千里光過(guò)氧化氫酶基因序列特征與功能的生物信息學(xué)分析

左青青，錢 露，聞偉鍔，徐德林，劉朝波，錢 剛，李 林

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 第一臨床學(xué)院，貴州 遵義 563099)

過(guò)氧化氫酶(CAT)是植物重要的抗氧化酶類，能清除氧自由基，有效調(diào)節(jié)機(jī)體H2O2含量。在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫、抗病等相關(guān)研究中，CAT被認(rèn)為是響應(yīng)脅迫與抗逆、抗病能力水平的重要指標(biāo)酶。王宏等檢測(cè)接種黑斑病菌的4種梨發(fā)現(xiàn)，抗病品種翠冠和蘇翠1號(hào)梨中CAT活性顯著升高，較感病品種華酥、七月酥CAT活性降低，表明CAT參與梨黑斑病的抗病防御反應(yīng)[1]。近年來(lái)更是在多種植物中證實(shí)，該酶引入或表達(dá)水平提高對(duì)于增強(qiáng)植物多種抗逆能力具有重要作用。在煙草中轉(zhuǎn)入大腸桿菌CAT基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入過(guò)氧化氫酶基因的煙草對(duì)除草劑的抗性增強(qiáng)[2-3]，同時(shí)植物的抗病能力也顯著增加[4]。對(duì)中藥材的研究表明，CAT抗氧化活性與清除自由基是中藥材重要的藥理作用。李超等通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，對(duì)正常組老鼠和碘缺乏組老鼠同時(shí)使用黃芪和黃芪發(fā)酵制劑，觀察老鼠的記憶功能，結(jié)果顯示碘缺乏小鼠較正常小鼠出現(xiàn)明顯的記憶障礙，發(fā)現(xiàn)碘缺乏老鼠的海馬組織中CAT活性明顯降低，表明黃芪對(duì)老鼠的海馬組織的氧化損傷具有保護(hù)作用[5]。因此，對(duì)于常用中藥材中CAT的研究不僅有利于其抗逆能力的解析，也有益于藥用成分、藥理作用的研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.Ex D.Don)又名九英里，菊科(Compositae)，千里光屬，多年生攀援草本植物，是我國(guó)應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)中草藥[6]。千里光始載于《本草拾遺》，性寒、微苦，具有清熱解毒、殺蟲、明目、涼血、生肌、驅(qū)風(fēng)除濕等功效，其藥理學(xué)作用集中體現(xiàn)在抗菌[7]、抗病毒[8]、抗鉤端螺旋體、抗滴蟲[9]、抗氧化[10]及清除自由基活性[11]等方面。目前有關(guān)過(guò)氧化氫酶基因結(jié)構(gòu)、功能的報(bào)道很多，但在菊科千里光屬植物鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用多種生物信息學(xué)分析方法，對(duì)千里光過(guò)氧化氫酶功能與蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為千里光抗氧化活性等方面的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 植物材料為采自于貴州遵義地區(qū)的野生千里光。

1.2 千里光轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 采取千里光新鮮葉片，采用TRIzol法提取Total RNA，SMART方法構(gòu)建千里光全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)[12]，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序(華大基因完成)，所得clean reads經(jīng)Trinity軟件進(jìn)行從頭組裝，去冗余等得到千里光轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 生物信息學(xué)分析千里光CAT序列 根據(jù)測(cè)序得到的核苷酸序列運(yùn)用NCBI的ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)分析核苷酸序列的開放閱讀框；采用ExpasyProt Param(https://web.expasy.org/protparam)分析過(guò)氧化氫酶的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、不穩(wěn)定系數(shù); 利用 ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)在線軟件預(yù)測(cè)千里光CAT蛋白親水疏水性；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)預(yù)測(cè)過(guò)氧化氫酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并用軟件SWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/repository)建立三維結(jié)構(gòu); 使用在線軟件Pfam(http://pfam.xfam.org/search/sequence)預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域，應(yīng)用在線工具PSORT Ⅱ Prediction(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)預(yù)測(cè)過(guò)氧化氫酶核苷酸序列的亞細(xì)胞定位；通過(guò)Signalp 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)該酶中是否存在信號(hào)肽；利用NET PHOT3.1(https://www.cbs.dtu.dk/services/netphos/)及NetOGlyc 4.0server(https://www.cbs.dtu.dk/services/netOGlyc/)預(yù)測(cè)該酶的磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)；運(yùn)用DNAMAN(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行多物種氨基酸序列比對(duì)，并使用MEGA6.0軟件的鄰接法(Neighbo-joining)構(gòu)建多物種的系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 千里光過(guò)氧化氫酶理化性質(zhì)特征與親疏水性分析 千里光過(guò)氧化氫酶基因的序列全長(zhǎng)為1 521 bp，ORF finder查找開放閱讀結(jié)果顯示該序列全長(zhǎng)1 521 bp，共編碼506個(gè)氨基酸；使用ExpasyProt Param 軟件預(yù)測(cè)顯示千里光過(guò)氧化氫酶由20種氨基酸組成，其中Ala和 Thr含量最高，占比27.5%、28.1%，其次是Cys和Gly，分別占比23.1%、21.4%，不含Pyl和Sec；該蛋白分子量為127,644.42 Da，理論等電點(diǎn)(pI)為4.98，原子組成為C4665H7811N1521O1949S351，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)：0，帶正電殘基總數(shù)(Arg+Lys)：0；該酶的半衰期4.4 h；不穩(wěn)定系數(shù)為48.56，表明該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，屬于不穩(wěn)定蛋白(根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)>40以上屬于不穩(wěn)定蛋白)。

