RNA 藥物的發(fā)展及其在水產(chǎn)上的應(yīng)用

潘銀來 邱春輝 王藝?yán)?張子平，5

（1. 大黃魚育種國家重點實驗室，寧德 352103；2. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福州 350001；3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350001；4. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門 361021；5. 福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院 福建省海洋生物技術(shù)重點實驗室，福州 350001）

核酸藥物是一類具有不同功能的DNA 或RNA，其具有特定的靶點和作用機制，通常在基因或其表達(dá)水平上發(fā)揮作用［1］。這些藥物具有很高的特異性，可以靶向選定的基因、mRNA 和非編碼RNA，而且副作用比傳統(tǒng)的藥物?。?］。一般包括核酸適配體（Aptamer）、抗基因（Antigene）、核酶（Ribozyme）、反 義 寡 核 苷 酸（Antisense oligonucleotide，ASO）、RNA 干擾劑等［3］。在過去的25 年里，用RNA 分子作為治療藥物從概念走向了臨床。早期因為RNA 分子不穩(wěn)定易被降解，在體內(nèi)有相對較短的半衰期［4］，被認(rèn)為其難以作為有效的治療藥物。近年來，隨著化學(xué)穩(wěn)定性的改進(jìn)如作為第一代核酸藥物的硫代磷酸修飾［5］、堿基修飾［6］及藥物遞送載體，如脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)［7］及納米載體結(jié)合細(xì)胞穿透肽［8］等新的遞送系統(tǒng)的開發(fā)，使得半衰期較短的RNA 分子成為臨床藥物研究的新寵，在生物制藥領(lǐng)域掀起了一股RNA 藥物的熱潮。

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，成為世界食物生產(chǎn)發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一。然而由于飼養(yǎng)密度的提高，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化造成了水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病害的頻發(fā)。疾病暴發(fā)已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要制約因素［9］。例如，病毒能引起大量水產(chǎn)動物的病害。在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的幾乎所有類型的病毒家族現(xiàn)在都可以在魚類中被找到［10］。有研究團隊對9 個動物門中220 多種無脊椎動物標(biāo)本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了1 445 種全新的RNA 病毒，其中包括一些足以構(gòu)成新家族的RNA 病毒［11］。最近，Shi 等［10］在兩棲類、肺魚、輻鰭魚、軟骨魚和無顎魚中確定了214個獨特的、以前從未描述過的脊椎動物病毒種類，其中196 個特異地存在于爬行動物中。寄生蟲也常引起病害，如幾乎所有海水硬骨魚均會被刺激隱核蟲感染，對于海水魚苗的感染率和死亡率有時可達(dá)100%［12］。由于目前尚無合適、有效針對刺激隱核蟲的藥物，導(dǎo)致一旦蟲害爆發(fā)，造成的經(jīng)濟損失巨大。

RNA 藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的防治方面有重大的應(yīng)用前景。在這篇綜述中，我們首先簡要回顧了RNAi 和CRISPR/Cas9 技術(shù)的起源、原理與應(yīng)用，總結(jié)了RNA 藥物的發(fā)展與應(yīng)用。接著我們將重點放在該技術(shù)在抑制水產(chǎn)病毒和寄生蟲方面的研究進(jìn)展。最后結(jié)合我們團隊的最新成果，討論了RNA 藥物的進(jìn)一步發(fā)展，特別是在水產(chǎn)上的應(yīng)用前景和未來方向。

1 RNAi 技術(shù)

RNAi 是指與相關(guān)基因或編碼區(qū)域相對應(yīng)的雙鏈RNA（dsRNA）被引入細(xì)胞中，導(dǎo)致相應(yīng)mRNA 降解的轉(zhuǎn)錄后基因沉默［13］。Guo 等［14］將par-1基因的正、反義鏈RNA 注射到秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中，發(fā)現(xiàn)其能阻斷該基因的表達(dá)，意外地觀察到了雙鏈RNA 在動物細(xì)胞中特異地抑制基因的表達(dá)。隨后Fire 等［15］將mex-3基因的dsRNA 注射到秀麗隱桿線蟲發(fā)現(xiàn)，dsRNA 能夠高效特異性地抑制線蟲中目的基因表達(dá)，并將這種效應(yīng)稱之為RNA干涉（RNA interference，RNAi）。隨后多個團隊在植物［16］、昆蟲［17］、水產(chǎn)動物［18］等多種生物中也報道了類似的結(jié)果。

