Xyloketal B對發(fā)育期大鼠驚厥后腦損傷的保護作用及機制研究

陳芬芳，胡擎鵬

驚厥是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由大腦神經(jīng)元同步化過度放電引起，反復(fù)的驚厥發(fā)作可導(dǎo)致癲癇［1?3］。傳統(tǒng)治療僅控制驚厥發(fā)作的強度和頻率，而不改變疾病的病理過程［4］。因此，探討驚厥的發(fā)病機制，尋找新的抗驚厥藥物具有重要意義。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是眾多疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)［5?6］。核因子 E2 相關(guān)因子 2（nuclear factor E2?related factor 2，Nrf2）是細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，受多區(qū)域阻遏蛋白Keap1的調(diào)控，通過與抗氧化反應(yīng)元件（anti?oxidative response element，ARE）相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達［7?8］，減輕氧自由基和內(nèi)源性毒素對神經(jīng)元的毒性作用［9］。目前對Nrf2 信號通路的研究主要集中在腦出血、腦梗死和神經(jīng)退行性疾病等［10?11］，在癇性驚厥發(fā)病機制中報道尚少見。

Xyloketal B（Xyl?B）是一種新型的海洋天然產(chǎn)物［12］,被證明具有多種生物活性，包括抗神經(jīng)毒性、內(nèi)皮細胞抗氧化作用、抑制炎癥通路等［13?14］。目前有關(guān)Xyl?B 在癇性驚厥中作用的研究報道尚罕見。由于驚厥的病理過程與氧化應(yīng)激及炎癥損傷有關(guān)，因此筆者推測Xyl?B可能干預(yù)驚厥的病理過程并對驚厥后腦損傷有保護作用。鑒于此，本研究通過建立發(fā)育期大鼠驚厥模型，觀察驚厥后Nrf2 信號通路的變化，探討Xyl?B 對發(fā)育期驚厥后腦損傷的保護作用及對氧化應(yīng)激通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 20日齡SPF級健康SD大鼠40只（南華大學實驗動物中心）。海人酸（KA，加拿大Bio?Techne Canada），Xyl?B（中山大學），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PVDF 膜（美國Millipore 公司），Keap1、Nrf2、血紅素氧合酶（HO）?1、依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1（NQO1）、白細胞介素（IL）?6 及β?actin 兔抗大鼠抗體（美國Abcam 公司），caspase3和Bcl?2兔抗大鼠抗體（美國Cell Signaling Technology），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（美國Abcam 公司），免疫熒光NeuN 和GFAP 抗體，IgG二抗（美國Sigma 公司），ECL 化學發(fā)光劑（德國Santa Cruz 公司），Trizol 試劑（美國GIBCO BRL 公司），逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（A5000，美國Promega 公司），蘇木素?伊紅染色液（浙江康泰生物科技有限公司）。熒光顯微鏡（日本Olympus），石蠟切片機及實時定量7500 PCR 儀（Thermo Fisher Scientific 公司），電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（美國 BIO?RAD公司）。

1.2 大鼠驚厥模型的建立及分組 40 只SD 大鼠按隨機數(shù)字表法分為 4 組，Control 組、KA 組、KA+Xyl?B（25 mg/kg）組及 KA+Xyl?B（50 mg/kg）組，每組 10 只，通過腹腔注射 KA 15 mg/kg制作大鼠驚厥模型，參考Racine分級標準［15］。0級：無發(fā)作；Ⅰ級：節(jié)律性口角或面部肌肉抽搐；Ⅱ級：點頭，前肢或尾伸展；Ⅲ級：前肢陣攣但不伴隨直立；Ⅳ級：前肢陣攣伴隨直立；Ⅴ級：全身強直性陣攣伴姿勢失控；出現(xiàn)Ⅳ～Ⅴ級癇性驚厥發(fā)作為造模成功；KA+Xyl?B 各組在KA 誘導(dǎo)驚厥前2 h腹腔注射Xyl?B（25 mg/kg或50 mg/kg）預(yù)治療，KA組僅注射KA 誘導(dǎo)驚厥，Control 組僅注射生理鹽水。造模時KA+Xyl?B（50 mg/kg）組 有 2 只 未 出 現(xiàn) 驚 厥 發(fā) 作 ，KA+Xyl?B（25 mg/kg）組有1 只未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，KA 組有1 只出現(xiàn)驚厥持續(xù)狀態(tài)而導(dǎo)致死亡，造模成功率為86.7%。

