TSA對不同糖濃度下小鼠海馬神經(jīng)元HT?22細胞凋亡的影響

許雯，許永劼，劉歆蕾，沈婕，朱科靜，林海容，李興，潘衛(wèi)，△

糖尿病腦?。╠iabetic encephalopathy，DE）是由糖尿病引起的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，可能涉及氧化應(yīng)激、炎癥損傷、細胞凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病引起的學(xué)習(xí)和記憶缺陷可能由海馬神經(jīng)細胞凋亡介導(dǎo)［1?3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高糖能誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元HT?22 細胞凋亡，且隨著糖濃度的增加，細胞凋亡率顯著上升［4］。組蛋白乙?；揎椩谔悄虿〖捌洳l(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［5］，其在組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）和組蛋白去乙?；福℉DACs）的共同調(diào)控下能保持動態(tài)平衡，且對基因表達調(diào)控發(fā)揮重要的作用。組蛋白乙?；c神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)［6］，HDACs SIRT6 能調(diào)控糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期神經(jīng)退行性病變［7］。但是，目前組蛋白乙?；贒E 中的作用尚不清楚。曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）是一種廣譜組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi），它能通過增加細胞內(nèi)組蛋白的乙?；潭日T導(dǎo)細胞凋亡［8?9］。本研究利用TSA處理HT?22細胞，觀察HDACs對神經(jīng)細胞凋亡的影響，為研究DE的發(fā)病機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 小鼠海馬神經(jīng)元HT?22 細胞（中喬新舟公司）；0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；TSA（美國CST公司）；兔源β?肌動蛋白（β?actin）多克隆抗體、兔源Bcl?2 相關(guān)X 蛋白（Bax）多克隆抗體、兔源B 淋巴細胞瘤?2（Bcl?2）多克隆抗體、兔源半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase?3）多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體（武漢三鷹公司）；CCK8試劑盒（日本同仁公司）；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；RIPA高效裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Annexin V?FITC/PI細胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon 公司）；Western blot 電泳儀、IMARK 型酶標(biāo)儀（美國Bio?Rad公司）；流式細胞儀（美國Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取凍存的HT?22細胞于37 ℃水浴箱中復(fù)蘇，加入3 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，600 r/min，離心5 min，棄上清加入1 mL培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期的HT?22 細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組 取對數(shù)生長期的HT?22 細胞分別用高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度55 mmol/L）及普通培養(yǎng)基（葡萄糖濃度25 mmol/L）培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)基及普通培養(yǎng)基各分為2組：對照組（NC組）、抑制劑組（TSA組，加入TSA干預(yù)細胞）。

1.2.3 TSA 母液制備 取 1 mg TSA 溶于 826 μL DMSO 溶劑中，得到濃度為4 mmol/L 的TSA 母液，使用時用培養(yǎng)基稀釋到相應(yīng)濃度，剩余放置于?20 ℃儲存。

1.2.4 CCK8 法檢測細胞存活率 待細胞長到對數(shù)生長期，胰酶消化細胞，以1×105/mL密度均勻接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗分組按照1.2.2，同時另設(shè)置空白組（不含細胞僅含有培養(yǎng)基）；分別用1 mmol/L 的TSA作用TSA組細胞1、4、8 h，以及之后用0.4 mmol/L的TSA作用TSA組細胞1、4、8、12、14、16、20、24 h，每組設(shè)置5個復(fù)孔，用高糖培養(yǎng)基及普通培養(yǎng)基分別將TSA 母液稀釋成相應(yīng)濃度，以每孔100 μL 替換TSA 組原培養(yǎng)基；相應(yīng)作用時間結(jié)束，棄去各組培養(yǎng)基，每孔加100 μL檢測液（90 μL培養(yǎng)基+10 μL CCK8試劑），避光放于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中，反應(yīng)2.5 h后，酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的光密度（OD）值。細胞存活率=（TSA 組OD 均值?空白組OD 均值）（/NC 組OD 均值?空白組OD 均值）×100%。選擇最適的作用時間和濃度為后續(xù)實驗的抑制劑作用條件。

