膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清血小板反應蛋白?1水平變化及臨床意義

王威威，尹相云，邵一鳴，孫建生，連鴻凱△

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)病，伴有明顯的疼痛和功能障礙，患者生活質(zhì)量大幅下降。OA主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨局灶性病變、破壞、增生、新骨形成，以及輕度慢性非特異性炎癥性滑膜炎［1］。目前診斷骨關(guān)節(jié)破壞嚴重程度的標準方法是Kellgren Lawrence（KL）分級，即通過在普通X線片上測量關(guān)節(jié)間隙寬度評估骨關(guān)節(jié)病變的嚴重程度［2］。同時，在患者出現(xiàn)影像學變化之前檢測關(guān)節(jié)組織中發(fā)生的早期代謝病變，對于識別高風險患者并進行個體化治療具有重要的臨床意義。血小板反應蛋白?1（thrombospondin?1，TSP?1）是一種具有多種生物學功能的細胞外基質(zhì)糖蛋白，參與眾多病理生理學過程，可以調(diào)節(jié)血小板聚集、血管新生、血栓形成、細胞與基質(zhì)間的相互作用，并且在人軟骨中表達［3?4］。TSP?1 在 OA 患者中表達是否正常，以及與OA嚴重程度有無相關(guān)性，目前研究較少。本研究通過檢測OA患者血清TSP?1水平，并與健康對照者相比較，同時分析血清TSP?1水平與OA嚴重程度和其他臨床指標的相關(guān)性，為臨床早期識別具有關(guān)節(jié)軟骨破壞高風險的個體提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組 選取2018年7月—2019年12月鄭州大學第二附屬醫(yī)院收治的膝OA患者為研究對象。所有病例符合中華醫(yī)學會骨科學分會《骨關(guān)節(jié)炎診治指南》［5］的診斷標準。排除標準：（1）有膝關(guān)節(jié)外傷史、手術(shù)史、類風濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、膝關(guān)節(jié)腫瘤或結(jié)核、嚴重骨質(zhì)疏松等。（2）合并全身或局部炎癥、感染、創(chuàng)傷、腫瘤、結(jié)締組織病、自身免疫及精神障礙等疾病。（3）凝血障礙或使用抗凝藥物者。最終共納入 186 例膝 OA 患者，其中男 102 例，女 84 例，年齡40～87 歲，平均（66.3±9.7）歲，病程1～7 年。根據(jù)患者骨關(guān)節(jié)X 線片進行KL 分級，0 級：無改變；Ⅰ級：輕微骨贅；Ⅱ級：明顯骨贅，未累及關(guān)節(jié)間隙；Ⅲ級：關(guān)節(jié)間隙中度變窄；Ⅳ級：關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，軟骨下骨硬化。KL 0級組44例、Ⅰ級組52例、Ⅱ級組39例、Ⅲ級組28例、Ⅳ級組23例。選擇本院同期年齡和性別匹配的170例健康體檢者作為對照組，其中男91例，女79例，年齡36～80歲，平均（63.8±9.4）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者或家屬均知情同意。

1.2 指標檢測 清晨抽取患者和健康體檢者空腹靜脈血5 mL，30 min 內(nèi)以 3 000 r/min、離心半徑10 cm 離心 10 min 分離血清。采用美國Bio?Tek 公司ELX800 型酶標儀以酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試驗檢測血清C 反應蛋白（CRP）、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）?13、轉(zhuǎn)化生長因子?β1（TGF?β1）和TSP?1水平，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司，按說明書操作。散射比濁法檢測紅細胞沉降率（ESR）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD?t檢驗。血清中TSP?1 水平與其他臨床指標相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線獲得TSP?1預測OA的最佳臨界值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CRP、ESR、COMP、MMP?13、TGF?β1、TSP?1 水平比較 OA 各組患者血清 CRP、ESR、COMP、MMP?13、TGF?β1 和TSP?1 水平均顯著高于對照組（P＜0.05）。與KL 0級組比較，其余各OA 組CRP、MMP?13 和TSP?1 顯著升高，KL Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級組COMP、TGF?β1顯著升高，KL Ⅲ和Ⅳ級組ESR顯著升高（P＜0.05）；與KLⅠ級組比較，KLⅢ、Ⅳ級組的ESR、COMP、MMP?13、TGF?β1 和 TSP?1 均顯著升高（P＜0.05）；與KLⅡ級組比較，KL Ⅳ級組的CRP、ESR、COMP、MMP?13、TGF?β1、TSP?1 水平均顯著升高（P＜0.05）；與KLⅢ級組比較，KL Ⅳ級組CRP、ESR、TGF?β1 和 TSP?1 水平顯著升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of clinical indicators between patients with osteoarthritis and control group表1 骨關(guān)節(jié)炎患者與對照組臨床指標的比較