1.3 免疫熒光觀察神經(jīng)元數(shù)量和活化星形膠質(zhì)細胞 大鼠驚厥后24 h，將大鼠用2%異氟烷麻醉，固定頭和四肢，開胸腔，暴露心臟，灌流針插入左心尖，右心耳剪小口，先予生理鹽水后予4%多聚甲醛灌流，直至肉眼看到肝臟變白，取出海馬組織于4%多聚甲醛中浸泡24 h，后置于30%蔗糖溶液脫水，再置于OCT 包埋劑，在冰凍切片機上切成5 μm 厚組織片。組織片置于0.5%TritonX?100室溫通透20 min，用含10%山羊血清室溫封閉切片1 h 以消除非特異性染色，分別加入抗神經(jīng)元核抗體NeuN（神經(jīng)元核抗原抗體，兔抗大鼠1∶500）和抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體（兔抗大鼠1∶500），4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，每次10 min；加入熒光標記的羊抗兔IgG 二抗（1∶1 000），37 ℃避光孵育 2 h，PBS 洗 3 次，每次10 min；用羊血清稀釋 4',6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI，1∶1 000），避光孵育30 min染細胞核，PBS洗3次，每次10 min。清洗后進行封片，通過熒光顯微鏡觀察結(jié)果。鏡下對每張切片隨機讀取5個面積相同的高倍視野（×400倍），肉眼計數(shù)每個視野NeuN或GFAP染色陽性細胞數(shù)，取平均值即為神經(jīng)元或活化的星形膠質(zhì)細胞數(shù)。

1.4 qPCR 檢測Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、caspase3、Bcl-2和IL-6mRNA表達量 大鼠驚厥后24 h分成兩批取海馬組織，用于qPCR的組織加入Trizol裂解液和氯仿，經(jīng)過分離、沉淀、干燥等步驟得到總RNA。按照Promega cDNA 合成試劑盒的說明，加入樣本RNA、反轉(zhuǎn)錄酶合成模板cDNA。按照qPCR試劑盒說明書，加入cDNA、上游引物和下游引物在PCR儀上進行DNA 擴增。qPCR 引物見表1，qPCR 循環(huán)擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，退火（Keap1，56 ℃，45 s；Nrf2，55 ℃，60 s；HO-1，58 ℃，45 s；NQO1，58 ℃，45 s；caspase3，57 ℃，45 s；Bcl-2，57 ℃，45 s；IL-6，57 ℃，45 s），72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)。GAPDH（內(nèi)參），95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性，30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，26個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后 4 ℃冷卻。采用 2?ΔΔCt法計算 mRNA 的相對表達量。

