野生靈芝的分離鑒定及林下栽培技術(shù)研究

吳國(guó)華，付雅麗，葉茂平，童小青，饒雨欣，江宏，王勇軍,3

（1.浙江省龍泉市林業(yè)局，浙江 龍泉 323700；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學(xué)，省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

靈芝Ganoderma lucidum隸屬于擔(dān)子菌綱Basidiomycetes多孔菌目Polyporals多孔菌科Polyporaceae靈芝屬Ganoderma，被譽(yù)為百草之王，是中國(guó)名貴傳統(tǒng)中藥材，在我國(guó)已有2 000多年的藥用歷史，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的功效[1]。靈芝及其孢子粉中含有多糖類、三萜類、蛋白質(zhì)、甾醇類、核苷類、微量元素等生物活性成分[2]。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)研究證明，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保肝解毒、抗衰老、抗神經(jīng)衰弱、降血糖等功效[3-5]。我國(guó)在20世紀(jì)50年代首次成功栽培靈芝并逐漸實(shí)現(xiàn)了靈芝規(guī)?；a(chǎn)，現(xiàn)已成為靈芝重要栽培和加工的國(guó)家[6]。據(jù)2015年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)靈芝及孢子粉年產(chǎn)量約12萬(wàn)t，產(chǎn)值達(dá)到16億美元[6]。浙江靈芝商品性生產(chǎn)始于20世紀(jì)70年代，已成為全國(guó)靈芝及孢子粉的主產(chǎn)區(qū)，主要集中在龍泉、慶元、蓮都、武義等生態(tài)環(huán)境優(yōu)越的山區(qū)，其中龍泉靈芝孢子粉2011年被列為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)[7]。

目前，我國(guó)靈芝栽培主要以袋料栽培和段木基質(zhì)栽培為主[6]。隨著靈芝需求量的提高，栽培場(chǎng)地的不斷擴(kuò)大，新型栽培模式也在不斷探索。林下仿野生栽培，將菌絲袋料或段木覆土于遮陽(yáng)較好的樹林下培育出芝，可有效克服栽培場(chǎng)地短缺、連作障礙等問題[8]，并具有產(chǎn)量高、生物轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，已在四川、福建等山區(qū)林地得到推廣和應(yīng)用[9-10]。龍泉靈芝目前主要以大田栽培為主，主要栽培品種為‘滬農(nóng)靈芝1號(hào)’，針對(duì)林下栽培尚無(wú)可大面積推廣的品種[11]。本研究從龍泉市森林中采集野生靈芝子實(shí)體并分離菌種，篩選生長(zhǎng)性能優(yōu)良的菌種并完成野生靈芝的鑒定，建立了野生菌株的林下栽培技術(shù)，旨在為龍泉靈芝提供新的菌種資源和林下栽培模式。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種采集 2017年8月，在浙江省龍泉市蘭巨鄉(xiāng)梅地村天然林（地理坐標(biāo)為119°7'41.22" E，27°56'56.43"N，海拔650～700 m）中進(jìn)行野生靈芝采集，用小刀切取新鮮靈芝，連同菌柄和菌蓋，裝入取樣袋中，置于冰盒保存，記錄靈芝著生的宿主植物種類。從不同地點(diǎn)采集得到8個(gè)野生靈芝樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離及純化。龍泉市屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均溫度為17.6℃，年平均降水量為1 664 mm，平均空氣相對(duì)濕度為79%，平均日照為1 823.8 h，無(wú)霜期為262 d。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0，121℃下高溫滅菌20 min。木屑麥麩培養(yǎng)基（原種培養(yǎng)基）：木屑750 g，麥麩240 g，石膏10 g，水1 200 mL，pH 6.5，采用100℃下常壓滅菌24 h。段木栽培基質(zhì)：將供試的直徑為5～8 cm的板栗Castanea mollissima、楓香樹Liquidambar formosana、青岡Cyclobalanopsis glauca或麻櫟Quercus acutissima的多年生枝條鋸成30 cm長(zhǎng)的段木，分別裝入高密度低壓聚乙烯筒袋內(nèi)，每袋裝入7根相同段木，采用100℃下常壓滅菌24 h。