2.2 血清TSP?1水平與其他指標的相關(guān)性 TSP?1與ESR、CRP、COMP、MMP?13 和TGF?β1 水平呈正相關(guān)（r分別為 0.196、0.189、0.211、0.308 和 0.360，P＜0.05）。

2.3 血清 TSP?1 水平診斷 OA 的 ROC 曲線 血清TSP?1 水平診斷OA 最佳臨界值為250.9 μg/L，其敏感度為81.1%，特異度為81.9%，AUC=0.897（95%CI：0.866～0.928，P＜0.05），見圖1。

Fig.1 ROC curve of the serum TSP?1 levels圖1 血清TSP?1水平的ROC曲線

3 討論

OA是老年人常見的慢性炎癥性疾病之一，具體發(fā)病機制尚未明確，臨床主要特征為關(guān)節(jié)軟骨退行性變化和繼發(fā)性骨質(zhì)增生，受遺傳和環(huán)境等因素的影響。膝OA 患者的膝關(guān)節(jié)可出現(xiàn)疼痛、關(guān)節(jié)畸形等，具有較高的致殘率。OA 存在著廣泛的代謝異常，涉及氨基酸和脂類等眾多代謝途徑。這些代謝標志物在臨床上可以用于疾病診斷、分型、評估預后等，并可能指導改善OA 患者的臨床管理［6］。因此，目前許多研究聚焦于識別OA的生物標志物，但是尚未發(fā)現(xiàn)能可靠預測OA 的早期變化和進展的標志物用于臨床實踐［7］。尋找新的有效的生化指標，對于及早診斷、降低致殘率、提高生活質(zhì)量具有重要意義［8］。OA 常見的生物標志物反映了膠原降解和骨代謝酶的改變，包括Ⅱ型膠原羧基末端肽（CTX?Ⅱ）、COMP、炎性細胞因子、硫酸角質(zhì)素等［9］。這些標志物能從骨和關(guān)節(jié)進入外周血，而血清標志物用于臨床評估骨關(guān)節(jié)病具有簡便、創(chuàng)傷小、成本低等優(yōu)勢，成為進一步研究和實驗室驗證的重要方向［10］。