RNAi 作用原理可分為起始階段和效應(yīng)階段，有些低等物種如秀麗隱桿線蟲［19］和擬南芥［20］還存在級聯(lián)放大階段，其簡明原理圖如圖1。起始階段：由RNA 病毒入侵，轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄，基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的dsRNA 分子在細(xì)胞內(nèi)被RNaseIII 家族中的Dicer 酶或其同源物剪成21-23 nt 的小干擾RNA（Small interference RNA，siRNA）。效應(yīng)階段：siRNA 被裝載至其他一些相關(guān)蛋白復(fù)合物中如RNAi特異性的核酸外切酶、內(nèi)切酶及輔助識別同源序列蛋白等，并形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。當(dāng)RISC 結(jié)合上siRNA 后被活化并通過解旋酶的作用打開siRNA 的雙鏈結(jié)構(gòu)，形成單鏈siRNA。RISC 被活化后通過siRNA 反義鏈去尋找潛在的能與其互補的靶mRNA 序列并與之結(jié)合，然后RISC 復(fù)合物中的RNase 在靶mRNA與siRNA 結(jié)合區(qū)域的中間切斷標(biāo)靶mRNA，引發(fā)靶mRNA 的特異性降解。級聯(lián)放大［21］：在RNA 依賴性RNA 聚合酶（RDRs）的作用下，以mRNA 為模板，siRNA 為引物，擴增產(chǎn)生足夠數(shù)量的dsRNA 作為底物提供給Dicer 酶，產(chǎn)生更多的siRNA，從而使效應(yīng)階段反復(fù)發(fā)生。

RNAi 具有特異性地沉默靶基因的能力，已被廣泛地用于通過降低表達(dá)而不改變基因型來研究特定基因的功能［22］。我們團隊利用RNAi 研究了一些水產(chǎn)動物基因的功能。例如，在雜色鮑（Haliotis diversicolor）胚胎發(fā)育過程中加入其胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（Insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7）的dsRNA 會引起發(fā)育的異常［23］；在體外培養(yǎng)的雜色鮑血淋巴中加入saIGFBP7的dsRNA 會顯著影響培養(yǎng)的鮑血細(xì)胞中IGFBP7 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)并顯著降低血淋巴的數(shù)量［24］。通過RNAi 技術(shù)我們還驗證了暴露于缺氧，熱應(yīng)激，缺氧加熱應(yīng)激條件下的雜色鮑血淋巴中參與對低氧/熱應(yīng)激的免疫應(yīng)答的基因和信號通路［25］。在研究缺氧應(yīng)激后細(xì)菌感染引起的雜色鮑的免疫抑制的機制中通過RNAi 技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)HdAKT 被抑制后PI3K-AKT 信號通路的多數(shù)基因受到抑制［26］。dsRNA 可通過細(xì)胞微管在細(xì)胞間傳遞，RNAi 不僅可用于研究基因功能、基因的表達(dá)調(diào)控，還可用于基因治療、鑒定藥物靶點和候選疫苗［27］，以及作為RNA 藥物通過干擾病原體的傳播，發(fā)育和增殖來控制傳染?。?8］。

圖1 RNAi 簡明原理圖

2 CRISPR/Cas9 技術(shù)

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是一個特殊的DNA 重復(fù)序列家族，其廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。Cas9 是一種在很多細(xì)菌中都可以表達(dá)的核酸內(nèi)切酶，它在細(xì)菌中發(fā)揮著一種防御作用以避免外源DNA 如病毒或者質(zhì)粒等的入侵。隨后的研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是針對入侵病毒病原體的一種細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，其使用源自過去感染的病毒的RNA 片段經(jīng)RNA 引導(dǎo)的核酸酶作用，通過互補堿基配對靶向切割病毒DNA［29］。根據(jù)核酸內(nèi)切酶的識別和切割機制的不同，CRISPR/Cas 系統(tǒng)可分為Ⅰ型、II 型和Ⅲ型［30］。其中來自化膿鏈球菌的II 型CRISPRCas9 系統(tǒng)由于其組成簡單，已被改造成為最簡單和應(yīng)用最廣泛的基因組靶向編輯工具。其核心組分是RuvC 蛋白結(jié)構(gòu)域和HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域的內(nèi)切核酸酶Cas9［31］，以及結(jié)合CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tra-crRNA）。crRNA 是由前體 crRNA經(jīng)反式激活crRNA 和RNase ⅢNase 的［32］。crRNA將Cas9 蛋白引導(dǎo)到目標(biāo)DNA 雙鏈上并發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的作用，tra-crRNA 與crRNA 進(jìn)行堿基互補配對，其中前20 個堿基確定Cas9 核酸內(nèi)切酶的特異性。在與crRNA 指導(dǎo)序列互補的位點處，Cas9 的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域切割互補鏈，而Cas9 的RuvC 蛋白結(jié)構(gòu)域切割非互補鏈［33］，其機制圖如圖2。該系統(tǒng)發(fā)揮作用不僅需要crRNA 中存在與目標(biāo)基因堿基互補配對的序列，還需要在目標(biāo)基因的靶向結(jié)合區(qū)的下游存在前間區(qū)序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif，PAM）［34］。只 有 當(dāng) 適 當(dāng) 的PAM 位 于 目 標(biāo)序列后面時，crRNA-tracrRNA 復(fù)合體才能夠引導(dǎo)Cas9［35］。在不同的生物體中，PAM 序列不同。在研究廣泛的化膿性鏈球菌中，PAM 序列為NGG［36］。

