BMSCs對IRI大鼠腎小管病理、ROCK蛋白水平的影響

孫瑞華，都 渝，鮑巧玲

急性腎衰竭(Acute Renal Failure，ARF)在臨床上非常多見，占ICU的10%～30%，雖然腎臟替代治療技術(shù)有了很大的提高，但在過去的10年內(nèi)病死率仍然在50%以上[1]。缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury，IRI)是臨床上導(dǎo)致缺血性ARF的主要原因之一，在腎移植過程中IRI不可避免，且會影響術(shù)后腎功能恢復(fù)，引起急、慢性排斥反應(yīng)，也會影響移植物長期的存活[2]，因此，研究IRI的病理生理過程，探索其中的分子生物學(xué)機制，尋找有效的保護和干預(yù)措施具有重要意義[3]。Gholamreza等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在心臟、肝臟、腎臟和肺中注入骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)可減輕器官的IRI。BMSCs和其它細胞相比獲得的渠道更廣，并且分離后更容易傳代培養(yǎng)[5]。Zare等[6]證實，BMSCs可有效的治療腎小管損傷，主要的治療機制為BMSCs能分化腎小管的上皮細胞，并且促進腎內(nèi)細胞的增殖，從而改變細胞因子的環(huán)境和旁分泌水平。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho Associated Coiled Coil Forming Protein Kinase，ROCK)又稱Rho激酶，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，與Rho組成Rho/ROCK信號[7]，研究發(fā)現(xiàn)ROCK與干細胞生物學(xué)密切相關(guān)[8]。ROCK信號活化在干細胞的增殖、遷移、分化及干性維持等方面發(fā)揮重要作用[9]。研究顯示[10]，ROCK信號主要與BMSCs的成骨分化、角化細胞分化、神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和遷移有關(guān)，而ROCK在腎組織中的表達還尚不明確，本研究建立腎IRI大鼠模型，對模型大鼠進行BMSCs移植，分析其對大鼠的腎小管病理影響，觀察ROCK蛋白在腎組織中的表達并分析BMSCs對ROCK蛋白的調(diào)控情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 本實驗所用雄性大鼠共30只，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可：SCXK(粵)2013-0002。所有大鼠均健康沒有任何疾病，體質(zhì)量在180～200 g之間，大鼠常溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 試劑和儀器 ROCK抗體(美國Sigma公司)；DMEM-F12、10%胎牛血清(美國Gibco公司)；DAPI、TUNEL檢測試劑盒(上海羅氏制藥有限公司)；電熱恒溫水浴箱(北京長安科學(xué)儀器廠)；圖像掃描儀(美國A1pha公司)。

1.3 BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定和標記 分別取出大鼠的股骨和脛骨的骨髓，用Percoll分離液進行分離，全部過程要求在無菌條件下進行。用胎牛血清的DMEM-F12懸浮液將細胞懸浮，放置在37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。48 h后，棄掉未貼壁的細胞，當所有的細胞長到80%時，將細胞進行消化并轉(zhuǎn)代，進行擴增培養(yǎng)，多次進行傳代后對細胞進行純化處理。流式細胞儀檢測第三代細胞CD34、CD44、CD45和CD166的表達，細胞活力采用臺盼籃染色方法進行測定。取出3～6代大鼠的BMSCs后，加入無菌DAPI，最終的濃度為50 mg/mL，37 ℃孵育30 min后進行離心處理，用PBS溶液進行洗滌，6次后將沒有完全結(jié)合的DAPI全部除去。收集離心后的細胞用無血清的DMEM-F12進行稀釋，將稀釋后的細胞用熒光顯微鏡觀察，當DAPI顯示為藍色熒光時，冰浴保存，1 h后將細胞注入到大鼠的體內(nèi)。