1.2.5 ELISA 法檢測HADC 和HAT 活性 在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、實驗孔，實驗孔分組按照1.2.2，用濃度為0.4 mmol/L的TSA作用TSA組20 h。標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，實驗孔加各組細胞裂解液各50 μL，空白孔不加；除空白孔外，其余孔各加HPR 標(biāo)記的山羊抗兔抗體100 μL，經(jīng)溫育、洗滌后，各孔加顯色劑 100 μL 避光反應(yīng)15 min 后，各孔加終止液50 μL。用空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測各孔OD 值，測定在加終止液后的15 min 內(nèi)完成，計算出樣品的濃度。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 分組按照1.2.2，用濃度為0.4 mmol/L 的 TSA 作用 TSA 組 20 h 后收集細胞懸液，用 PBS洗 2 次，加入 500 μL Binding Buffer 重懸細胞，加入 5 μL Annexin V?FITC 混勻，再加入5 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，1 h以內(nèi)上機檢測細胞凋亡率。

1.2.7 Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl?2、Bax、Caspase?3表達情況 用濃度為0.4 mmol/L的TSA作用TSA組20 h后提取各組細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，用RIPA稀釋蛋白液，將各組蛋白濃度調(diào)至一致，按4∶1 體積加入5×loading buffer，混合液煮沸 10 min，使蛋白變性。以30 μg 為統(tǒng)一上樣量，濃度為12%的分離膠，通過SDS?PAGE 凝膠電泳分離目的蛋白，再將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，TBST 漂洗3 次，孵育一抗 β?actin（1∶5 000）、Bcl?2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caspase?3（1∶2 000）于4 ℃搖床過夜，TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，孵育二抗羊抗兔 IgG（1∶20 000）于室溫?fù)u床1.5 h。ECL法顯影，收集圖像，Image J軟件進行分析，實驗獨立重復(fù)3次，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSA 最適作用時間和濃度 CCK8 結(jié)果顯示，以1 mmol/L的TSA作用HT?22細胞1 h時，細胞存活率在80%左右；作用4 h 時，細胞存活率在60%左右；作用8 h時，細胞存活率＜50%。以0.4 mmol/L的TSA 作用 HT?22 細胞作用時間≤14 h 時，細胞存活率≥80%；作用16 h 時，普通培養(yǎng)基中細胞存活率為81%，高糖培養(yǎng)基中細胞存活率為73%；作用20 h時，高糖和普通培養(yǎng)基中的細胞存活率都在70%左右；作用24 h時，細胞存活率均＜50%。后續(xù)實驗以0.4 mmol/L、20 h為TSA最適作用條件，見圖1。

Fig.1 The effects of different action time on HT?22 cell activity圖1 TSA不同作用時間對HT?22細胞活性的影響

2.2 TSA 對不同糖濃度下HDAC 及HAT 活性的影響 在普通培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中，TSA 組HDAC濃度較NC組均減少，HAT增加（P＜0.05）。同時，高糖作用后 NC 組和TSA 組的HDAC 和 HAT 增加（P＜0.05），見表1。

2.3 TSA 對不同糖濃度下HT?22 細胞凋亡率的影響 在普通培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中，TSA組均較NC組細胞凋亡率增加（P＜0.05），且高糖培養(yǎng)基比普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞凋亡率更高（P＜0.05），見圖2、表2。

Tab.1 The effects of TSA on HDAC and HAT activities of HT-22 cells under different concentrations of glucose表1 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞HDAC和HAT活性的影響 （n=5，）

Tab.1 The effects of TSA on HDAC and HAT activities of HT-22 cells under different concentrations of glucose表1 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞HDAC和HAT活性的影響 （n=5，）

＊P＜0.05

組別NC組TSA組t HDAC（pmol/L）普通培養(yǎng)基28.19±0.64 17.62±0.58 27.320＊高糖培養(yǎng)基61.17±1.67 53.27±1.06 8.912＊t 41.089＊65.936＊組別NC組TSA組t HAT（μg/L）普通培養(yǎng)基29.48±0.71 42.41±0.87 25.766＊高糖培養(yǎng)基33.94±1.09 45.32±0.66 19.940＊t 7.649＊5.960＊

2.4 TSA 對不同糖濃度下凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 Western blot 結(jié)果顯示，在普通培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中，NC 組與TSA 組Bax 表達均無顯著差異。TSA組均較NC組Bcl?2表達顯著下降，Caspase?3表達顯著增加（P＜0.05），見圖3、表3。

