亞致死濃度的吡蟲啉對(duì)萼花臂尾輪蟲種群動(dòng)態(tài)的影響

葛樂樂， 白 琰， 孫 帆， 江 姍， 席貽龍

(1.安徽師范大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，安徽 蕪湖 241002;2.皖江流域退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 蕪湖 241002)

新煙堿類殺蟲劑是于20世紀(jì)90年代初被引入市場(chǎng)的一類重要?dú)⑾x劑，具有廣譜、高效、低毒、害蟲不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)[1]。吡蟲啉是世界上使用最廣泛的一種新煙堿類殺蟲劑，已在120個(gè)國(guó)家注冊(cè)并用于140多種作物的害蟲防治[2]。吡蟲啉的作用機(jī)理是通過攝食或直接接觸作用于靶物種，阻斷其乙酰膽堿受體神經(jīng)元通路，使其產(chǎn)生突觸的持續(xù)性興奮，最終使靶物種癱瘓或者死亡[3-4]。由于對(duì)哺乳動(dòng)物具有低毒性，吡蟲啉還被用于寵物或者伴侶動(dòng)物體表跳蚤的有效控制[3]。然而，由于其在土壤中的持久性(半衰期為48～190天)、高溶解度(514mg/L，20℃)和低辛醇水分配系數(shù)(Log Kow=0.57)，吡蟲啉可以通過漂移、溶解徑流或浸出而成為地表和地下水的潛在污染物[5]。隨著吡蟲啉廣泛的使用，其在越來越多的水體中被檢出。在日本東京Sagami湖中檢測(cè)到的吡蟲啉含量為0.104μg/L[6]，在加拿大安大略省湖泊中檢測(cè)到的最大濃度為972ng/L[7]，在希臘色雷斯湖泊中檢測(cè)到的最大含量為102ng/L[8]；在我國(guó)廣州珠江檢測(cè)到的最大濃度為154ng/L[9]，在長(zhǎng)江揚(yáng)州支流的最高濃度為1886ng/L[10]。水體中殘留的吡蟲啉會(huì)對(duì)線蟲(Caenorhabditiselegans)[11]、節(jié)肢動(dòng)物[12-15]、斑馬魚[16]等產(chǎn)生毒性作用，影響生物群落結(jié)構(gòu)[17-19]，最終可能通過食物鏈影響人類健康[20]。因此，全面評(píng)估吡蟲啉等農(nóng)用化學(xué)品對(duì)水生生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要的意義。

作為藻類等的消費(fèi)者以及魚類等幼體的食物，輪蟲在水生食物鏈中具有重要的作用。因此，吡蟲啉等污染物對(duì)輪蟲存活、生殖和種群增長(zhǎng)等的影響勢(shì)必會(huì)影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。然而，目前有關(guān)吡蟲啉對(duì)輪蟲的毒性作用尚鮮有報(bào)道。本研究采用種群增長(zhǎng)、休眠卵產(chǎn)量和生命表實(shí)驗(yàn)等方法研究了不同濃度的吡蟲啉對(duì)萼花臂尾輪蟲種群增長(zhǎng)參數(shù)和生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)的影響，旨在了解吡蟲啉對(duì)萼花臂尾輪蟲存活、生殖和種群增長(zhǎng)的影響，同時(shí)比較各參數(shù)對(duì)吡蟲啉污染的敏感性。

1 材料與方法

1.1 輪蟲的采集和培養(yǎng)

萼花臂尾輪蟲由采自蕪湖市龍窩湖水體沉積物中的休眠卵孵化而得，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)在(24±1)℃、無光照的培養(yǎng)箱中進(jìn)行克隆培養(yǎng)。以EPA[21]作為培養(yǎng)液，用HB-4培養(yǎng)液[22]培養(yǎng)的斜生柵藻作為食物。當(dāng)斜生柵藻種群處在指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，先離心收集，然后在光學(xué)顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)前對(duì)輪蟲種群進(jìn)行一周以上的預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)期間輪蟲的喂食密度在1.5×106個(gè)細(xì)胞/mL，種群始終被維持在指數(shù)增長(zhǎng)期。

1.2 吡蟲啉濃度的設(shè)置和測(cè)試液的配制

實(shí)驗(yàn)用吡蟲啉原藥(分子式C9H10ClN5O2，晶體狀，純度為99.1%)購(gòu)于北京勤誠(chéng)亦信科技開發(fā)有限公司，4℃下避光、干燥保存。

測(cè)試液濃度按等比間距設(shè)為7個(gè)梯度，分別是1.56、3.12、6.25、12.5、25、50和100mg/L，另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組。利用EPA培養(yǎng)液預(yù)先配制好100mg/L的母液，然后逐步稀釋得到所需濃度的測(cè)試液。母液于4℃冰箱中避光保存，3d更換一次。