TSP?1是一種介導不同細胞基質(zhì)相互作用的細胞外基質(zhì)糖蛋白，屬于血小板反應蛋白家族，可由激活的血小板α顆粒、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞等合成分泌［3］。其具有廣泛的生理功能，表達于健康人的心、血液、肺、腎、腦及軟骨等組織，參與調(diào)節(jié)細胞黏附及遷移、組織修復、血管生成等生物過程。TSP?1 在正常人體組織中表達水平較低，但在各種組織損傷或病變引起炎癥反應后其表達水平可快速增加［11］。在早期的OA軟骨損傷中，TSP?1表達增加，而在嚴重OA中TSP?1合成減少［12］。TSP?1在OA 軟骨中的異常表達是否影響了血清中TSP?1 的水平，目前尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，OA患者血清中TSP?1水平顯著高于對照組，同時與無骨關(guān)節(jié)破壞的患者（KL 0級）相比，具有骨關(guān)節(jié)破壞的患者（KL Ⅰ～Ⅳ級）血清中TSP?1水平顯著升高。血清TSP?1水平可有效區(qū)分健康者與 OA 患者，當 TSP?1 為 250.9 μg/L 時，其對診斷OA 具有較高的敏感度和特異度。相關(guān)性分析顯示，血清TSP?1與CRP、COMP、MMP?13和TGF?β1水平呈正相關(guān)，提示TSP?1是OA的一個潛在血清生物標志物，并與骨關(guān)節(jié)破壞相關(guān)。COMP 是表達于關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)中的糖蛋白，由成軟骨細胞與滑膜細胞分泌，關(guān)節(jié)軟骨損傷后釋放入血，因而成為良好的血清生物標志物［13］。MMP?13 是 MMP 家族中的重要成員之一，參與降解細胞外基質(zhì)中的Ⅱ型膠原，在 OA 時加速軟骨的破壞［14］。OA 患者血清COMP 和MMP?13 較健康對照顯著升高，并與患者關(guān)節(jié)KL分級和疼痛程度呈正相關(guān)［15］。本文顯示OA患者血清 TSP?1 與 COMP 和 MMP?13 水平呈正相關(guān)，表明血清 TSP?1 與 COMP、MMP?13 一樣，是與OA病情嚴重程度有關(guān)的生物標志物，具有早期診斷價值。在OA的發(fā)病過程中，軟骨基質(zhì)分解并激發(fā)人體的免疫應答反應，同時釋放出大量炎性因子刺激軟骨滑膜發(fā)生炎癥病變，因而導致患者具有輕度的系統(tǒng)性炎癥反應，同時患者血清和關(guān)節(jié)液中白細胞介素（IL）?1β、腫瘤壞死因子（TNF）?α、IL?6 等炎性因子水平顯著高于健康者，而關(guān)節(jié)液炎性因子水平又高于血清［16］。由此可知，眾多血清生物標志物包括TSP?1都可能來源于關(guān)節(jié)液。

本研究中OA 患者血清 TSP?1 水平與TGF?β1呈正相關(guān)。TGF?β1 在軟骨和關(guān)節(jié)的發(fā)生和形成的各階段都發(fā)揮了重要作用。在OA 中，TGF?β1信號的表達和功能發(fā)生了改變，導致細胞外基質(zhì)破壞、軟骨下骨重塑和滑膜炎癥，促進OA的發(fā)生和進展［17］。TGF?β1能誘導滑膜細胞產(chǎn)生炎癥因子，具有促進滑膜炎癥和纖維化病變的作用，與關(guān)節(jié)僵硬和疼痛緊密相關(guān)［18］。老年膝OA 患者血清TGF?β1 較對照顯著升高，并且與KL 分級呈正相關(guān)［19］，表明其參與了OA的發(fā)生發(fā)展。

TSP?1 通過與 MMP 和 TGF?β1 的相互作用，間接參與膠原的穩(wěn)態(tài)［20］。軟骨滑膜纖維化是OA 的一個病理特征，導致關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)僵硬［21］。TGF?β1是一個重要的OA纖維化刺激因子，通過招募成纖維細胞到滑膜組織使其纖維化，同時促使細胞外基質(zhì)沉積［22］。TSP?1參與促進多種因素誘導的器官纖維化［23?24］。TSP?1通過激活TGF?β1增強纖維化反應，TSP?1/TGF?β 信號通路在糖尿病、肝纖維化和多發(fā)性骨髓瘤的纖維化中發(fā)揮作用［25］。這支持了本文中血清TSP?1水平與TGF?β1呈正相關(guān)，也提示TSP?1水平可能反映了OA患者的軟骨滑膜纖維化程度。

本研究尚存在以下局限性：（1）膝OA 患者血清TSP?1是否來源于病變膝關(guān)節(jié)軟骨有待病理活檢證實。（2）所納入的樣本數(shù)較小且屬于臨床橫斷面研究，今后還需要在擴大的樣本中增加對關(guān)節(jié)液和血清之間TSP?1相關(guān)性的分析。（3）僅分析了血清中的相關(guān)指標，并未評估滑膜組織中TSP?1的表達水平，TSP?1與關(guān)節(jié)軟骨纖維化的關(guān)系和機制需要在動物實驗中進一步證實。

綜上所述，膝OA 患者血清TSP?1 水平異常升高，與疾病的發(fā)展密切相關(guān)，因而可以作為血清生物標志物監(jiān)測疾病的發(fā)展程度。此外，TSP?1 可作為OA 纖維化的一個潛在的靶點，為深入探討OA 的發(fā)病機制及臨床尋找治療靶點奠定了基礎。