Tab.1 Nucleotide sequence of qPCR primer表1 qPCR引物序列

1.5 Western blot 檢測 Keap1、Nrf2、HO?1、NQO1、caspase3、Bcl?2 和IL?6 蛋白表達量 取分離的大腦海馬組織，加入RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑，用玻璃棒勻漿直至組織充分破碎。5 000 r/min 離心10 min 分離上清液，BCA 法測定蛋白濃度。按說明書配制分離膠和濃縮膠并放至電泳槽內(nèi)。樣品與5×Loading buffer 按體積4∶1 混合，98 ℃煮沸5 min；上樣時每個孔蛋白總量和體積保持一致。先于電泳槽中電泳分離不同分子質(zhì)量蛋白條帶；電泳結(jié)束后在轉(zhuǎn)膜槽中進行轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用PBS 浸泡PVDF膜，再用5%脫脂牛奶封閉，室溫下水平搖床封閉2 h；棄去封閉液，孵一抗：加兔抗大鼠Keap1（1∶1 000）、兔抗大鼠Nrf2（1∶500）、兔抗大鼠HO?1（1∶2 000）、兔抗大鼠NQO1（1∶1 000）、兔抗大鼠caspase3（1∶5 000）、兔抗大鼠Bcl?2（1∶1 000）、兔抗大鼠IL?6（1∶1 000）抗體，兔抗大鼠β?actin（1∶2 000），4 ℃孵育過夜；用PBST 洗膜3 次，每次10 min；孵二抗：辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵2 h，再次用PBST清洗 3 次，每次 10 min；使用 ECL 發(fā)光劑，將發(fā)光液 A 和 B 按1∶1 等體積混合后滴加到PVDF 膜；用顯影儀掃描膠片并分析蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，2 組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光觀察成熟神經(jīng)元和活化星形膠質(zhì)細胞 （1）成熟神經(jīng)元。Control 組可見較多的成熟神經(jīng)元（NeuN 陽性細胞），結(jié)構(gòu)清楚，細胞核大而圓，染色均勻；KA 組神經(jīng)元數(shù)量較Control 組明顯減少（P＜0.05），細胞核變小，伴有不規(guī)則結(jié)構(gòu)，染色不均勻，分布變稀疏；KA+Xyl?B（25 mg/kg）組成熟神經(jīng)元數(shù)量較KA 組無顯著增多，僅細胞核變大變圓；KA+Xyl?B（50 mg/kg）組成熟神經(jīng)元數(shù)量較KA 組和KA+Xyl?B（25 mg/kg）組顯著增多（P＜0.05），細胞核大而圓，染色和分布均勻，見圖1、2。（2）活化星形膠質(zhì)細胞。Control 組可見少許活化星形膠質(zhì)細胞（GFAP 陽性細胞），胞體瘦小，突起纖細，分布稀疏；KA 組活化星形膠質(zhì)細胞數(shù)量較Control 組明顯增加（P＜0.05），胞體肥大，突起增多、增粗；KA+Xyl?B（25 mg/kg）組活化星形膠質(zhì)細胞數(shù)量較KA組減少（P＜0.05），細胞胞體變小，突起變細；KA+Xyl?B（50 mg/kg）組活化星形膠質(zhì)細胞數(shù)量較KA組和KA+Xyl?B（25 mg/kg）組減少（P＜0.05），細胞胞體及突起減少，見圖3、4。

Fig.1 Mature neuronal cells observed by immunofluorescence(×400)圖1 免疫熒光觀察成熟的神經(jīng)元（×400）

Fig.2 Comparison of the number of neuronal cells between the four groups圖2 4組成熟神經(jīng)元數(shù)量的比較

Fig.3 Activated astrocytes observed by immunofluorescence(×400)圖3 免疫熒光觀察活化的星形膠質(zhì)細胞（×400）

Fig.4 Comparison of the number of activated astrocytes between the four groups圖4 4組活化星形膠質(zhì)細胞數(shù)量的比較

2.2 Xyl?B 對Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1 mRNA 表達的影響 與Control 組比較，KA 組海馬組織Keap1mRNA 表達水平明顯升高，Nrf2、HO-1和NQO1mRNA 表達水平均明顯降低（P＜0.05）；與KA 組比較，KA+Xyl?B（25 mg/kg）組和KA+Xyl?B（50 mg/kg）組Keap1mRNA 表達水平明顯降低，Nrf2、HO-1和NQO1mRNA 表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與KA+Xyl?B（25 mg/kg）組比較，KA+Xyl?B（50 mg/kg）組Nrf2和HO-1mRNA 表達水平升高（P＜0.05），Keap1、NQO1mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

2.3 Xyl?B 對Keap1、Nrf2、HO?1 和NQO1 蛋白表達的影響 與Control組比較，KA組Keap1蛋白表達水平明顯升高，Nrf2、HO?1 和 NQO1 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）；與 KA 組比較，KA+Xyl?B（25 mg/kg）組和KA+Xyl?B（50 mg/kg）組Keap1 蛋白表達水平明顯降低，Nrf2、HO?1 和NQO1 蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與KA+Xyl?B（25 mg/kg）組比較，KA+Xyl?B（50 mg/kg）組Nrf2 蛋白表達水平降低，HO?1 蛋白表達水平升高（P＜0.05），Keap1、NQO1 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