1.1.3 栽培場(chǎng)地 栽培場(chǎng)地設(shè)置在浙江省龍泉市蘭巨鄉(xiāng)梅地村附近的次生林中，地理坐標(biāo)為119°7'41.20" E 27°56'56.43" N，海拔500～700 m，坡度在25°～30°，林地以闊葉樹種為主，主要包括楓香樹、青岡等，土質(zhì)疏松，偏酸性沙質(zhì)土，經(jīng)間伐后林分郁閉度分別為0.4、0.6和0.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝菌絲分離純化 將采集到的靈芝樣品用75%酒精表面消毒10 s后，用無(wú)菌水沖洗2遍，用無(wú)菌剪刀在靈芝菌蓋嫩邊圈剪取長(zhǎng)、寬均為1 mm大小的邊緣菌塊，將菌塊接種于PDA培養(yǎng)皿中，避光條件下28℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌絲，用挑針挑取少量菌絲置于新鮮PDA培養(yǎng)皿中，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌絲形態(tài)，獲得純培養(yǎng)物。按菌種生長(zhǎng)速度，選出菌絲生長(zhǎng)最快的靈芝菌種作為研究菌種。

1.2.2 掃描電鏡觀察 選出生長(zhǎng)最快的菌種作為研究菌種，取該靈芝孢子粉用無(wú)菌水重懸后，加入2.5%戊二醛于4℃下浸泡過夜，加入磷酸緩沖液（pH 7.0）浸泡15 min，浸洗3次，再用1%鋨酸溶液固定樣品1～2 h，再用磷酸緩沖液（pH 7.0）漂洗15 min，隨后依次將樣品浸泡于30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液中，每次浸泡15 min。移除乙醇溶液，用100%乙醇洗脫20 min，洗脫2次，然后用乙醇與乙酸異戊酯溶液（1/1，V/V）浸沒30 min后，用100%乙酸異戊酯浸沒樣品2 h，晾干備用。將樣品在臨界點(diǎn)進(jìn)行鍍金，放置于掃描電子顯微鏡（Phenom ProPW-100-011，荷蘭）下進(jìn)行觀察。

1.2.3 ITS-PCR及測(cè)序 采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（生工?，上海）提取靈芝菌絲的總DNA，采用真菌核糖體基因間隔區(qū)（ITS）通用引物 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。擴(kuò)增反應(yīng)為：94℃/5 min；94℃/45 s，55℃/45 s，72℃/1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃/8 min。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測(cè)序，采用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接。序列采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，采用Maximum likelihood analysis進(jìn)行分析，自展數(shù)據(jù)（bootstrap）為1 000次[13]。

1.2.4 靈芝菌包的制備 將在PDA上生長(zhǎng)的靈芝菌絲，接入原種培養(yǎng)基中，在黑暗條件下18～22℃進(jìn)行發(fā)菌；待白色菌絲長(zhǎng)滿原種培養(yǎng)基菌袋后，在無(wú)菌條件下用鑷子取含有菌絲的培養(yǎng)料，加入供試的4種段木栽培基質(zhì)的兩端，扎口后，置于黑暗條件下22～24℃進(jìn)行發(fā)菌；20～30 d后，待菌絲長(zhǎng)滿段木表面1周后，取出移至林地進(jìn)行栽培。

1.2.5 靈芝林下栽培管理及采收 根據(jù)林區(qū)山坡的特征，設(shè)計(jì)靈芝菌包的排放位置，并進(jìn)行起壟，每排靈芝菌包間隔25 cm，每壟安排4排菌包。在2018年4－5月選擇晴天排放菌包，通風(fēng)15～20 d后脫去菌袋，覆蓋厚度1～2 cm泥土，再在泥土上蓋一層樹葉；出芝后，保持濕潤(rùn)通氣，當(dāng)大部分靈芝菌蓋表面色澤一致，邊緣無(wú)嫩邊圈時(shí)，即行采收。采用套筒采集法進(jìn)行孢子粉采收，將靈芝菌蓋和接粉薄膜上的孢子粉刷下，將收集到的孢子粉放置在干凈容器里。