圖2 CRISPR 原理模式圖

隨著研究的深入，研究人員用sgRNA［37］代替了crRNA 和tra-crRNA，sgRNA 序列中有一個模擬crRNA-tra-crRNA 復(fù)合體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。sgRNA 由3部分組成：堿基互補配對區(qū)（Base-pairing region）、Cas9 把 手（Cas9 handle）和 終 止 子（terminator）。Cas9-sgRNA 在同源的靶序列中引入位點特異性雙鏈DNA 斷裂（Double strand break，DSB）后，細(xì)胞可以通過非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源定向修復(fù)（Homology-directed repair，HDR）兩種方式對DNA 進(jìn)行修復(fù)。NHEJ 修復(fù)途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生小的隨機插入或缺失突變（插入缺失），使得靶基因編碼區(qū)中的密碼子發(fā)生移位，導(dǎo)致編碼的基因功能的喪失［38-39］；HDR 途徑是當(dāng)質(zhì)?；騿捂湽押塑账幔ü丫郏┠０逡泊嬖跁r，基因組 DNA 通過與外源提供的DNA 模板進(jìn)行同源重組引入特定靶位點的點突變或所需序列的插入/缺失，造成靶位點的糾正或者靶向插入外源基因，從而產(chǎn)生特異性和精確的核苷酸或序列替換［40］。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)代表了一種功能強大，高度特異性和適應(yīng)性強的工具，可以糾正或治療因細(xì)胞突變引起的癌癥，如直接靶向癌基因受體酪氨酸激酶Erb2［41］。通過多重Cas9 永久性切除45-55外顯子有望治愈杜興氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）［42］。一些病毒病原體也已采用CRISPR 系統(tǒng)對病毒DNA 進(jìn)行破壞，如使用針對性編輯多個基因來減少乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）核心和表面蛋白的產(chǎn)生［43］，靶向人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）的E6和E7 基因從而抑制病毒［44］。靶向基因產(chǎn)生功能缺失突變體是一種基于反向遺傳學(xué)來闡明其功能的常用方法。在水產(chǎn)動物方面，Sun 等［45］用CRISPR /Cas9 工具敲除對蝦中的幾丁質(zhì)酶基因（EcChi4），然后用副溶血弧菌或嗜水鏈球菌攻擊時發(fā)現(xiàn)，EcChi4基因缺失組的蝦死亡率顯著高于野生型蝦，證實了幾丁質(zhì)酶基因在免疫防御中的功能。該技術(shù)將來可以研究其他十足動物無法輕易解決的重要生物學(xué)問題。Cai 等［46］使用CRISPR / Cas9 獲得缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子（Factor-inhibiting HIF，F(xiàn)IH）突變的斑馬魚發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IH缺失型的斑馬魚相比野生型對低氧條件的耐受性更高。Zhang 等［47］在對蝦中采用CRISPR / Cas9 技術(shù)對EcMIH基因進(jìn)行敲除發(fā)現(xiàn)，EcMIH基因敲除的對蝦體長增加，并且發(fā)育時間縮短。同時，EcMIH的敲除沒有引起諸如早期死亡或畸形的健康問題。使得CRISPR / Cas9 技術(shù)在水產(chǎn)育種中也具有廣闊的應(yīng)用前景。

