黃芪甲苷調(diào)控線粒體自噬減輕5?Fu誘導(dǎo)老齡大鼠心肌毒性的實驗研究

李沅洋 ，周湘忠，雷向紅，張宇凡 ，徐月，魏麗萍

5?氟尿嘧啶（5?fluorouocil，5?Fu）是抗代謝類化療藥物，臨床應(yīng)用廣泛，尤其對于無法耐受手術(shù)需藥物化療的老齡患者意義重大。然而，5?Fu發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的同時存在多器官不良反應(yīng)，其中腫瘤相關(guān)心血管疾病報道尤為多見［1?2］。5?Fu 用于老齡尤其是伴有心血管基礎(chǔ)疾病的患者時心臟毒性發(fā)生率更高，程度更重［3］。因此，應(yīng)重視化療藥物心臟毒性的防治。黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，AS?Ⅳ）是黃芪的主要活性成分，可通過清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化等途徑參與心肌細(xì)胞的保護(hù)［4］。本研究擬在老齡鼠模型中評價AS?Ⅳ對5?Fu 誘導(dǎo)心肌毒性的保護(hù)作用，從調(diào)控線粒體自噬穩(wěn)態(tài)角度初探其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 18月齡（老齡）雄性SD大鼠36只，平均體質(zhì)量（600±50）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，動物許可證號：SCXK（京）2019?0006。將大鼠依次編號，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分為對照組、模型組和AS?Ⅳ組，每組12只。所有大鼠飼養(yǎng)于天津市人民醫(yī)院恒溫動物實驗中心，自由進(jìn)食水。經(jīng)預(yù)實驗后以5?Fu 注射液30 mg/kg，隔日1 次，腹腔注射，連續(xù)7 次，構(gòu)建5?Fu 心臟毒性模型，對照組等方式等劑量給與0.9%氯化鈉注射液；AS?Ⅳ組在造模基礎(chǔ)上以AS?Ⅳ稀釋液20 mg/kg，每日 1 次，灌胃，連續(xù) 14 次。本實驗經(jīng)天津市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2020?B03）。

1.2 主要儀器和試劑 氟尿嘧啶注射液（20 mg/支，天津金耀氨基酸有限公司，批準(zhǔn)文號H12020959），大鼠血清心肌肌鈣蛋白I（cTnI）及肌酸激酶同工酶（CK?MB）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢Elabscience 有限公司），線粒體腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）及膜電位檢測試劑盒（上海碧云天有限公司），兔源LC3Ⅱ一抗（美國Proteintech Group公司），Beclin1、Parkin、PINK1、LAMP、COX?Ⅳ一抗（沈陽萬類生物有限公司），LC3 一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG（美國Cell Signaling Technology 公司）。多功能酶標(biāo)儀（美國Bio?Rad 公司），光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡（日本Nikon公司），透射電鏡（日本日立公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio?Rad公司）。AS?Ⅳ購自Med Chem Express，純度為98.0%，實驗藥物用量參照產(chǎn)品在體實驗推薦劑量。按照大鼠總用量取AS?Ⅳ粉劑，溶于10% DMSO 中配制為20 mmol/L 母液于?4 ℃保存，用時取出適量母液在超聲助溶下以0.9%氯化鈉注射液稀釋成10 mmol/L。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠一般情況觀察 各組大鼠自給藥前1 d起至第15天，連續(xù)監(jiān)測體質(zhì)量，依據(jù)體質(zhì)量給予相應(yīng)劑量藥物，最終以給藥第0、3、6、9、12、15天體質(zhì)量值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。同時觀察給藥期間各組大鼠毛色、精神狀態(tài)、納食、二便等情況。于實驗第15天處死取材。至實驗結(jié)束，模型組死亡3只，AS?Ⅳ組死亡1只。

1.3.2 血清cTnI 及CK?MB 檢測 腹主動脈取血，室溫靜置30 min，離心（4 ℃，1 000×g，15 min），收集血清。每組取6只，采用ELISA 法檢測大鼠血清CK?MB、cTnI 含量。酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量光密度（OD）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本指標(biāo)含量。