1.3 3-d種群增長(zhǎng)和4-d休眠卵產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參照Xi和Feng的方法[23]進(jìn)行。以齡長(zhǎng)在4h以內(nèi)的輪蟲幼體作為受試動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)條件與預(yù)培養(yǎng)時(shí)相同。實(shí)驗(yàn)前，由預(yù)培養(yǎng)的輪蟲種群中挑出20只輪蟲幼體置于容積為12mL的玻璃試管中，然后向試管中加入相應(yīng)濃度的測(cè)試液10mL(內(nèi)含1.5×106個(gè)細(xì)胞/mL的斜生柵藻)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)過程中，每12h懸浮一次沉積在試管底部的斜生柵藻，每24h將試管內(nèi)的萼花臂尾輪蟲移至干凈試管中，并加入新鮮配制的測(cè)試液和所需數(shù)量的斜生柵藻，同時(shí)計(jì)數(shù)試管底部的輪蟲休眠卵。3d后，抽樣計(jì)數(shù)各試管中帶卵的非混交雌體和混交雌體數(shù)以及不帶卵的雌體數(shù)。待全部計(jì)數(shù)完成后，將所存活的個(gè)體放入試管中繼續(xù)培養(yǎng)24h，24h后記錄試管底部和輪蟲身體末端所帶的休眠卵數(shù)。

基于上述計(jì)數(shù)結(jié)果，按照Xi和Feng的方法[23]，計(jì)算或統(tǒng)計(jì)種群增長(zhǎng)率、種群混交率和休眠卵產(chǎn)量：

種群增長(zhǎng)率r=(lnNt-lnN0)/t，其中，Nt為3天后的種群密度，N0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的種群密度(2只/mL)，t=3d；

種群混交率=種群中帶卵的混交雌體數(shù)目/種群中各類雌體總數(shù)；

休眠卵產(chǎn)量=種群在10mL培養(yǎng)體積中于4d內(nèi)所產(chǎn)的休眠卵總數(shù)。

1.4 生命表實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在8mL玻璃燒杯中進(jìn)行，每杯中加入相應(yīng)濃度的測(cè)試液5mL(內(nèi)含1.5×106個(gè)細(xì)胞/mL的斜生柵藻)和齡長(zhǎng)在4h以內(nèi)的萼花臂尾輪蟲幼體10只，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)條件與種群增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)過程中，每12h觀察并記錄每個(gè)燒杯里存活的輪蟲母體數(shù)和孵化出的幼體數(shù)，去除死亡母體，將孵化出的幼體轉(zhuǎn)移到干凈的燒杯里繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)其所產(chǎn)的卵的類型確定雌體類型，由此計(jì)算出輪蟲母體所產(chǎn)全部后代中混交雌體所占的比例(后代混交率PS)。每24h將存活的母體轉(zhuǎn)移至含有新鮮測(cè)試液和藻類食物的燒杯中。實(shí)驗(yàn)至母體全部死亡時(shí)結(jié)束。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中記錄的相關(guān)數(shù)據(jù)，按照朱韓等[24]的方法，計(jì)算出特定年齡存活率(lx)和繁殖率(mx)、凈生殖率(R0)、生命期望(e0)、世代時(shí)間(T)和種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率(rm)等生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0和Excel 2003軟件對(duì)種群增長(zhǎng)和生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)等參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用生存分析中的Kaplan-Meier模型分析各處理組和對(duì)照組之間輪蟲同生群存活時(shí)間的差異顯著性。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較(LSD檢驗(yàn))分析吡蟲啉濃度對(duì)各參數(shù)影響的顯著性以及各濃度處理組與對(duì)照組之間的差異顯著性；通過回歸分析方法分析輪蟲各種群增長(zhǎng)參數(shù)和生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)與吡蟲啉濃度間的關(guān)系[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡蟲啉濃度對(duì)輪蟲種群增長(zhǎng)參數(shù)的影響

單因素方差分析顯示，吡蟲啉濃度對(duì)輪蟲種群增長(zhǎng)率有顯著性影響(P<0.01)，但對(duì)種群混交率和休眠卵產(chǎn)量無顯著性影響(P>0.05)。多重比較顯示，與對(duì)照組相比，12.5mg/L吡蟲啉處理組中輪蟲種群增長(zhǎng)率顯著升高(P<0.05)，而50和100mg/L吡蟲啉處理組中輪蟲種群增長(zhǎng)率則顯著降低(P<0.05)(表1)?；貧w分析結(jié)果表明，吡蟲啉濃度與輪蟲種群增長(zhǎng)率之間呈現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，兩者之間的關(guān)系可以描述為y=1.511×10-6x2-0.003x+0.69(R2=0.481,P<0.01)。