在華中科技大學(xué)水電學(xué)院，黨委統(tǒng)籌，細(xì)化分工，研究工作，羅列清單，各司其責(zé)，分層指導(dǎo)，聯(lián)合構(gòu)建關(guān)工委工作大平臺。學(xué)院通過切實加強基層黨建帶動二級關(guān)工委的建設(shè)，黨政工橫向合力，黨委書記、分管學(xué)生思政副書記、離退休支部書記、老協(xié)負(fù)責(zé)人，以及工會主席齊抓共管，將關(guān)工委工作納入各自日常工作；通過抓關(guān)鍵人，抓書記、抓執(zhí)行主任，構(gòu)建二級關(guān)工委工作平臺，打造品牌固化成果；不斷完善青年學(xué)生志愿者流動服務(wù)制度，加強研討影響老同志參與關(guān)工委工作的因素和新時代大學(xué)生的要求，發(fā)揮老同志余熱，著力培養(yǎng)“六有”大學(xué)生。

3 RNA 藥物的發(fā)展與應(yīng)用

寡核苷酸是一類20 個左右堿基的短鏈核苷酸（包括DNA 和RNA）的總稱［48］。寡核苷酸可以很容易地和它們的互補鏈結(jié)合，所以常用來作為探針確定DNA 或RNA 的結(jié)構(gòu)；而其作為藥物候選應(yīng)用的研究則始于大約30 年前，包括了ASO［49］，Aptamer等［50］及近15 年來對各類siRNA 的研究。在這期間，醫(yī)藥工業(yè)界開展了大量的臨床試驗。

3.1 RNA藥物在醫(yī)藥工業(yè)界的發(fā)展與應(yīng)用

早在1998 年美國藥物管理局（FDA）就批準(zhǔn)了其首個基因沉默“反義療法”，一種名為Vitravene（fomivirsen）的藥物，用于治療免疫系統(tǒng)較弱的個體的巨細(xì)胞病毒感染。2013 年，賽諾菲（Sanofi）旗下的健贊公司（Genzyme Corporation）的寡核苷酸藥物Mipomersen 上市，掀起了全球RNA 藥物研發(fā)的熱潮。RNA 藥物將正式加入藥物大軍，成為繼化學(xué)藥物、生物蛋白藥物之后的第三大新藥類型。目前RNA 的藥物主要有4 類：siRNA、ASO、Aptamer 和miRNA。其作用機理如表1。

表1 RNA 的藥物的作用機理

RNA 藥物用途廣泛，可以治療癌癥、傳染病、激素性疾病甚至亨廷頓病等神經(jīng)性疾病，目前全球有多家RNA 藥物研發(fā)公司在進(jìn)行相關(guān)RNA 藥物研發(fā)。2018 年8 月10 日FDA 批準(zhǔn)了阿里拉姆制藥公司（Alnylam）的RNAi 藥物Onpattro（主要成分為Patisiran），其通過靜脈注射用于治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（Hereditary transthyretin-mediated，hATTR）引起的神經(jīng)損傷。這是美國上市的第一個RNAi藥物、也是第一個上市用于治療hATTR的藥物。該藥將成為RNAi 現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)整整20 年以來上市的首款RNAi 藥物［53］。

盡管RNA 藥物的研發(fā)已有30 年歷史，但目前市場上被批準(zhǔn)生產(chǎn)的RNA 相關(guān)藥物卻很少（表2），而相關(guān)的用于農(nóng)業(yè)病害防治的RNA 藥物就更少了。