1.3.3 線粒體ATP 檢測 取新鮮心肌組織20 mg，加入裂解液，勻漿低溫離心（4 ℃，12 000×g，5 min）取上清，將ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同濃度制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制ATP 檢測工作液，將100 μL ATP 檢測工作液加入不透光96 孔板內(nèi)，室溫靜置5 min 消除ATP 本底后加入待檢樣品，采用化學(xué)發(fā)光儀（luminometer）測定RLU 值。取少量上清用BCA 法檢測蛋白濃度，最終ATP值需轉(zhuǎn)換為μmol/g蛋白形式進(jìn)行定量。該指標(biāo)需以新鮮組織、低溫環(huán)境下提取線粒體，以保證細(xì)胞存活及線粒體呼吸代謝相關(guān)酶的活性，對時間效率要求較高。因此實驗中調(diào)整樣本量（n=5），達(dá)到取材與線粒體提取同時進(jìn)行，縮短耗時以減少誤差。

1.3.4 膜電位檢測 取新鮮心肌組織20 mg，冰上勻漿提取線粒體，按試劑盒配制JC?1緩沖液，將碳酰氰基?對?氯苯腙（CCCP）稀釋成10 μmol/L，制備陽性對照，于不透光96 孔板中加入JC?1 檢測工作液及樣本，充分混勻后采用熒光顯微鏡檢測JC?1單體及聚合體激發(fā)光與發(fā)射光熒光值。以膜電位聚合體與單體紅/綠熒光比值（R/G）為最終結(jié)果。該指標(biāo)同樣需以新鮮組織、低溫環(huán)境下提取線粒體，除需保證細(xì)胞存活及線粒體膜完整性外，JC?1 工作液染色后也需立即觀察，以減少熒光淬滅。該指標(biāo)與線粒體ATP 檢測同時進(jìn)行，每組取5只。

1.3.5 組織病理學(xué)分析 取左心室組織固定于4%多聚甲醛48 h，脫水包埋組織，切片（4 μm），并行蘇木精?伊紅（HE）染色及Masson 染色。樣品于光學(xué)顯微鏡下觀察、攝片。采用Image J軟件進(jìn)行心肌纖維化程度相對定量分析，心肌膠原容積百分比（collagen volume fraction，CVF%）=陽性藍(lán)染面積/組織總面積×100%。因5?Fu 所誘導(dǎo)的心臟毒性以心肌收縮力下降為主［5?6］，左心室結(jié)構(gòu)及功能為評估心臟受損的良好指標(biāo)，同時為使組織充分固定，避免裂片及染色不均，故選取左心室進(jìn)行病理（HE、Masson、LC3Ⅱ）及電鏡觀察。因模型組死亡3只，每組取4只進(jìn)行觀察分析。

1.3.6 電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu) 取新鮮左心室心肌組織切成體積＜1 mm3的組織塊，于2.5%戊二醛固定液中固定24 h，沖洗后，于1%鋨酸固定液固定2 h，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋后超薄切片機(jī)切片，超薄切片經(jīng)枸櫞酸鉛、醋酸鈾雙重染色后，嵌入環(huán)氧樹脂。樣品于透射電鏡下觀察、攝片。

1.3.7 LC3Ⅱ免疫熒光染色檢測 心肌石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，置于加入檸檬酸修復(fù)液（pH=6.0）的修復(fù)盒中，中火8 min 煮沸，保溫數(shù)分鐘后中小火7 min。自然冷卻后洗滌。10%山羊血清室溫封閉30 min。加入LC3Ⅱ一抗，4 ℃過夜。一抗修復(fù)完畢后復(fù)溫、洗滌；滴加二抗，室溫避光孵育60 min。洗滌后滴加DAPI，室溫避光染核5 min，PBS 沖洗。封片后熒光顯微鏡下觀察、攝片。采用Image J 軟件進(jìn)行陽性標(biāo)記計數(shù)。