Fig.5 The mRNA expression levels of Keap1,Nrf2,HO-1 and NQO1 in hippocampus 24 h after seizure detected by qPCR圖5 qPCR檢測驚厥24 h后海馬區(qū)Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1 mRNA表達量

Fig.6 The protein expression levels of Keap1,Nrf2,HO?1 and NQO1 in hippocampus 24 h after seizure detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測驚厥24 h后海馬區(qū)Keap1、Nrf2、HO?1和NQO1蛋白表達量

2.4 Xyl?B 對caspase3、Bcl-2和IL-6mRNA 表達的影響 與Control組比較，KA組caspase3、IL-6mRNA表達水平明顯升高，Bcl-2mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）；與KA組比較，KA+Xyl?B（25 mg/kg）組和KA+Xyl?B（50 mg/kg）組caspase3、IL-6mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05），KA+Xyl?B（25 mg/kg）組Bcl-2mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），KA+Xyl?B（50 mg/kg）組Bcl-2mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與 KA+Xyl?B（25 mg/kg）組比較，KA+Xyl?B（50 mg/kg）組Bcl-2mRNA表達水平升高（P＜0.05），caspase3、IL-6mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖7。

2.5 Xyl?B 對caspase3、Bcl?2和IL?6蛋白表達的影響 與 Control 組比較，KA 組 caspase3、IL?6 蛋白表達水平明顯升高，Bcl?2 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）；與KA組比較，KA+Xyl?B（25 mg/kg）組和KA+Xyl?B（50 mg/kg）組 caspase3、IL?6 蛋白表達水平明顯降低，Bcl?2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與 KA+Xyl?B（25 mg/kg）組比較，KA+Xyl?B（50 mg/kg）組Bcl?2蛋白表達水平升高，IL?6蛋白表達水平降低（P＜0.05），caspase3 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖8。

3 討論

驚厥是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的腦部疾病，癇性驚厥會加重氧化應(yīng)激，促進活性氧（ROS）的產(chǎn)生，引起神經(jīng)元過度興奮、巨噬細胞的氧化損傷和細胞凋亡，并引起顱內(nèi)長期生化改變［16?17］，因而氧化應(yīng)激被認為是驚厥潛在的發(fā)病機制。本研究選擇KA誘導(dǎo)癇性驚厥模型，該模型類似于人類顳葉癲癇模型，同時KA 與神經(jīng)興奮毒性和ROS 水平有關(guān)。

Keap1 通過含有E3 的Cul3 泛素連接酶與Nrf2結(jié)合在一起。Nrf2是調(diào)節(jié)細胞抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以促進一系列抗氧化劑保護蛋白的表達，同時參與調(diào)控多種保護性排毒和抗炎癥基因的表達，協(xié)同提高細胞防御系統(tǒng)的效率［18］。在生理情況下，Keap1與Nrf2結(jié)合使其處于抑制狀態(tài)，在外界氧化應(yīng)激源影響下，Nrf2 與Keap1 解耦聯(lián)后與抗氧化反應(yīng)元件ARE 結(jié)合，激活Nrf2 信號通路，從而啟動抗氧化蛋白HO?1、超氧化物歧化酶（SOD）、NQO1等的表達，減少氧化損傷和有毒代謝產(chǎn)物的積累［19］。Wang 等［20］研究表明，當杏仁核被迅速點燃后，海馬中Nrf2、HO?1 和NQO1 mRNA 和蛋白表達水平顯著升高，提示Nrf2 信號通路在驚厥發(fā)作早期起著重要作用。Wu 等［21］研究發(fā)現(xiàn)激活 Nrf2?ARE 信號通路具有抗驚厥及改善驚厥大鼠認知功能的作用，而Nrf2基因敲除小鼠驚厥發(fā)作更嚴重并伴有明顯的認知障礙。本研究結(jié)果顯示，驚厥后KA 組Keap1 mRNA 和蛋白表達水平顯著增高，而Nrf2、HO?1 和NQO1 mRNA 和蛋白表達水平顯著降低，Nrf2/HO?1信號通路被抑制；提示驚厥后氧化應(yīng)激通路被激活，而抗氧化通路被抑制，這與既往研究結(jié)果［20］一致。