3.2 RNA農(nóng)藥在重要經(jīng)濟農(nóng)作物害蟲方面的研究與應(yīng)用

小分子RNA 是RNA 藥物的核心。目前主要是基于RNA 干擾技術(shù)和最新的CRISPR/Cas9 技術(shù)，兩者都能用于抑制特定基因，阻止病害生物進(jìn)行相關(guān)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)。一些研究表明，dsRNA 可以通過人工飼料喂養(yǎng)昆蟲或在轉(zhuǎn)基因寄主植物中表達(dá)，導(dǎo)致目標(biāo)物種的死亡［61-62］。目前研究和開發(fā)的重點是抗經(jīng)濟作物的重要害蟲，包括西方玉米根蟲（Diabrotica virgifera virgifera，WCR），南方玉米根蟲（Diabrotica undecimpunctata howardii，SCR）、科羅拉多馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）［61］、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）［63］、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）［64］和褐飛虱（Nilaparvata lugens）［65］的RNA 藥物。玉米根蟲是北美最主要的農(nóng)業(yè)害蟲之一，其幼蟲侵食玉米根部，引起玉米枯萎死亡，造成重大的經(jīng)濟損失。早在2003 年孟都山公司就進(jìn)行大量投資，研發(fā)抗玉米根蟲的產(chǎn)品?；赗NA 干擾技術(shù)，設(shè)計出Snf7直向同源物（DvSnf7）的dsRNA 來防治玉米根蟲。有研究對DvSnf7 RNA 進(jìn)行了詳細(xì)的生態(tài)風(fēng)險評估，表明其具有針對西方玉米根蟲的靶向活性，與對照相比對生態(tài)不造成影響［66］。且對其他昆蟲如DvSnf7的dsRNA 喂養(yǎng)的蜜蜂幼蟲和成蟲均未有任何不良影響［67］。2017 年6 月15 日美環(huán)保署批準(zhǔn)了第一個以RNA 干擾技術(shù)為基礎(chǔ)的一種特殊殺蟲劑＜DvSnf7 dsRNA。這是RNA 藥物正式應(yīng)用在農(nóng)業(yè)的首例。與傳統(tǒng)殺菌劑需要噴施不同，該技術(shù)通過將DvSnf7 dsRNA 編碼信息加入到SmartStax Pro 轉(zhuǎn)基因玉米中。當(dāng)西方玉米根蟲開始取食植物時，這種植物自己產(chǎn)生的dsRNA 能夠干擾玉米根蟲的Snf7 基因，進(jìn)而殺死害蟲。當(dāng)施用于土壤時，DvSnf7 RNA 會迅速降解，不會在環(huán)境中持續(xù)存在或積累［68］。DvSnf7 dsRNA的快速降解為未來基于RNA 的農(nóng)產(chǎn)品的生態(tài)安全提供了依據(jù)。有研究將dsRNA 摻入水和沉積物的水柱中模擬未結(jié)合的dsRNA 或噴霧至植物組織引起的漂移，測定dsRNA 在水柱中的消散和分配至沉淀物的動態(tài)情況。發(fā)現(xiàn)dsRNA 在水柱中快速消散，并在96 h 后低于檢測限，表明在分配到沉積物之前dsRNA已經(jīng)在水柱中快速降解［69］。與轉(zhuǎn)基因作物和化學(xué)農(nóng)藥不同的是，此類RNA 噴劑僅僅是讓小分子的干擾RNA 覆蓋在作物表層，殺死食用作物的害蟲，整個技術(shù)也只是在基因表達(dá)的水平上進(jìn)行調(diào)控，不對植物基因進(jìn)行修飾，同時，RNA 干擾引起的基因沉默效應(yīng)通常只會持續(xù)幾天或者幾周，不會出現(xiàn)毒素的累積。RNA 藥物具有高效性、特異性，且不污染環(huán)境，無殘留，因此具有很高的實用價值。

表2 已被批準(zhǔn)上市生產(chǎn)RNA 相關(guān)藥物

4 核酸藥物基礎(chǔ)技術(shù)在抑制水產(chǎn)病毒中的應(yīng)用

4.1 RNAi參與動物的天然抗病毒防御機制

大多數(shù)生物在進(jìn)化過程中已經(jīng)發(fā)展出幾種防御機制來感知和對抗病毒的感染。其中包括干擾素（Interferon，IFN）介導(dǎo)的［70］及如前所述的基于RNAi 的抗病毒機制［71］。

在病毒基因組中通常是在病毒復(fù)制期間產(chǎn)生的dsRNA 被宿主識別為與病毒感染相關(guān)的分子模式，誘導(dǎo)一系列免疫反應(yīng)［72］。在脊椎動物細(xì)胞中，長dsRNA 的引入通常誘導(dǎo)先天性免疫反應(yīng)，構(gòu)成限制病毒復(fù)制的第一道防線［73］。病毒的dsRNA 在細(xì)胞內(nèi)存在激活Toll 樣受體3（TLR3）途徑以及dsRNA識別蛋白（dsRNA 依賴性蛋白激酶PKR 和20-50 寡腺苷酸/核糖核酸酶L），導(dǎo)致RNA 轉(zhuǎn)錄物的非特異性降解，即IFN 反應(yīng)的產(chǎn)生和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的整體關(guān)閉［74］。

由激活I(lǐng)FN 途徑引起的非特異性抑制效應(yīng)最初阻礙了RNAi 在脊椎動物細(xì)胞中的應(yīng)用。Elbashir等［51］后來解決了這個問題，他們發(fā)現(xiàn)siRNA（大約20-25 bp）而不是長dsRNA（＞ 30 bp）可有效地敲低特定基因的轉(zhuǎn)錄物的量而不激活I(lǐng)FN 系統(tǒng)。因為高濃度的siRNA 被證明可以激活I(lǐng)FN 系統(tǒng)的成分故經(jīng)常推薦使用最小的有效siRNA 劑量［75-76］。