1.2.6 不同段木對(duì)靈芝林下栽培影響的小區(qū)設(shè)計(jì) 將用板栗、楓香樹、青岡和麻櫟4種不同段木栽培基質(zhì)制備的靈芝菌包進(jìn)行標(biāo)記，于2018年4月，隨機(jī)擺放在壟上，每壟擺放不同段木制備的靈芝菌包各20個(gè)，共3壟。約70天后，待靈芝孢子不再大量產(chǎn)生，進(jìn)行孢子粉采收。取試驗(yàn)區(qū)每個(gè)靈芝，進(jìn)行菌柄長(zhǎng)度、菌蓋直徑、生物轉(zhuǎn)化率、子實(shí)體干質(zhì)量、孢子粉質(zhì)量等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。生物轉(zhuǎn)化率（%）為子實(shí)體干質(zhì)量和孢子粉質(zhì)量之和占接種前段木質(zhì)量的百分比。粉芝比（%）為靈芝孢子粉質(zhì)量與子實(shí)體干質(zhì)量的比例。

1.2.7 林間不同郁閉度對(duì)靈芝林下栽培影響的小區(qū)設(shè)計(jì) 適當(dāng)間伐，采用樹冠投影法確定林分郁閉度，得到郁閉度分別0.4、0.6和0.8的林下栽培區(qū)。栽培區(qū)樹種主要為青岡和楓香樹，樹齡約為20年，樹高6～8 m。于2018年4月，將菌包排放在不同郁閉度的林區(qū)，每個(gè)郁閉度的林區(qū)設(shè)置3壟，每壟放置20個(gè)菌包。待靈芝孢子不再大量產(chǎn)生，進(jìn)行孢子粉采收。取試驗(yàn)區(qū)每個(gè)靈芝，進(jìn)行菌柄長(zhǎng)度、菌蓋直徑、生物轉(zhuǎn)化率、子實(shí)體干質(zhì)量、孢子粉質(zhì)量等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 設(shè)置靈芝棚對(duì)靈芝林下栽培影響的小區(qū)設(shè)計(jì) 于2019年4月，根據(jù)上年段木篩選試驗(yàn)結(jié)果和郁閉度試驗(yàn)結(jié)果，在麻櫟段木栽培和林分郁閉度為0.8的栽培條件下，進(jìn)行靈芝棚對(duì)靈芝生長(zhǎng)及孢子產(chǎn)量的比較試驗(yàn)。處理組采用在靈芝菌包林下擺放并覆土后，用塑料膜支起50 cm高的靈芝棚蓋住整壟，待到靈芝菌蓋嫩邊圈消失后，撤下靈芝棚，空白組不設(shè)置靈芝棚，每個(gè)處理設(shè)置3壟，每壟放置20個(gè)菌包。待靈芝孢子不再大量產(chǎn)生，進(jìn)行孢子粉采收。取試驗(yàn)區(qū)每個(gè)靈芝，進(jìn)行菌柄長(zhǎng)度、菌蓋直徑、生物轉(zhuǎn)化率、子實(shí)體干質(zhì)量、孢子粉質(zhì)量等指標(biāo)測(cè)定。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，采用t檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同靈芝菌種的生長(zhǎng)速度測(cè)定

將采集到的8個(gè)野生靈芝樣品進(jìn)行培養(yǎng)，得到純菌絲體，分別命名為L(zhǎng)Q01、LQ02、LQ03、LQ04、LQ05、LQ06、LQ07、LQ08菌種。將這8個(gè)菌種分別在PDA和原種培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，測(cè)定菌絲的生長(zhǎng)速度，結(jié)果如表1。由表1可知，從板栗上分離的菌種LQ06在PDA和原種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度均顯著高于其他菌種（P＜0.05），在PDA上第5天就長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，接種原種培養(yǎng)基后，第14天菌絲平均直徑達(dá)到16.12 cm，表現(xiàn)出優(yōu)良的生長(zhǎng)性狀。因此，本研究選擇菌種生長(zhǎng)最快的LQ06作為其他試驗(yàn)的菌種。

表1 不同菌種在PDA和原種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)Table 1 Growth of isolated 8 strains on PDA and primary stock substrate