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的大膠質(zhì)細胞，在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、血腦屏障形成和神經(jīng)興奮傳遞等方面具有重要作用。星形膠質(zhì)細胞是谷氨酸（Glu）和γ?氨基丁酸（GABA）代謝的場所，對胞外鉀離子具有空間緩沖作用，可以維持神經(jīng)元周圍離子平衡［22?23］；同時，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、感染、毒素的刺激下，星形膠質(zhì)細胞可參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥過程［24］。在驚厥的病理過程中，K+通道參與調(diào)節(jié)細胞膜靜息電位及動作電位的復(fù)極化過程，決定動作電位的發(fā)放頻率和幅度，與神經(jīng)元的興奮性密切相關(guān)［25］；同時驚厥發(fā)作時細胞內(nèi)外興奮性氨基酸和抑制性氨基酸代謝失衡，炎癥通路被激活［26］。有研究顯示，活化的星形膠質(zhì)細胞可通過促炎介質(zhì)、細胞因子和ROS 導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和凋亡［27］。本研究結(jié)果顯示，驚厥后KA 組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，而活化的星形膠質(zhì)細胞顯著增多，凋亡蛋白caspase3 和炎性因子IL?6表達水平升高；提示星形膠質(zhì)細胞的活化、神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)參與了癇性驚厥的病理過程。結(jié)合其他研究［28?29］，筆者推測其機制是，活化的星形膠質(zhì)細胞分泌多種免疫效應(yīng)分子，如IL?1、IL?6、IL?8、腫瘤壞死因子和氧自由基等，會破壞神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和血腦屏障，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部或廣泛損傷；同時膠質(zhì)細胞功能異?？蓪?dǎo)致鉀離子緩沖能力下降或者攝取GABA 過多，引起驚厥發(fā)作并加重驚厥后腦損傷。

Xyl?B 可作為氧自由基的清除劑，減少氧化低密度脂蛋白（ox?LDL）誘導(dǎo)下ROS 和過氧亞硝基陰離子的形成以及增高抗凋亡蛋白Bcl?2 的表達，具有抗氧化、保護血管內(nèi)皮、抗炎和抗凋亡能力等［30］。研究表明，Xyl?B 可以通過 PI3k/Akt 和 MAPKs 信號通路誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，激活Nrf2/HO?1信號通路，并可通過谷氨酸依賴性機制防止缺血性神經(jīng)元損傷［13，31］。本研究結(jié)果顯示，Xyl?B能逆轉(zhuǎn)驚厥后大鼠的上述病理變化，對驚厥后腦損傷起到保護作用，考慮其作用機制是：（1）Xyl?B通過抑制ROS產(chǎn)生和增強抗氧化酶活性來降低自由基水平。（2）通過增加抗凋亡蛋白的合成來抑制線粒體損傷和凋亡程序的啟動［32］。（3）通過Nrf2 信號通路提高抗氧化蛋白HO?1和NQO1的表達［30］。（4）通過抑制星形膠質(zhì)細胞活化和炎癥信號通路降低炎性因子的表達。（5）Xyl?B 可在發(fā)作期間阻斷過多的鈣離子內(nèi)流［33］，從而減少驚厥的發(fā)作，因本實驗的局限性，未對該病理過程進行研究。此外，本研究結(jié)果顯示，50 mg/kg Xyl?B 的干預(yù)效果整體上優(yōu)于25 mg/kg，提示Xyl?B對驚厥后腦損傷的保護作用可能有劑量依賴性。

綜上所述，Xyl?B 能激活Nrf2抗氧化應(yīng)激通路，抑制星形膠質(zhì)細胞活化、炎性因子及凋亡蛋白的表達，對驚厥后腦損傷發(fā)揮保護作用。