4.2 抑制鯉皰疹病毒

皰疹病毒是有囊膜的雙鏈線性DNA 病毒，感染對象包括哺乳動物、兩棲類和魚類等脊柱動物。鯉皰疹病毒屬包含感染鯉魚的I 型、II 型和Ⅲ型鯉皰疹病毒。Gotesman 等［78］在感染Ⅲ型鯉皰疹病毒的鯉魚腦細(xì)胞中采用siRNA 抑制與Ⅲ型鯉皰疹病毒（Cyprinid herpesvirus Ⅲ，CyHV-3）復(fù)制相關(guān)的胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）和DNA 聚合酶（DNA polymerase，DP）的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，用靶向TK或DP基因的siRNA 處理感染了病毒的CCB 細(xì)胞能夠減少病毒顆粒的釋放，進(jìn)而抑制CyHV-3 病毒的感染。在2016 年，Zhao 等［79］通 過CRISPR/Cas9 技術(shù)也對CyHV-3 病毒的基因TK和DP進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Cas9-TK 能夠抑制細(xì)胞中病毒DNA 的復(fù)制，但不能阻斷病毒的釋放；而Cas9-DP 誘導(dǎo)的病毒抑制作用雖然不如Cas9-TK 的效果強，但它卻能阻斷CyHV-3 病毒的釋放，證實了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在防治CyHV-3病毒方面的有效性。

4.3 抑制對蝦白斑綜合癥病毒

有幾項研究表明，在病毒攻擊之前施用病原體特異性dsRNA/siRNA 可以顯著防止幾種病毒種類如黃頭病毒（Yellow head virus，YHV）［80-81］；桃拉綜合征病毒（Taura syndrome virus，TSV）［82-83］和對蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）［84-85］的復(fù)制。

WSSV 病毒是一種雙鏈環(huán)狀DNA 桿狀型病毒，一旦感染對蝦，病毒顆粒會遍布蝦的體表和大多數(shù)組織并在血淋巴中無處不在地循環(huán)，病毒感染后3-7 d 內(nèi)蝦的死亡率可高達(dá) 100%。WSSV 基因組測序揭示了其為292 967 個堿基對構(gòu)成的環(huán)狀序列［86］。WSSV 病毒粒子由5 個主要的和約13 個次要的蛋白組成［87］。Xu 等［88］用一種特異性的21 bp 短干擾RNA（vp28-siRNA）處理感染W(wǎng)SSV 病毒的對蝦發(fā)現(xiàn)，其能有效地降低感染W(wǎng)SSV 的蝦的死亡率。在3 次注射vp28-siRNA 后，病毒可從被感染的蝦體內(nèi)被完全根除。序列特異性的vp28-siRNA 對vp28 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的抑制導(dǎo)致病毒DNA 復(fù)制的抑制或延遲，表明VP28 蛋白參與蝦的WSSV 感染。Alenton等［89］利用RNAi 技術(shù)去干擾WSSV 基因的非結(jié)構(gòu)蛋白VP9 的功能，發(fā)現(xiàn)用VP9-dsRNA 和GFP-dsRNA注射的WSSV 感染的蝦分別顯示出80%和70%的存活率，相比之下，在25 dpi（Days post infection，感染后天數(shù)）時PBS 注射的蝦的存活率為0%。使用較高的病毒濃度重新同時感染存活的蝦和PBS 對照組未感染的新蝦，與GFP-dsRNA 和PBS 組相比，VP9-dsRNA 的存活率為67%，而GFP-dsRNA 和PBS組的存活率為0%。表明VP9 基因在WSSV 的復(fù)制中發(fā)揮重要作用，能抑制WSSV 的感染，可開發(fā)為RNAi 治療WSSV 感染的蝦的有效靶基因。

4.4 抑制虹彩病毒

真鯛虹彩病毒（Red seabream iridovirus，RSIV）屬于虹彩病毒科中的虹彩病毒屬，是一種雙鏈DNA病毒。該病毒基因組編碼一個主衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）基因和92 個特定的開放讀碼框架［90］，能感染真鯛等海水養(yǎng)殖魚類，造成較大的經(jīng)濟損失。目前對真鯛虹彩病毒還沒有很好的治療方法，因此很有必要研究一種新的途徑來抑制真鯛虹彩病毒的復(fù)制。Dang 等［91］針對真鯛虹彩病毒的MCP 基因設(shè)計siRNA（siR-MCP），用不同濃度的siR-MCP 或MCP 轉(zhuǎn)染感染RSIV 病毒的比目魚胚胎細(xì)胞（Hirame natural embryo，HINAE）發(fā)現(xiàn)，其對MCP mRNA 的表達(dá)有顯著的影響，在病毒感染后84 和96 h，siR-MCP 分別使MCP 基因的表達(dá)降低了55.2%和97.1%，同時可檢測到RSIV 的復(fù)制量的下降。siR-MCP 使MCP 基因的表達(dá)下降有效地和特異性地抑制了RSIV 復(fù)制，并阻礙細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中病毒的產(chǎn)生，充分說明RNAi 抗真鯛虹彩病毒的高效性。