表1 暴露于不同濃度吡蟲啉溶液中萼花臂尾輪蟲的種群參數(shù)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

2.2 吡蟲啉濃度對(duì)輪蟲生命表統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)的影響

暴露于各濃度吡蟲啉溶液中的輪蟲存活率和繁殖率如圖1所示。存活分析結(jié)果表明，吡蟲啉濃度對(duì)輪蟲存活率和繁殖率峰值均有顯著性影響(P<0.05)。和對(duì)照組相比，100mg/L吡蟲啉處理組中輪蟲的存活率和繁殖率峰值均顯著降低。

圖1 暴露于不同濃度吡蟲啉溶液中萼花臂尾輪蟲的存活率和繁殖率

單因素方差分析顯示，吡蟲啉濃度對(duì)輪蟲存活(以生命期望為指標(biāo))、發(fā)育(世代時(shí)間)、生殖(凈生殖率)和種群增長(zhǎng)(內(nèi)稟增長(zhǎng)率)等參數(shù)均有顯著性影響(P<0.01)，但對(duì)后代混交率無顯著性影響(P=0.135)。多重比較表明，與對(duì)照組相比，3.12～12.5mg/L吡蟲啉處理組中輪蟲的生命期望顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，而25～100mg/L吡蟲啉處理組中輪蟲的生命期望則顯著縮短(P<0.01)。1.56～12.5mg/L吡蟲啉處理組中輪蟲的世代時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，而50～100mg/L吡蟲啉處理組中輪蟲的世代時(shí)間則顯著縮短(P<0.01)。1.56～12.5mg/L吡蟲啉處理組中輪蟲的凈生殖率顯著升高(P<0.01)，而25～100mg/L吡蟲啉處理組中則相反(P<0.01)。50～100mg/L吡蟲啉處理組中種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 暴露于不同濃度吡蟲啉溶液中萼花臂尾輪蟲的生活史參數(shù)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

回歸分析結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的吡蟲啉濃度范圍內(nèi)，吡蟲啉濃度與輪蟲的存活、發(fā)育、生殖和種群增長(zhǎng)等參數(shù)之間均具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.01)(表3)。

表3 萼花臂尾輪蟲的生命期望、世代時(shí)間、凈生殖率和內(nèi)稟增長(zhǎng)率與吡蟲啉濃度(mg/L)間的關(guān)系

3 討論

3.1 吡蟲啉對(duì)水生生物的急性毒性

已有研究表明，吡蟲啉對(duì)斑馬魚幼體的LC50值為143.7mg/L[16]，對(duì)大型溞的24h LC50值為118.9mg/L，對(duì)鯉魚(Cyprinuscarpio)幼體的24h LC50為208.3mg/L，對(duì)日本沼蝦(Macrobrachiumnipponensis)成蝦的24h LC50為0.089mg/L[25]，對(duì)澤蛙(Ranalimnocharis)蝌蚪的24h LC50為177.3mg/L[26]，對(duì)介形綱(Cypridopsisvidua和Ilyocyprisdentifera)的24h LC50分別為0.542和0.759mg/L[13]。本研究中，在最大溶解范圍內(nèi)(510mg/L)吡蟲啉并未對(duì)萼花臂尾輪蟲造成50%以上的死亡率，因此我們估計(jì)吡蟲啉對(duì)輪蟲的毒性較低。究其原因可能在于輪蟲神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化程度低，對(duì)神經(jīng)性藥物的敏感性相對(duì)較差[27]。

3.2 殺蟲劑對(duì)輪蟲種群增長(zhǎng)率、種群混交率和休眠卵產(chǎn)量等參數(shù)的影響

種群增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)是以輪蟲為受試生物進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)研究的常用方法，實(shí)驗(yàn)研究的種群增長(zhǎng)率、種群混交率和休眠卵產(chǎn)量等參數(shù)是監(jiān)測(cè)污染物對(duì)輪蟲孤雌生殖和有性生殖影響的常用指標(biāo)[28,29]。已有研究表明，總體上，較高濃度的殺蟲劑使輪蟲種群增長(zhǎng)率、種群混交率和休眠卵產(chǎn)量顯著降低。如濃度高于0.4、0.1和0.05mg/L的甲基托布津(thiophanate-methyl)分別使萼花臂尾輪蟲的種群增長(zhǎng)率、種群混交率和休眠卵產(chǎn)量顯著降低[23]，濃度高于0.64mg/L的DDT、0.8和1.2mg/L的三氯殺螨醇(dicofol)、7.0mg/L的硫丹(endosulfan)和14.0mg/L的林丹(lindane)使萼花臂尾輪蟲的種群增長(zhǎng)率顯著降低，濃度高于0.16mg/L的DDT、0.025mg/L的三氯殺螨醇、0.875mg/L的硫丹和14.0mg/L的林丹使萼花臂尾輪蟲的種群混交率顯著降低[30]，濃度高于1.62和0.54mg/L的西維因(Carbaryl)分別使萼花臂尾輪蟲的種群混交率和種群增長(zhǎng)率顯著降低[31]。與上述研究結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)較高濃度(50和100mg/L)的吡蟲啉也使萼花臂尾輪蟲的種群增長(zhǎng)率顯著降低，但較低濃度(12.5mg/L)的吡蟲啉使種群增長(zhǎng)率顯著升高，此外，吡蟲啉濃度對(duì)輪蟲種群混交率和休眠卵產(chǎn)量無顯著性影響。這些結(jié)果之間存在的差異可能與殺蟲劑的種類以及所設(shè)置的濃度范圍有關(guān)。