2.2 靈芝菌種LQ06的生長(zhǎng)特性及ITS序列分析

LQ06菌絲體在PDA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)濃密白色，較纖細(xì)，粗細(xì)均勻，菌絲透明（圖1A）。擔(dān)孢子呈橢圓形，表面有網(wǎng)紋孔格，大小為（5.3～6.4）μm×（2.7～3.8）μm（圖1B）。PCR擴(kuò)增獲得菌株LQ06的ITS部分序列，NCBI登錄號(hào)為MT936513。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，LQ06與靈芝G.lucidumDai2272菌株和G1T099菌株親緣關(guān)系最近，與G.lucidumDai2272的相似度為97.09%，構(gòu)成一個(gè)分支（圖2）。菌絲和擔(dān)孢子形態(tài)以及ITS序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步明確了菌株LQ06為靈芝屬靈芝種G.lucidum真菌。

圖1 靈芝LQ06菌絲（A）和擔(dān)孢子（B）形態(tài)Figure 1 The mycelium of G.lucidum LQ06 growing on PDA (A)and morphology of basidiospores

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree inferred from the Maximum likelihood analysis based on the ITS dataset

2.3 林下栽培過程中靈芝LQ06的生長(zhǎng)特征

將得到的靈芝菌種LQ06經(jīng)試管母種生長(zhǎng)和原種擴(kuò)繁后，接種于消毒后的麻櫟段木栽培基質(zhì)上，進(jìn)行發(fā)菌處理，待到菌絲布滿菌棒后，于2020年5月移至林地（圖3A）。30 d后，進(jìn)入出芝期（圖3B），隨后菌蓋不斷展開，菌柄伸長(zhǎng)，約45 d后，菌蓋嫩邊圈開始消失，菌蓋顏色呈現(xiàn)赤色，50 d后，菌蓋嫩邊圈完全消失，擔(dān)孢子開始從菌蓋下表面的多孔中開始產(chǎn)生（圖3C）。

2.4 不同段木栽培基質(zhì)對(duì)林下栽培靈芝LQ06的生長(zhǎng)性狀及孢子產(chǎn)量的影響

選擇楓香樹、板栗、青岡、麻櫟4種段木栽培基質(zhì)進(jìn)行靈芝LQ06的栽培，結(jié)果如表2。

表2 不同段木栽培基質(zhì)對(duì)林下栽培靈芝生長(zhǎng)性狀和孢子產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of different cut logs on growth traits and spores yield of G.lucidum LQ06 cultivation under forest

由表2可知，以麻櫟作為段木栽培基質(zhì)的靈芝生長(zhǎng)最快，在靈芝孢子粉不再大量產(chǎn)生時(shí)，菌柄平均長(zhǎng)度達(dá)到9.57 cm，菌蓋平均直徑達(dá)到19.61 cm，生物轉(zhuǎn)化率為6.14%，每個(gè)成熟靈芝子實(shí)體平均干質(zhì)量為112.56 g，孢子粉平均質(zhì)量為108.54 g，粉芝產(chǎn)量比為96.43%。以青岡、板栗、楓香樹為段木栽培基質(zhì)的靈芝生長(zhǎng)和孢子粉質(zhì)量均顯著低于麻櫟（P＜ 0.05）。

2.5 不同郁閉度對(duì)林下栽培靈芝LQ06的生長(zhǎng)性狀及孢子產(chǎn)量的影響

以麻櫟段木為栽培基質(zhì)，選擇不同郁閉度的林地進(jìn)行靈芝菌種LQ06的栽培，結(jié)果如表3。由表3看出，在郁閉度為0.6和0.8的林地栽培的靈芝生長(zhǎng)較好，其菌柄長(zhǎng)度、菌蓋直徑、生物轉(zhuǎn)化率、單個(gè)子實(shí)體干質(zhì)量以及孢子粉質(zhì)量，均顯著高于郁閉度為0.4的林地（P＜ 0.05）。郁閉度為0.6和0.8的林區(qū)栽培的靈芝之間無(wú)明顯差異。

圖3 靈芝林下栽培現(xiàn)場(chǎng)（A）及子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育過程（B和C）Figure 3 The cultivation of G.lucidum LQ06 under forest (A)and development of fruiting body (B and C)

表3 不同郁閉度對(duì)林下栽培靈芝的生長(zhǎng)性狀和孢子產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of different crown density on growth traits and spores yield of G.lucidum LQ06 cultivation under forest