虎紋蛙虹彩病毒（Iridovirus-tiger frog virus，TFV）屬于虹彩病毒科、蛙病毒屬。主要感染蛙類，導(dǎo)致其大量死亡，造成重大的經(jīng)濟損失。由于虎紋蛙虹彩病毒免疫原性很低，常規(guī)的疫苗接種效果一般都不理想。RNAi具有高效降解同源mRNA 的特點，能有效地解決疫苗接種效果差的問題。Xie 等［92］通過表達(dá)的靶向MCP基因的siRNA 轉(zhuǎn)染已感染TFV病毒的肥頭鯉（Fathead minnow，F(xiàn)HM）肌肉細(xì)胞，通過定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)MCP 的mRNA 表達(dá)水平降低、出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)推遲、細(xì)胞中TFV 滴度和病毒顆粒減少，表明靶向MCP基因的siRNA 的方法能有效抑制魚類細(xì)胞中的TFV 復(fù)制，為養(yǎng)殖鯉魚病毒的治療提供了潛在的方法。

4.5 抑制草魚呼腸孤病毒

草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）為無囊膜病毒，該病毒的二十面體衣殼含有由11 個片段組成的線性雙鏈RNA 基因組，共編碼7 種結(jié)構(gòu)蛋白和5 種非結(jié)構(gòu)蛋白。草魚呼腸孤病毒是危害性最大的草魚病原體，能引起草魚病毒性出血，常在水溫25-30℃感染當(dāng)年生的草魚種，死亡率高。

Ma 等［93］在感染GCRV 病毒的草魚腎細(xì)胞系（Ctenopharyngodon idelluskidney cell，CIK）中，針對草魚呼腸孤病毒的連接黏附受體-A（Junctional adhesion molecule-A，JAM-A） 的DNA 序列用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)進(jìn)行特異性的敲除發(fā)現(xiàn)，其能有效地抑制多種不同基因型的GCRV，表明草魚JAM-A 對于GCRV 的感染是必需的，而特異性地敲除JAM-A 能有效地抑制病毒，是控制草魚呼腸孤病毒的一種潛在方法。

5 在寄生蟲防治的應(yīng)用

在寄生蟲病防治方面，通過RNAi 分析寄生蟲基因功能不僅可以用來研究寄主與寄生蟲之間的相互作用，而且還可以用來探索特定基因?qū)纳x存活的影響。Ohashi 等［94］首次在新貝尼登蟲（Neobenedenia girellae）通過浸泡dsRNA 來介導(dǎo)血管相關(guān)基因vlg1 和vlg2 的沉默發(fā)現(xiàn)，能降低該寄生蟲的孵化率，證實RNAi 能成功干擾新貝尼登蟲基因，也可用來研究寄生蟲基因的功能。有研究采用RNAi技術(shù)針對魚虱幾丁質(zhì)酶2（Chitinases 2，Chi2）基因和血紅素過氧化物酶（Heme peroxidase 1，HPX1）基因的進(jìn)行干擾發(fā)現(xiàn)，均能降低魚虱幼蟲運動能力、降低其對宿主的感染能力［95］。這些研究有助于鑒定和驗證新的抗寄生蟲藥的靶標(biāo)和進(jìn)一步發(fā)展基于RNAi 的水產(chǎn)抗寄生蟲藥物。

自從發(fā)現(xiàn)CRISPR 技術(shù)以來，在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域，CRISPR / Cas9 技術(shù)的使用一直在迅速發(fā)展。Peng 等［96］通過用Cas9 編碼質(zhì)粒和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA 共轉(zhuǎn)染克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi）證明了CRISPR / Cas9 系統(tǒng)在寄生蟲領(lǐng)域的可行性。目前CRISPR / Cas9 已成功地適應(yīng)許多寄生蟲系統(tǒng)，包括弓形蟲（Toxoplasma gondii）［97］、隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）［98］和陰道毛滴蟲（Trichomonas vaginalis）［99］。