1.3.8 蛋白質(zhì)免疫印跡分析 取新鮮心肌組織勻漿提取線粒體蛋白，BCA法定量、SDS?PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，4 ℃過夜孵育PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、COX?Ⅳ抗體（稀釋度均為1∶500）及LC3 抗體（稀釋度為1∶1 000），次日洗膜后以辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（稀釋度為1∶1 000）繼續(xù)孵育90 min。掃描膠片，采用Image J軟件進(jìn)行相對定量分析，各目的蛋白以COX?Ⅳ（內(nèi)參蛋白）進(jìn)行校正。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布計量資料采用表示，各組間比較采用單因素方差分析，結(jié)合Tukey's檢驗進(jìn)行多重比較，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 對照組大鼠飲食活動情況良好，體質(zhì)量保持穩(wěn)定狀態(tài)。模型組出現(xiàn)活動力差，納差，并伴有不同程度的腹瀉癥狀，自給藥第6天起體質(zhì)量下降。經(jīng)AS?Ⅳ干預(yù)后，大鼠精神狀態(tài)及攝食情況優(yōu)于模型組，體質(zhì)量下降幅度較小。實驗過程各組大鼠體質(zhì)量變化趨勢，見圖1。

Fig.1 Changes of rat body weight in each group圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化

2.2 3 組大鼠心肌酶變化 與對照組相比，模型組血清 cTnI 及 CK?MB 水平明顯升高（P＜0.05），而AS?Ⅳ組上述心肌酶指標(biāo)較模型組顯著降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of CK-MB and cTnI levels between three groups表1 各組大鼠血清CK-MB及cTnI水平比較（ng/L，）

Tab.1 Comparison of CK-MB and cTnI levels between three groups表1 各組大鼠血清CK-MB及cTnI水平比較（ng/L，）

＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組AS?Ⅳ組F n6 6 6 cTnI 44.71±6.56 147.45±33.64a 109.84±29.03ab 20.535＊CK?MB 26.20±7.49 143.18±38.74a 77.78±27.24ab 13.456＊

2.3 3組大鼠心肌線粒體功能損傷情況 與對照組相比，模型組線粒體ATP 水平及膜電位均明顯下降（P＜0.05）。與模型組相比，AS?Ⅳ組ATP 水平顯著升高（P＜0.05），膜電位R/G 比值2 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of MMP and ATP levels between three groups表2 各組大鼠心肌組織線粒體膜電位及ATP水平比較（）

Tab.2 Comparison of MMP and ATP levels between three groups表2 各組大鼠心肌組織線粒體膜電位及ATP水平比較（）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組AS?Ⅳ組F n5 5 5 ATP（μmol/g）0.88±0.18 0.36±0.05a 0.64±0.15ab 13.062＊＊膜電位（R/G）1.97±0.44 0.95±0.34a 1.50±0.33 5.610＊

2.4 3組大鼠心肌纖維化變化 HE染色結(jié)果：對照組心肌纖維排列整齊，未見特異性病理改變；模型組心肌細(xì)胞排列欠規(guī)則，心肌纖維略顯粗大，部分細(xì)胞核深染濃集；AS?Ⅳ組心肌纖維排列欠規(guī)則，但并無明顯特異性病理改變。Masson 染色結(jié)果：對照組心肌間質(zhì)纖維可見少量藍(lán)染區(qū)域，呈輕微纖維化表現(xiàn)；模型組心肌纖維增粗，間隔增大，可見較多間質(zhì)藍(lán)染區(qū)，纖維化程度較重；AS?Ⅳ組心肌間質(zhì)仍可見纖維化，但程度較模型組減低，見圖2。與對照組膠原容積百分比（3.53%±0.88%）相比，模型組（16.74%±1.84%）升高，與模型組相比，AS?Ⅳ組（10.18%±0.87%）明顯減低（F=40.331，P＜0.05）。