在線軟件ProtScale預(yù)測(cè)千里光cat基因序列的親水性和疏水性，負(fù)值越大代表親水性越強(qiáng)，正值越大代表疏水性越強(qiáng)，結(jié)果顯示千里光CAT的親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸(見(jiàn)圖1)。

數(shù)值超過(guò)0表示氨基酸為疏水性氨基酸，不超過(guò)0表示氨基酸為親水性氨基酸。

2.2 千里光CAT二級(jí)與三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 二級(jí)結(jié)構(gòu)與三維結(jié)構(gòu)對(duì)酶發(fā)揮生物學(xué)功能具有重要作用。本研究利用SOPMA軟件分析千里光過(guò)氧化氫酶的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該酶主要的結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，其中256個(gè)氨基酸殘基(50.59%)為無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(Random coil),是最大量的結(jié)構(gòu)原件，133個(gè)氨基酸殘基(26.28%)為α-螺旋結(jié)構(gòu)(Al-pha helix)，86個(gè)氨基酸殘基(占17%)為線性結(jié)構(gòu)(Extended strand)，31個(gè)氨基酸殘基(占6.13%)為β-轉(zhuǎn)角(Beta turn),見(jiàn)圖2。從分布位點(diǎn)上來(lái)看，C端和N端均含有α-螺旋，無(wú)規(guī)則卷曲貫穿整個(gè)蛋白質(zhì)，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。利用軟件SWISS MODEL對(duì)千里光CAT建模，可知該酶結(jié)構(gòu)錯(cuò)綜復(fù)雜，螺旋結(jié)構(gòu)、無(wú)規(guī)則卷曲占據(jù)整個(gè)三維結(jié)構(gòu)的主要部分，與二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占主要結(jié)構(gòu)的結(jié)果相符(見(jiàn)圖3)。

藍(lán)色代表α-螺旋結(jié)構(gòu)，綠色代表β-轉(zhuǎn)角，紫色代表無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，紅色代表線性結(jié)構(gòu)。

圖3 千里光CAT三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 千里光CAT結(jié)構(gòu)域與信號(hào)肽的預(yù)測(cè) 結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是功能活性的中心部位。利用在線工具Pfam預(yù)測(cè)千里光過(guò)氧化氫酶氨基酸序列結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示過(guò)氧化氫酶結(jié)構(gòu)域位于第32個(gè)氨基酸殘基到第411個(gè)氨基酸殘基之間。Signalp 5.0 server預(yù)測(cè)千里光過(guò)氧化氫酶的信號(hào)肽結(jié)果顯示，該酶顯示不含信號(hào)肽(見(jiàn)圖4)，表明它是由游離的核糖體合成后進(jìn)入胞質(zhì)溶膠的蛋白質(zhì)。

圖4 千里光CAT信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.4 千里光CAT的亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn) 不同的亞細(xì)胞定位決定了植物不同的特異的生物學(xué)功能。采用PSORT Ⅱ?qū)ηЮ锕釩AT的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示CAT在細(xì)胞質(zhì)機(jī)率占52.2%，在細(xì)胞核中占26.1%，在線粒體中占17.4%，在細(xì)胞支架上僅占4.3%，表明該酶主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。

磷酸化和糖基化作用是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的重要實(shí)現(xiàn)方式，幾乎植物整個(gè)生命活動(dòng)中均有這兩種方式的參與。在蛋白質(zhì)翻譯合成中，磷酸化和糖基化具有重要修飾作用，其中絲氨酸、蘇氨酸、絡(luò)氨酸是磷酸化的主要結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)NetPhot 3.0及NetoGlyc 4.0對(duì)磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示千里光CAT磷酸化位點(diǎn)有67個(gè)，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)有18個(gè)，分值占0.942，蘇氨酸(Thr)有7個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分值占0.921，絡(luò)氨酸(Tyr)42個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分值占0.885(見(jiàn)表1)；糖基化位點(diǎn)有156個(gè)。

表1 千里光CAT磷酸化位點(diǎn)檢測(cè)