Crawford 等［100］通過用重組SpCas9，體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA 和200 個核苷酸的單鏈寡脫氧核苷酸（用于DNA 修復(fù)）轉(zhuǎn)染惡性瘧原蟲，實現(xiàn)了惡性瘧原蟲的基因組編輯。但是，這項研究報道只有23%的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了正確編輯的寄生蟲。Shrivastava 等［101］使用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)刪除利什曼原蟲（Leishmaniaspp）前鞭毛體中的單個LeishIF4E-3基因，產(chǎn)生具有降低LeishIF4E-3表達(dá)的異源缺失突變體。該突變體表現(xiàn)出新生蛋白合成和生長動力學(xué)的下降、形態(tài)的改變和感染性的減弱。

目前有效治療弓形蟲感染的藥物只有磺胺類藥物，但由于磺胺類藥物不僅副作用大，還無法有效治療隱形感染階段的幼蟲，因此需要一種新的有效藥物來代替。Zheng 等［102］利用CRISP/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除編碼弓形蟲的亮氨酸氨基肽酶基因后能影響弓形蟲的生長復(fù)制，雖未能完全阻斷寄生蟲的發(fā)育、毒力或酶活性，但對弓形蟲入侵宿主細(xì)胞起到了重要的抑制作用，可以作為用來治療弓形蟲病的輔助藥物靶標(biāo)。對寄生蟲疫苗的研究仍處于早期階段，迄今尚未有成功的方法來生產(chǎn)有效的市售疫苗來防治魚類寄生蟲。

6 結(jié)語

水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治主要有藥物防治、微生態(tài)制劑、免疫預(yù)防，以及最近新興的RNA 生物農(nóng)藥治療等方法。但其中可使用的疫苗或有效藥物非常有限。常規(guī)的藥物防治以化學(xué)農(nóng)藥和抗生素為主，雖然具有防治方法簡便、可控性好等優(yōu)點，但潛在的風(fēng)險也大，藥物殘留問題引起各種食品安全以及對生態(tài)環(huán)境的破壞等問題。微生態(tài)制劑不僅克服了有毒物質(zhì)在動物體內(nèi)的累積，而且還能提高養(yǎng)殖對象的免疫力。但目前大多數(shù)微生態(tài)制劑還是為陸地動物設(shè)計的。免疫預(yù)防現(xiàn)階段只停留在實驗?zāi)Ｊ诫A段，目前在水產(chǎn)方面的商品化疫苗只有草魚出血病滅活疫苗，但通過疫苗來進(jìn)行免疫預(yù)防需要進(jìn)行逐一注射，耗時費力。已經(jīng)有學(xué)者提出，基于RNAi 的RNA 藥物可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖以對抗由病毒和寄生蟲引起的各類疾病［103-104］。RNA 藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中與傳統(tǒng)化學(xué)藥物相比具有以下優(yōu)勢：（1）不會以任何形式改變宿主的遺傳結(jié)構(gòu)；（2）具有可以生物降解的優(yōu)點，在野外會迅速分解；（3）克服了動物體內(nèi)有毒物質(zhì)的積累，在提高動物特異性免疫水平的同時亦能增強機體的抗應(yīng)激能力；（4）符合不污染環(huán)境、水產(chǎn)食品無藥物殘留的要求。此外，RNA藥物還具有如下的優(yōu)勢：（1）易于構(gòu)建、制備和大量生產(chǎn)。Ongvarrasopone 等［105］使用RNaseIII 缺陷型大腸桿菌菌株（HT115）提出了一種簡單而經(jīng)濟的體內(nèi)生成大量dsRNA 的系統(tǒng)。通過該方法，表達(dá)dsRNA 的細(xì)菌可以通過純化步驟以分離所需的dsRNA，或者直接摻入到顆粒飼料中經(jīng)口服遞送。基于該方法，Saksmerprome 等［106］修改后也成功生產(chǎn)了大量的穩(wěn)定的基于載體的發(fā)夾dsRNA。目前認(rèn)為經(jīng)口服遞送是RNA 藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中最可行的遞送方法［107］。（2）特異性；（3）本身具有佐劑的功效［108-109］。RNAi 和CRISPR/Cas 介導(dǎo)的干擾［110］，以及使用小分子促進(jìn)內(nèi)源宿主對病毒感染的反應(yīng)［111-112］是處理水生醫(yī)學(xué)疾病的強大新興治療策略。

目前在水產(chǎn)方面的RNA 藥物尚未發(fā)展出商品化的藥物，但在抗水產(chǎn)動物病原的實驗研究階段已出現(xiàn)了很好的前景，進(jìn)一步的深入研究有可能研發(fā)出可克服成本高，很難大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛的推廣應(yīng)用的困難，為水產(chǎn)業(yè)的病害防治提供一條新的解決途徑。