2.6 靈芝棚搭建對(duì)林下栽培靈芝LQ06的生長(zhǎng)性狀及孢子產(chǎn)量的影響

在以麻櫟段木為栽培基質(zhì)和郁閉度為0.8的栽培條件下，搭建靈芝棚，測(cè)定搭建靈芝棚對(duì)靈芝生長(zhǎng)性狀和孢子產(chǎn)量的影響，結(jié)果表4。由表4可以看出，搭棚組靈芝的菌柄平均長(zhǎng)度為12.04 cm，顯著高于無(wú)棚對(duì)照組（8.72 cm），兩處理的菌蓋直徑無(wú)顯著差異，有棚組的生物轉(zhuǎn)化率為5.63%，顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05）；有棚組的單個(gè)靈芝子實(shí)體干質(zhì)量為163.43 g，孢子粉平均質(zhì)量為152.37 g，均顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05）。

表4 靈芝棚搭建對(duì)林下栽培靈芝的生長(zhǎng)性狀和孢子產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of greenhouse on growth and spores yield of G.lucidum LQ06 cultivation under forest

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

優(yōu)良的菌種資源是靈芝育種和栽培的重要前提[14-15]。當(dāng)前，靈芝菌種的鑒定主要以擔(dān)孢子形態(tài)、子實(shí)體形態(tài)以及真菌ITS序列為參考指標(biāo)[16]。LQ06的擔(dān)孢子呈橢圓形，表面有網(wǎng)紋孔格，其形態(tài)特征及大小與G.lucidumDai2272相似[12]，子實(shí)體為典型赤色，ITS序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)LQ06與來(lái)源于中國(guó)的G.lucidumDai2272[12]和意大利的G.lucidumG1T099[17]親緣關(guān)系最近，與G.lucidumDai2272[12]的相似度為97.09%，基于此確認(rèn)其為G.lucidumDai2272，這為龍泉林下栽培提供了新的菌種資源。

靈芝林下栽培與其他栽培環(huán)境相比，存在著自然環(huán)境不可控制、生長(zhǎng)速度較為緩慢等問題。靈芝在不同基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、光照、溫度等不同環(huán)境下，生長(zhǎng)和發(fā)育均會(huì)表現(xiàn)出差異[10,18-19]。本研究針對(duì)靈芝LQ06菌種林下栽培中的段木基質(zhì)、林區(qū)郁閉度以及搭建靈芝棚等因素對(duì)靈芝生長(zhǎng)和孢子粉產(chǎn)量的影響進(jìn)行了分析。初步明確了靈芝LQ06林下栽培過程中，以麻櫟作為段木基質(zhì)、林間郁閉度在0.6～0.8為宜。同時(shí)，參照龍泉靈芝大田栽培技術(shù)[11]，覆土后搭建靈芝棚，可保證出芝期靈芝幼嫩組織能快速健康生長(zhǎng)，有效促進(jìn)靈芝的生長(zhǎng)和提高孢子粉產(chǎn)量。

本研究中靈芝菌種LQ06在浙江龍泉的林下栽培得到的每顆靈芝孢子粉平均產(chǎn)量為152.37 g，雖不及‘滬農(nóng)靈芝一號(hào)’在大田栽培的產(chǎn)量（每顆靈芝產(chǎn)孢子粉178.5 g）[20]，但在耕地少的山區(qū)開展林下栽培具有推廣意義。不同栽培條件下靈芝孢子粉中藥效成分可能存在差異，后續(xù)將進(jìn)一步研究該菌種孢子粉破壁后有效成分含量及藥理。

3.2 結(jié)論

本研究從浙江龍泉森林中獲得了一個(gè)具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的野生靈芝菌株，通過形態(tài)學(xué)和ITS序列分析，進(jìn)一步明確了該菌株為靈芝屬靈芝種真菌G.lucidumDai2272，建立了該菌株麻櫟段木栽培、林分郁閉度0.6～0.8之間、早期搭建靈芝棚等林下栽培技術(shù)，達(dá)到了單顆靈芝產(chǎn)孢子粉質(zhì)量超過150 g的栽培效果，為靈芝林下栽培及龍泉林下經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供了新的菌種資源和技術(shù)支持。