2.5 千里光CAT氨基酸序列同源性分析 運(yùn)用DNAMAN軟件將千里光CAT氨基酸序列與唐松草、澤蘭、菜薊、艾菊、山茶花、可可粉、山扁桃變種、向日葵、蘋果、枇杷、海島棉、煙草、野茶樹、榴蓮、芝麻、加州丁香樹等33個(gè)物種氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)物種間的CAT氨基酸序列的相似度高，在圖5中顯示黑色和紅色區(qū)域(>75%)占多數(shù)，表明千里光過(guò)氧化氫酶與33個(gè)物種的過(guò)氧化氫酶的氨基酸序列有較高的同源性(>96%)，進(jìn)一步表明過(guò)氧化氫酶基因在不同物種中具有較高的保守性，具有重要的生物學(xué)功能。

XP_024989449.1 山扁桃變種、XP_021976738.1 向日葵、XP_028960187.1 蘋果、AGC65520.1 枇杷、KAA3467156.1 海島棉、XP_019244886.1 煙草、XP_028076166.1 野茶樹、XP_022769370.1 榴蓮、XP_011074092.1 芝麻、AZL93846.1 加州丁香樹、GEX71529.1 艾菊、XP02489450.1 菜薊、QBC35994.1 大丁草、KAD2804630.1 澤蘭、PIA46782.1 耬斗菜、KAE8731430.1木槿、XP022849681.1木犀欖、RAL43212.1 菟絲子、GAV6348.1土瓶草、AAC19397.1水晶花燭、KAB2632020.1刺柏、OMO52152.1 黃麻、XP031374233.1 石榴、XP028098144.1 山菜花、QFE96863.1 芹菜、XP028767778.1 牧豆杉、PQQ11386.1 櫻花、XP034675968.1 葡萄、QKX94683.1 胡楊、NP001310800.1 棗、AUT36476.1 白薯、PSS00391.1 紅豆杉、KAF5180005.1 唐松草、SSb CAT千里光。不同背景顏色表示序列同源性大小：黑色100%，紅色75%，藍(lán)色25%，白色0。

2.6 千里光CAT的系統(tǒng)進(jìn)化分析 為了深入了解千里光CAT與33個(gè)物種CAT之間的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA軟件將千里光CAT與33個(gè)物種采用鄰接法構(gòu)建千里光CAT蛋白序列的進(jìn)化樹，如圖6所示。所選34種植物均可聚為2個(gè)大分支，其中千里光與唐松草、菜薊、向日葵、大丁草、艾菊的過(guò)氧化氫酶屬同一分支，表明千里光在進(jìn)化關(guān)系上與這些物種親緣關(guān)系較近；與丁香樹、棗的分支距離最遠(yuǎn)，表明進(jìn)化上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中向日葵、艾草、菜薊、大丁草為菊科植物，與千里光又分屬于不同亞支，表明在進(jìn)化上千里光與其他菊科植物間有較遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系。

圖6 千里光與其他33種植物的CAT系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

3 討論

過(guò)氧化氫酶是植物體內(nèi)清除氧自由基的重要清除劑[13]，也被認(rèn)為是植物體抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵酶。盡管關(guān)于過(guò)氧化氫酶基因序列的報(bào)道眾多，但是在菊科植物中關(guān)于過(guò)氧化氫酶的蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的卻鮮有報(bào)道。本文利用生物信息學(xué)的方法分析CAT的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該酶共編碼506個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)域在第32個(gè)氨基酸到第411個(gè)氨基酸之間。從長(zhǎng)度以及結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列上看，各物種間較為保守。34份材料間比對(duì)序列相似度>75%(顯示黑色和紅色區(qū)域)占多數(shù)，從相似度計(jì)算結(jié)果來(lái)看為96%以上，從而表明CAT是植物具有高度保守性的酶類。結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，千里光CAT符合Catalase like家族的典型特征，由4個(gè)相同肽鏈亞基組成的四聚體血紅素酶，是過(guò)氧化氫發(fā)揮作用的活性位點(diǎn)和鐵血紅蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。在進(jìn)化關(guān)系上，分析千里光與山扁桃、菜薊等34個(gè)物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明，千里光CAT與艾菊、向日葵等4種菊科植物歸于一支，表明該酶在進(jìn)化地位上與其分類學(xué)一致。但與這4種菊科植物的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)一步比較則表明千里光CAT歸于不同亞支，表明該酶的進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)與其他4種菊科植物。

對(duì)白菜[14]、藜麥[15]等多種植物的的抗病、抗逆過(guò)程的分析表明，CAT響應(yīng)多種信號(hào)分子如SA、白斑病、鹽脅迫，參與植物重要的生命活動(dòng)過(guò)程。而磷酸化與糖基化是蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的重要方式，對(duì)千里光CAT磷酸化與糖基化位點(diǎn)的分析表明，其存在豐富的磷酸化位點(diǎn)(67個(gè))和糖基化位點(diǎn)(156個(gè))，可能是其參與多個(gè)信號(hào)通路，應(yīng)對(duì)植物多種逆境脅迫的重要基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)對(duì)千里光過(guò)氧化氫酶基因的結(jié)構(gòu)與功能分析，近緣物種的進(jìn)化關(guān)系比較為千里光重要的藥理作用抗氧化活性的形成與評(píng)價(jià)，進(jìn)一步開發(fā)與利用等研究奠定了基礎(chǔ)。