1.4 動物分組與模型建立 把實驗所用的30只健康大鼠隨機分為三組，sham組為假手術(shù)組，IRI組為腎IRI大鼠模型組；BMSCs組為腎IRI大鼠模型加BMSCs干預(yù)組，每組各10只。所有大鼠術(shù)前禁食12 h，用2%的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，大鼠固定在操作臺上，用恒溫加熱墊控制大鼠的體溫保持在37 ℃，沿大鼠的腹部中位線切開，分離大鼠的左側(cè)腎蒂，用無損傷的血管夾阻閉腎蒂，并用定時器進行計時，用4-0絲線進行間斷縫合，暫時關(guān)閉大鼠腹腔。阻斷左側(cè)腎蒂1 h后，把血管夾移除，開放腎動脈血流，可觀察到腎臟迅速或在短時間內(nèi)由暗黑色逐漸變?yōu)轷r紅色，表示再灌注成功。Sham組大鼠除不用血管夾阻閉腎蒂外，其它的手術(shù)步驟同另外兩組相同。手術(shù)后三組大鼠連續(xù)注射3 d青霉素溶液，以防止術(shù)后感染。

再灌注1 h后，將4×106個BMSCs制作成1 mL的細胞懸浮液，經(jīng)大鼠的尾靜脈注射；sham組和IRI組大鼠注射1 mL的生理鹽水，三組大鼠連續(xù)注射7 d進行后續(xù)實驗。

1.5 標本采集 用10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉所有大鼠，每只大鼠取心臟內(nèi)全血3 mL，放置在抗凝管內(nèi)靜置，4 ℃靜置6～8 h，7 000 r/min離心5 min，分離血漿用以檢測血肌酐(Serum Creatinine，SCr)和尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)含量。取部分的腎臟組織，用于大鼠的腎組織病理檢測、細胞增殖、凋亡檢測及蛋白檢測。

1.6 生化指標檢測 分別取出大鼠的血清，對三組大鼠的SCr和BUN進行檢測。用苦味酸法檢測大鼠的SCr水平，酶法測定大鼠的BUN水平，所有的步驟嚴格按照試劑盒的說明書進行。

1.7 腎組織病理學(xué)形態(tài)觀察 對三組大鼠的生化指標檢測后，分別處死大鼠，取出大鼠腎臟組織，用甲醛固定梗死組織，固定24 h后切片，石蠟切片的厚度為4 μm，脫蠟后進行HE染色并觀察。

1.8 免疫組化(SP)檢測腎小管上皮細胞增殖細胞核抗原的表達 將腎組織石蠟包埋后進行切片處理，并對切片組織進行脫蠟和脫水處理，用枸櫞酸緩沖液緩沖后放置在高溫的微波爐中進行修復(fù)，時間為20 min。將山羊血清加入其中，封閉后加入一抗，將其放置在4 ℃的環(huán)境中過夜，然后加入二抗，最后用DAB和蘇木素進行染色，脫水后進行透明處理，用中性樹膠將其封片，最后會發(fā)現(xiàn)呈棕黃色的陽性產(chǎn)物。在高倍顯微鏡下，隨機選取每個切片的20個清晰視野，對增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)陽性細胞進行計數(shù)。PCNA=陽性細胞數(shù)/所有細胞的總數(shù)×100%。

1.9 TUNEL檢測腎小管上皮細胞凋亡 取出大鼠的腎組織，分別切成0.5 cm的塊狀，將塊狀組織固定后用石蠟進行包埋，最后把塊狀的組織進行切片。用TUNEL法把石蠟切片進行染色，所有的步驟按照試劑盒上的說明嚴格進行。每張石蠟切片選取5個不交叉的視野進行觀察，凋亡的心肌細胞為深棕色。

1.10 Western Blot檢測大鼠RhoA和ROCKⅠ蛋白的表達 將三組大鼠的腎組織分別提取100 mg，將細胞進行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在-20 ℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混勻，按照4∶1的比例進行，為了讓蛋白質(zhì)變性需將蛋白溶液全部進行煮沸處置。在電泳板內(nèi)分別注入50 μm的蛋白樣品，把電泳后的樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入脫脂奶粉后封閉，時長為1 h。加入一抗后進行TTBS漂洗，每次漂洗10 min，漂洗3次，最后加入二抗對溶液進行稀釋，常溫的環(huán)境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS每次漂洗10 min，漂洗3次，DAB溶液顯色后數(shù)碼相機照相。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠生化指標比較 IRI組大鼠的生化指標SCr和BUN水平顯著高于sham組(tSCr=7.850，tBUN=23.61，均P<0.001)；BMCSs組大鼠的SCr和BUN水平明顯低于IRI組大鼠(tSCr=6.031，tBUN=12.58，均P<0.001)，表1，圖1。