2.5 3組大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)及功能變化 對照組心肌細(xì)胞質(zhì)膜完整，肌絲排列整齊，線粒體結(jié)構(gòu)正常，線粒體嵴排列致密，可見單個自噬小體；模型組表現(xiàn)為線粒體稀疏，核周間隙擴(kuò)張，線粒體部分腫脹、固縮，形態(tài)不均，并可見較多脂滴沉積及自噬小體，線粒體結(jié)構(gòu)破壞較為嚴(yán)重；AS?Ⅳ組顯示線粒體排列欠規(guī)則，線粒體出現(xiàn)腫脹，但形態(tài)及結(jié)構(gòu)大致正常，其間可見單個散在自噬泡，見圖3。

2.6 3組大鼠心肌組織LC3Ⅱ表達(dá)水平比較 與對照組 LC3 Ⅱ表達(dá)量（84.00±7.55）相比，模型組（167.75±14.01）升高，與模型組相比，AS?Ⅳ組LC3Ⅱ表達(dá)量（120.05±16.09）則減低（F=35.321，P＜0.05），見圖4。

Fig.2 The pathological morphology of myocardial tissues under light microscope bebween the three groups圖2 3組大鼠心肌組織光鏡下病理形態(tài)變化

Fig.3 The pathological morphology of myocardial mitochondria under electron microscope bebween the three groups圖3 3組大鼠電鏡下心肌線粒體形態(tài)變化

Fig.4 The protein expression levels of LC3Ⅱ in myocardial tissues(×400)圖4 3組大鼠心肌組織LC3Ⅱ免疫熒光標(biāo)記染色（×400）

2.7 3組大鼠心肌線粒體自噬PINK1/Parkin 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對照組相比，模型組Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP 及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05），AS?Ⅳ組 Beclin1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ及LAMP 表達(dá)量則較模型組減低（P＜0.05），見圖5、表3。

Fig.5 The proteins expressions of PINK1/Parkin pathway in myocardial tissues圖5 大鼠心肌組織PINK1/Parkin通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Tab.3 Comparison of the protein expression of PINK1/Parkin pathway in myocardial tissues between three groups表3 大鼠心肌組織PINK1/Parkin通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=4，）

Tab.3 Comparison of the protein expression of PINK1/Parkin pathway in myocardial tissues between three groups表3 大鼠心肌組織PINK1/Parkin通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=4，）

＊＊P＜0.05，＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組AS?Ⅳ組F 0.73±0.12 1.54±0.13a 1.26±0.21ab 33.365＊＊1.01±0.66 1.54±0.20a 1.19±0.13b 7.774＊組別對照組模型組AS?Ⅳ組F Parkin 0.77±0.27 1.62±0.09a 1.06±0.11b 8.949＊LAMP 0.61±0.09 1.21±0.12a 0.91±0.13ab 22.935＊＊LC3Ⅱ/Ⅰ1.09±0.18 1.43±0.95a 1.16±0.10b 5.309＊Beclin1PINK1

3 討論

5?Fu用于化療時存在潛在且嚴(yán)重的心臟毒性，在關(guān)注高齡患者化療藥物心臟毒性損傷的同時，需更加關(guān)注其心臟毒性的預(yù)防及治療。

5?Fu引起心臟毒性的發(fā)病機(jī)制是多方面的，線粒體損傷是一種機(jī)制假說。藥理機(jī)制研究指出5?Fu 體內(nèi)代謝產(chǎn)物氟?檸檬酸（F?Cltrate）可作用于線粒體，阻斷三羧酸循環(huán)，減少ATP 產(chǎn)生，改變線粒體膜通透性，從而導(dǎo)致線粒體功能異常［7］。線粒體損傷導(dǎo)致有缺陷的細(xì)胞器逐漸積累，由此線粒體自噬被啟動［8］。自噬是一種程序化的細(xì)胞內(nèi)降解過程，平衡的自噬可滿足代謝需要、細(xì)胞器更新及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［9］。自噬的激活通常被認(rèn)為具有心臟保護(hù)性，而過度的自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡和心肌受損［10?11］。

