狂操c到高潮| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久国产精品影院| 少妇人妻一区二区三区视频| 天堂√8在线中文| 精品久久久久久久末码| 欧美黄色淫秽网站| 久久久精品大字幕| 成人精品一区二区免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品一区二区三区人妻视频| 欧美bdsm另类| 成人特级av手机在线观看| 性色avwww在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 免费观看人在逋| 日韩亚洲欧美综合| 欧美高清性xxxxhd video| 日韩欧美在线乱码| 日本黄大片高清| 久久亚洲精品不卡| 深爱激情五月婷婷| 久久久色成人| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品不卡国产一区二区三区| 99热只有精品国产| 国产人妻一区二区三区在| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产爱豆传媒在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品久久电影中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美乱色亚洲激情| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久久久九九精品影院| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| aaaaa片日本免费| 久久伊人香网站| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲无线观看免费| 悠悠久久av| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日韩亚洲欧美综合| 99精品在免费线老司机午夜| 一区二区三区高清视频在线| 亚州av有码| 毛片一级片免费看久久久久 | 午夜免费激情av| 久久久久性生活片| 9191精品国产免费久久| 久久热精品热| 床上黄色一级片| 毛片女人毛片| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲成av人片在线播放无| 久久热精品热| 久久人人爽人人爽人人片va | 老女人水多毛片| 欧美乱色亚洲激情| 久久亚洲精品不卡| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人性生交大片免费视频hd| 在线国产一区二区在线| 国产黄片美女视频| 热99在线观看视频| 日本一二三区视频观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 97碰自拍视频| 嫩草影院精品99| 国产日本99.免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产三级在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 最新在线观看一区二区三区| 91在线观看av| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 美女高潮的动态| 国产伦一二天堂av在线观看| av在线观看视频网站免费| 国产高清有码在线观看视频| 免费黄网站久久成人精品 | 国产一区二区激情短视频| 麻豆成人午夜福利视频| 在线播放无遮挡| av中文乱码字幕在线| 无遮挡黄片免费观看| 成年女人永久免费观看视频| 午夜福利在线观看吧| 久久草成人影院| 看黄色毛片网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲乱码一区二区免费版| 十八禁网站免费在线| 禁无遮挡网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩国内少妇激情av| 大型黄色视频在线免费观看| 精品久久国产蜜桃| 麻豆成人午夜福利视频| 免费观看精品视频网站| 全区人妻精品视频| 欧美午夜高清在线| 久久午夜福利片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 搞女人的毛片| 亚洲国产精品999在线| 成人午夜高清在线视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产成年人精品一区二区| 国产69精品久久久久777片| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品女同一区二区软件 | 国产视频一区二区在线看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产av一区在线观看免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 18美女黄网站色大片免费观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜免费成人在线视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲av成人av| 欧美极品一区二区三区四区| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产成人影院久久av| 中文资源天堂在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 九九在线视频观看精品| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产精品av视频在线免费观看| 国产麻豆成人av免费视频| 国语自产精品视频在线第100页| 成人特级av手机在线观看| 在线播放国产精品三级| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 精品人妻一区二区三区麻豆 | 波多野结衣巨乳人妻| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产中年淑女户外野战色| 伦理电影大哥的女人| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久人妻av系列| 久久国产乱子伦精品免费另类| 在现免费观看毛片| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品日韩av在线免费观看| 在线播放国产精品三级| 一级a爱片免费观看的视频| 国产淫片久久久久久久久 | 深爱激情五月婷婷| 成人欧美大片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 动漫黄色视频在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成人永久免费在线观看视频| 久久久久久久午夜电影| 久久国产精品人妻蜜桃| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 免费大片18禁| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品久久久久久精品电影| 在线看三级毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 赤兔流量卡办理| 久久中文看片网| 成人亚洲精品av一区二区| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美性猛交黑人性爽| 国产日本99.免费观看| 亚洲av二区三区四区| 变态另类丝袜制服| xxxwww97欧美| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一a级毛片在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 久久人妻av系列| 国产高潮美女av| 国产三级黄色录像| 99热这里只有是精品在线观看 | 天美传媒精品一区二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲18禁久久av| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲,欧美,日韩| 男女下面进入的视频免费午夜| 男人的好看免费观看在线视频| 91在线观看av| 色综合亚洲欧美另类图片| 在线看三级毛片| 国产高潮美女av| 一本久久中文字幕| 久久国产精品影院| 欧美成人a在线观看| 国产探花极品一区二区| 欧美性感艳星| 国产精品不卡视频一区二区 | 久久午夜福利片| 99国产精品一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 看片在线看免费视频| 久久中文看片网| 亚洲国产精品久久男人天堂| 美女免费视频网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美+亚洲+日韩+国产| 好男人在线观看高清免费视频| 日本熟妇午夜| 日本免费a在线| 少妇的逼水好多| 五月玫瑰六月丁香| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 很黄的视频免费| 日本熟妇午夜| 国产精品一及| 国产中年淑女户外野战色| 在线观看66精品国产| 男女床上黄色一级片免费看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产av在哪里看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99热精品在线国产| 日本与韩国留学比较| 亚洲精华国产精华精| 国产欧美日韩精品一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产色婷婷99| 色在线成人网| 午夜福利视频1000在线观看| netflix在线观看网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美乱色亚洲激情| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一区二区三区激情视频| 日本免费a在线| 成人精品一区二区免费| 变态另类丝袜制服| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 天堂√8在线中文| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 99在线人妻在线中文字幕| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲,欧美精品.| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产高清激情床上av| 99热这里只有精品一区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 无遮挡黄片免费观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 日本与韩国留学比较| 久久99热6这里只有精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产中年淑女户外野战色| 成人国产一区最新在线观看| 午夜激情福利司机影院| 国产野战对白在线观看| 99久国产av精品| av国产免费在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩中字成人| 国产精品久久电影中文字幕| 久久久久久久久大av| 级片在线观看| 天堂动漫精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 乱人视频在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日本a在线网址| 99国产精品一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲av熟女| 免费无遮挡裸体视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 一个人看的www免费观看视频| 夜夜爽天天搞| 日韩中文字幕欧美一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 动漫黄色视频在线观看| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲精品在线美女| 色哟哟·www| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 嫩草影视91久久| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品1区2区在线观看.| 超碰av人人做人人爽久久| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 搡老岳熟女国产| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产精品影院久久| 毛片女人毛片| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲黑人精品在线| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 首页视频小说图片口味搜索| 久久国产精品影院| 久久久久久大精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久久久九九精品影院| 婷婷亚洲欧美| 露出奶头的视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日韩有码中文字幕| 久久香蕉精品热| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲一区二区三区不卡视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 高潮久久久久久久久久久不卡| 97超视频在线观看视频| 乱码一卡2卡4卡精品| av欧美777| 国产单亲对白刺激| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品久久视频播放| 国产在线男女| 亚洲片人在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 小说图片视频综合网站| 日本a在线网址| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产主播在线观看一区二区| 成年免费大片在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人永久免费在线观看视频| 国产一区二区在线av高清观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 午夜福利18| 日本一二三区视频观看| 少妇高潮的动态图| av在线天堂中文字幕| 丁香六月欧美| www.999成人在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 免费电影在线观看免费观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久香蕉精品热| 精品人妻熟女av久视频| 成人三级黄色视频| 久久伊人香网站| 十八禁网站免费在线| 免费av观看视频| 亚洲七黄色美女视频| 欧美区成人在线视频| 国产人妻一区二区三区在| 精品午夜福利视频在线观看一区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲色图av天堂| 午夜老司机福利剧场| 波野结衣二区三区在线| 最近中文字幕高清免费大全6 | 禁无遮挡网站| 久久久精品大字幕| 欧美在线黄色| 精品人妻熟女av久视频| 精品国产亚洲在线| 在线观看午夜福利视频| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲最大成人av| 久久久久精品国产欧美久久久| 少妇丰满av| 麻豆国产av国片精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日韩欧美三级三区| 国产视频内射| 看十八女毛片水多多多| 嫩草影院精品99| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久国产乱子免费精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 99久久九九国产精品国产免费| 午夜福利免费观看在线| 精品久久久久久久久久免费视频| av在线蜜桃| 亚洲av第一区精品v没综合| 99久久精品一区二区三区| 亚洲综合色惰| 国产v大片淫在线免费观看| 伦理电影大哥的女人| 婷婷六月久久综合丁香| 人妻久久中文字幕网| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 最近视频中文字幕2019在线8| 丁香六月欧美| 欧美zozozo另类| 精品国产亚洲在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品一及| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲精华国产精华精| 亚洲专区中文字幕在线| 校园春色视频在线观看| 亚洲av成人av| 757午夜福利合集在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99国产极品粉嫩在线观看| 直男gayav资源| 色综合站精品国产| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久久精品大字幕| а√天堂www在线а√下载| 亚洲第一区二区三区不卡| 色视频www国产| 久久精品国产清高在天天线| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 黄色视频,在线免费观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 午夜激情欧美在线| 丰满的人妻完整版| 在线观看舔阴道视频| 99riav亚洲国产免费| av在线观看视频网站免费| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久精品欧美日韩精品| 在线a可以看的网站| 一级黄片播放器| 99久久精品热视频| 亚洲成av人片在线播放无| 最后的刺客免费高清国语| 国产av在哪里看| 乱码一卡2卡4卡精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 99热这里只有是精品在线观看 | 18+在线观看网站| 午夜老司机福利剧场| 国产三级在线视频| 亚洲人成网站高清观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲人成网站在线播| 国产一区二区激情短视频| 亚洲色图av天堂| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产成人欧美在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 国内精品一区二区在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 99久久精品热视频| 韩国av一区二区三区四区| 国产成人影院久久av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲精品亚洲一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲av一区综合| 我的老师免费观看完整版| 最新在线观看一区二区三区| 热99在线观看视频| 久久人妻av系列| 亚洲,欧美,日韩| 91在线精品国自产拍蜜月| 色5月婷婷丁香| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产毛片a区久久久久| 欧美在线一区亚洲| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产伦在线观看视频一区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 18+在线观看网站| 亚洲内射少妇av| 99久久99久久久精品蜜桃| 一夜夜www| 国产乱人伦免费视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 男人舔奶头视频| 一级av片app| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 高清在线国产一区| 波多野结衣高清作品| 国产精品人妻久久久久久| 一区二区三区四区激情视频 | 成人毛片a级毛片在线播放| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产高清三级在线| 亚洲最大成人av| 亚洲色图av天堂| 好男人在线观看高清免费视频| av中文乱码字幕在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久精品国产清高在天天线| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 成年女人看的毛片在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| 国产免费一级a男人的天堂| 在线播放国产精品三级| 国产伦人伦偷精品视频| 成人国产一区最新在线观看|