表1 三組大鼠SCr和BUN生化指標比較

圖1 三組大鼠SCr和BUN生化指標比較與sham組比較，*P<0.05；與IRI組比較，#P<0.05

2.2 三組大鼠的腎組織病理學(xué)形態(tài)比較 Sham組大鼠的腎小管和腎小球的結(jié)構(gòu)沒有任何損傷現(xiàn)象。與sham組比較，IRI組大鼠的腎小管出現(xiàn)了嚴重損傷，腎小管的官腔有明顯的擴張現(xiàn)象，腎小管上皮細胞也出現(xiàn)了腫脹和壞死現(xiàn)象，管型呈紅細胞或顆粒狀，腎間質(zhì)有大量的出血和水腫。和IRI組大鼠比較，BMSCs組大鼠的腎單位損傷較輕，腎組織情況得到了明顯的改善，圖2。

圖2 三組大鼠腎組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)

2.3 三組大鼠腎小管上皮細胞PCNA的比較 和sham組比較，IRI組大鼠PCNA陽性表達顯著降低(t=5.774，P<0.001)；BMSCs組大鼠的陽性細胞數(shù)量顯著多于IRI組大鼠(t=3.979，P<0.001)，提示BMSCs能有效的促進腎小管上皮細胞的增殖，加快腎臟組織修復(fù)，圖3、圖4。

圖3 三組大鼠免疫組化染色比較腎小管上皮細胞增殖(免疫組化染色，×400)

圖4 三組大鼠PCNA陽性表達比較與sham組比較，*P<0.05；與IRI組比較，#P<0.05

2.4 三組大鼠腎小管上皮細胞凋亡 與sham組比較，IRI組大鼠腎小管上皮細胞出現(xiàn)大量的凋亡(t=14.80，P<0.001)；BMSCs組大鼠腎小管上皮細胞的凋亡數(shù)量得到顯著抑制(t=9.079，P<0.001)，圖5、圖6。

圖5 三組大鼠腎小管上皮細胞凋亡(TUNEL染色，×400)

圖6 三組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況比較與sham組比較，*P<0.05；與IRI組比較，#P<0.05

2.5 Western Blot檢測大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表達比較 與sham組大鼠的比較，IRI組表達顯著增加(tRhoA=3.631，tROCKⅠ=3.258，均P<0.05)；BMSCs組大鼠的RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表達顯著低于IRI組(tRhoA=2.543，tROCKⅠ=2.627，均P<0.05)，圖7、圖8。

圖7 三組大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表達

圖8 三組大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表達比較與sham組相比較，*P<0.05；與IRI組比較，#P<0.05

3 討論

IRI是指組織缺血后的再灌注不能緩解組織損傷，反而加重組織結(jié)構(gòu)破壞和代謝障礙，其可能的機制有氧自由基生成、能量代謝障礙、炎性遞質(zhì)含量和活性改變等[11]。腎臟急性IRI是發(fā)生急性腎功能衰竭的重要危險因素，急性腎功能衰竭致死率高，治愈率低，一部分患者在治療后會長期存在腎功能不全或發(fā)展至終末期腎病[12]。缺血和缺氧等多種因素都會引起腎小管損傷，當腎小管上皮細胞內(nèi)聚集大量的代謝終產(chǎn)物或者外源性的化學(xué)物質(zhì)時，會引發(fā)細胞的毒性反應(yīng)，損傷腎小管功能，嚴重時會導(dǎo)致腎小管出現(xiàn)急性壞死，甚至導(dǎo)致腎功能衰竭[13]。所以，在臨床上找到有效治療腎臟IRI的方法是目前的研究熱點。BMSCs是成體干細胞中的一種，目前己被證實在組織損傷中具有良好的保護作用。本研究建立腎臟IRI大鼠模型，移植BMSCs干預(yù)后觀察大鼠腎小管病理改變，以及腎組織中ROCK蛋白的表達。