PINK1/Parkin 信號通路是已知的研究較為深入的線粒體自噬信號通路，其參與多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展［12?13］。Kubli 等［14］證實沉默 PINK1 基因后心肌細(xì)胞中線粒體功能受損，氧化應(yīng)激水平增高，進(jìn)而引起心力衰竭。Givvimani 等［15］在小鼠升主動脈縮窄誘導(dǎo)的心力衰竭模型中也發(fā)現(xiàn)抑制線粒體自噬后可明顯減少升主動脈縮窄引起的心肌纖維化。因此，自噬的動態(tài)變化對心血管疾病具有不同的意義，即維持平衡狀態(tài)的自噬有益于心肌保護(hù)，但線粒體自噬過度則可能加重心肌損傷。本研究大鼠在經(jīng)5?Fu 刺激后線粒體自噬PINK1/Parkin 信號通路相關(guān)蛋白Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP和LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高，提示線粒體自噬參與了5?Fu誘導(dǎo)的心肌損傷，且線粒體可呈現(xiàn)自噬過度狀態(tài)。

黃芪是經(jīng)典的多效中藥之一，臨床用于冠心病、心絞痛的治療且已取得顯著療效［16］。AS?Ⅳ是黃芪的主要成分之一，研究表明AS?Ⅳ通過激活一氧化氮合成酶（NOS）產(chǎn)生一氧化氮（NO），從而激活cGMP/PKG 信號通路，進(jìn)一步使糖原合成酶激酶?3（GSK?3）失活，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，發(fā)揮心肌線粒體保護(hù)作用［17］；同時AS?Ⅳ能夠下調(diào)心肌組織磷酸化縫隙連接蛋白3（P?Cx3）以及Caspase?3表達(dá)水平，上調(diào)Bcl?2的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡［18］。

基于以上研究基礎(chǔ)，筆者參照 Li 等［19?20］干預(yù)方式以觀察AS?Ⅳ對化療藥物心臟損傷的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在5?Fu 誘導(dǎo)的心臟毒性模型中給予AS?Ⅳ干預(yù)能改善大鼠的一般狀況，包括體質(zhì)量、攝食及精神狀態(tài)；此外，組織病理學(xué)檢測以及心肌酶學(xué)檢測結(jié)果均表明AS?Ⅳ可減輕心肌細(xì)胞損傷、減緩心肌組織纖維化進(jìn)展，并能改善心肌細(xì)胞線粒體質(zhì)量，從而緩解化療藥物對心肌的損傷。

線粒體質(zhì)量控制是維持細(xì)胞正常活動的關(guān)鍵，線粒體自噬過程對于質(zhì)量控制至關(guān)重要［21］。研究表明AS?Ⅳ通過PINK1/Parkin 信號通路參與多種心血管疾病的預(yù)防及治療［22?23］。黃莉等［24］以心肌缺血再灌注模型觀察AS?Ⅳ對細(xì)胞自噬及心肌組織損傷的影響，結(jié)果表明AS?Ⅳ能夠降低Beclin1 的表達(dá)，抑制自噬從而保護(hù)心肌。為進(jìn)一步探索AS?Ⅳ參與調(diào)節(jié)線粒體自噬的分子機(jī)制，本研究對PINK1/Parkin信號通路蛋白表達(dá)進(jìn)行定量，結(jié)果表明AS?Ⅳ可降低Beclin1和LAMP蛋白表達(dá)。LAMP為溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合狀態(tài)，AS?Ⅳ干預(yù)后LAMP 蛋白表達(dá)水平降低，提示線粒體自噬通量下降，表明AS?Ⅳ可通過抑制線粒體自噬PINK1/Parkin通路過度激活，調(diào)控自噬穩(wěn)定狀態(tài)，從而維持心肌線粒體數(shù)量與質(zhì)量的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

綜上，AS?Ⅳ可減輕5?Fu誘導(dǎo)心肌損傷，其機(jī)制可能是AS?Ⅳ通過調(diào)節(jié)線粒體自噬穩(wěn)態(tài)，改善線粒體質(zhì)量，從而發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。本研究在動物實驗基礎(chǔ)上初步探索了AS?Ⅳ在預(yù)防及改善5?Fu誘導(dǎo)心肌毒性中的作用與機(jī)制，為腫瘤患者尤其是老齡患者臨床化療安全性提供了新的干預(yù)策略及研究方向。