3.3 殺蟲劑對(duì)輪蟲生活史參數(shù)的影響

之前有報(bào)道顯示，較高濃度的殺蟲劑對(duì)存活、生殖和種群增長(zhǎng)具有抑制作用，而較低濃度的殺蟲劑則起促進(jìn)作用，抑制作用和促進(jìn)作用的顯著性有時(shí)因殺蟲劑種類的不同而存在差異。如較高濃度的西維因、甲基對(duì)硫磷(methylparathion)、林丹、二氯苯胺(3,4-dichloroaniline)、殺螟硫磷(fenitrothion)、毒死蜱(chlorpyrifos)、DDT和三氯殺螨醇等殺蟲劑使萼花臂尾輪蟲的生命期望顯著縮短，凈生殖率和種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率顯著降低[32-37]，較低濃度的艾氏劑(aldrin)使輪蟲的生命期望顯著延長(zhǎng)，凈生殖率和種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率顯著升高[38]。然而，較低濃度的十氯丹(chlordecone)使萼花臂尾輪蟲的凈生殖率升高，但對(duì)生命期望和種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率無顯著性影響[39]。本研究中，較高濃度的吡蟲啉對(duì)萼花臂尾輪蟲的存活、生殖和種群增長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，較低濃度的吡蟲啉對(duì)輪蟲的存活和生殖具有顯著的促進(jìn)作用，但對(duì)種群增長(zhǎng)無顯著性影響。

低濃度的殺蟲劑等污染物對(duì)輪蟲存活、生殖或種群增長(zhǎng)的促進(jìn)作用通常被歸因于其“毒物興奮效應(yīng)(hormesis)”[40]，而較高濃度的抑制作用被認(rèn)為是其毒性作用所致。

3.4 輪蟲各種群參數(shù)和生活史參數(shù)對(duì)殺蟲劑的敏感性

以輪蟲為受試生物開展的短期慢性毒性測(cè)試中，種群增長(zhǎng)率和種群混交率對(duì)大多數(shù)殺蟲劑均是敏感的指標(biāo)[23,30，31,41-43]。在現(xiàn)在的研究中，種群增長(zhǎng)率對(duì)吡蟲啉污染敏感，但種群混交率卻不敏感。

輪蟲各生活史參數(shù)對(duì)殺蟲劑的敏感性也常因殺蟲劑種類的不同而存在著差異[32-39]。本研究發(fā)現(xiàn)，在監(jiān)測(cè)較低濃度的吡蟲啉對(duì)萼花臂尾輪蟲存活、發(fā)育和生殖的促進(jìn)作用時(shí)，世代時(shí)間和凈生殖率是較敏感的指標(biāo)，而在監(jiān)測(cè)較高濃度的吡蟲啉對(duì)輪蟲存活、發(fā)育和生殖的抑制作用時(shí)，生命期望和凈生殖率是較敏感的指標(biāo)。

在研究環(huán)境脅迫條件下輪蟲實(shí)驗(yàn)種群變動(dòng)過程中，生命表實(shí)驗(yàn)和種群增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)是互為補(bǔ)充的兩種方法，兩者的結(jié)合有利于揭示輪蟲種群動(dòng)態(tài)的過程和機(jī)理[44]。已有研究表明，種群增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)得出的種群增長(zhǎng)率不僅在數(shù)值上低于生命表實(shí)驗(yàn)得出的種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率，而且在對(duì)食物密度和污染物濃度等變化的敏感性方面也存在著差異[44，45]。本研究結(jié)果表明，種群增長(zhǎng)率在數(shù)值上低于種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率，但在對(duì)較高濃度吡蟲啉的抑制作用的敏感性方面與種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率相同，在對(duì)較低濃度吡蟲啉的促進(jìn)作用的敏感性方面高于種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率。