腎臟功能會隨著腎臟IRI的發(fā)生而降低，而機體血清中BUN和SCr的水平能有效的反應(yīng)腎功能變化[14]。腎小球的濾過率會隨著腎功能不全而逐漸降低，腎小管重吸收和分泌功能出現(xiàn)障礙會聚集過多的含氮代謝產(chǎn)物，進而會增加血液中非蛋白氮含量。本研究結(jié)果顯示，IRI組大鼠的SCr水平和BUN水平顯著增高；BMCSs組大鼠的SCr和BUN水平明顯低于IRI組大鼠。提示，BMSCs可有效抑制IRI大鼠血液中非蛋白氮的含量，并且降低BUN水平，從而改善大鼠腎功能。腎組織病理結(jié)果顯示，IRI組大鼠腎小管出現(xiàn)了嚴重損壞，腎小管的官腔有明顯擴張現(xiàn)象，其上皮細胞出現(xiàn)了腫脹和壞死的現(xiàn)象，管型呈紅細胞或顆粒狀，腎間質(zhì)大量出血和水腫。與IRI組大鼠比較，BMSCs組大鼠的腎單位損傷較輕，腎組織情況得到了明顯的改善。提示BMSCs移植對大鼠腎小管結(jié)構(gòu)的破壞有一定的防護作用，同時有效的改善了IRI導(dǎo)致的腎損傷，為BMSCs移植用于臨床治療提供了理論依據(jù)。劉紅等[15]通過對IRI大鼠研究發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)處理后的BMSCs移植，對改善IRI大鼠的腎功能更為有效，同時還能對腎組織損傷進行有效修復(fù)，這種修復(fù)能力可能與其分泌HGF和bFGF等有關(guān)。

真核細胞DNA在合成時需要一種核蛋白，而PCNA就是其中最重要的一種[16]。當細胞在靜置狀態(tài)時，其中PCNA含量非常低；當細胞進入增殖周期時，PCNA表達會顯著增高，所以可以用PCNA的表達來反應(yīng)細胞的增值狀態(tài)，細胞增值的活躍程度也可以用PCNA表達的高低來反映[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植后該組大鼠的PCNA陽性細胞數(shù)量顯著增加。王志劍等[18]通過對急性缺血腎損傷的大鼠研究發(fā)現(xiàn)，移植BMSCs后大鼠腎小管上皮細胞PCNA陽性細胞數(shù)量顯著多于對照組，PCNA是評價細胞增殖狀態(tài)的一個較為成熟的指標，因此，提示BMSCs移植可以促進缺血性損傷后腎小管細胞的增殖，更有助于缺血性損傷后腎小管結(jié)構(gòu)完整性的維持與修復(fù)。

Rho激酶是參與細胞運動的主要激酶之一，調(diào)節(jié)細胞的分裂、遷移、分泌等活動。Rho高表達和過度激活與許多心臟、腎臟血管疾病密切相關(guān)，ROCK是最早發(fā)現(xiàn)的Rho效應(yīng)物，在分子水平，ROCK表達上調(diào)促進炎癥、氧化應(yīng)激、血栓形成和纖維化的各種因子，下調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶。在細胞水平ROCK介導(dǎo)血管平滑肌細胞收縮，促進增殖和遷移；在腎臟中主要以ROCK-Ⅰ形式存在，ROCK-Ⅰ抑制劑能抑制腎臟纖維化，進而改善IRI。本研究結(jié)果顯示，與sham組大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表達比較，IRI組大鼠的表達顯著增加；BMSCs組大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表達顯著低于IRI組?？梢?，移植BMSCs可有效的抑制RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表達，從而保護腎臟IRI。李忠偉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植和Rho/Rock信號通路阻斷劑均可促進脊髓修復(fù)及神經(jīng)功能的恢復(fù)，且BMSCs移植聯(lián)合Rho/Rock信號通路阻斷劑具有更好的療效，兩者之間存在一定的協(xié)同效應(yīng)。孟建中等[20]通過對IRI大鼠研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Rho/Rock信號通路可有效的改善IRI內(nèi)皮免疫微環(huán)境，減輕腎組織損傷。

綜上，BMSCs可有效保護腎臟IRI導(dǎo)致的腎小管損傷，同時抑制腎組織中ROCK蛋白表達，從而對腎臟起到保護作用。