3 討論

DE是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，認(rèn)知功能障礙是其重要的臨床特征。糖尿病會增加阿爾茨海默病和血管性癡呆發(fā)生的風(fēng)險［10］。神經(jīng)元凋亡和海馬神經(jīng)受損是認(rèn)知/記憶功能障礙（包括阿爾茨海默?。┑闹饕蛩兀?1］。研究發(fā)現(xiàn)，大腦的肥大細胞作為腦損傷的“第一反應(yīng)者”在被激活后，會引起小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)元凋亡，進而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［12］。另外，表觀遺傳機制已被證明對于調(diào)節(jié)神經(jīng)元基因表達至關(guān)重要，從突觸可塑性到學(xué)習(xí)和記憶，其在許多神經(jīng)元功能中扮演著重要的角色，特別是組蛋白乙?；谶@些過程中起重要作用［13］。HATs 和HDACs參與認(rèn)知功能的調(diào)控，不同HAT或HDAC的突變或失調(diào)會導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)變性。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC2在賴氨酸乙?；c突觸可塑性偶聯(lián)中起核心作用，并在認(rèn)知障礙疾病中發(fā)揮重要作用［14］。同時，組蛋白乙酰化也影響神經(jīng)細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙酰化水平增加可通過減少大腦皮層細胞凋亡及促進神經(jīng)元再生保護新生大鼠大腦皮層損傷，其機制可能與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達增加相關(guān)［15］。本研究以小鼠海馬神經(jīng)元 HT?22 細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)在高糖作用后細胞凋亡增加，并且HAT及HDAC也顯著增加。

Fig.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT?22 cells under different concentrations of glucose圖2 TSA對不同糖濃度下HT?22細胞凋亡率的影響

Tab.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT-22 cells under different concentrations of glucose表2 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞凋亡率的影響（n=3，%，）

Tab.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT-22 cells under different concentrations of glucose表2 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞凋亡率的影響（n=3，%，）

＊P＜0.05

組別NC組TSA組t普通培養(yǎng)基6.00±0.20 27.43±0.55 63.357＊高糖培養(yǎng)基20.57±0.78 47.97±2.16 20.680＊t 31.456＊15.958＊

Fig.3 The effect of TSA on the expression of Bcl?2,Bax and Caspase?3 in HT?22 cells under different concentrations of glucose圖3 TSA對不同糖濃度下HT?22細胞Bcl?2、Bax和Caspase?3表達影響

Tab.3 Comparison of TSA on the expressions of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in HT-22 cells under different concentrations of glucose表3 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表達情況的比較 （n=3，）

Tab.3 Comparison of TSA on the expressions of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in HT-22 cells under different concentrations of glucose表3 TSA對不同糖濃度下HT-22細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表達情況的比較 （n=3，）

＊P＜0.05

組別NC組TSA組t普通培養(yǎng)基Bcl?2 1.16±0.06 0.46±0.02 19.729＊Bax 1.00±0.06 1.08±0.04 1.925 Caspase?3 0.84±0.06 1.07±0.06 4.903＊組別NC組TSA組t高糖培養(yǎng)基Bcl?2 0.78±0.02 0.45±0.01 27.494＊Bax 1.06±0.04 1.09±0.04 1.030 Caspase?3 0.99±0.05 1.29±0.03 8.395＊

TSA 是一種廣譜的 HDACi，屬于 HDACi 氧肟酸鹽類，可作用于Ⅰ、Ⅱ類HDAC。TSA 可通過上調(diào)Caspase?8、Caspase?3 和 BH3 相互作用域死亡激動劑（Bid）等細胞中的促凋亡蛋白，下調(diào)Bcl?X1、髓樣細胞白血病蛋白?1（Mcl?1）和X 連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）等促進凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，或通過線粒體介導(dǎo)的死亡途徑誘發(fā)細胞凋亡［16］。本實驗通過CCK8法檢測細胞活性，確定TSA 的最佳作用時間和濃度。TSA推薦的作用時間和濃度是12～18 h、0.4 mmol/L。但也有研究報道，通過CCK8 法確定TSA 處理肺腺癌A549細胞、肺鱗癌H520細胞的最適藥物濃度，即選取2.25～150 mmol/L間不同作用濃度，但是都是統(tǒng)一作用48 h，并沒有對時間進行確定［17］。筆者先以1 mmol/L 的TSA 作用細胞，發(fā)現(xiàn)對細胞活性的影響過大，不利于后續(xù)實驗；之后又用0.4 mmol/L分別作用各組細胞1、4、8、12、14、16、20、24 h，發(fā)現(xiàn)在20 h時抑制效果明顯，且不影響細胞的存活。因此，最終選擇0.4 mmol/L，20 h為最適作用條件。

Wei 等［18］發(fā)現(xiàn) HDAC5 及其細胞內(nèi)易位是調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡的多種途徑的關(guān)鍵效應(yīng)因子。HDAC5均勻地分布于皮層神經(jīng)元的細胞核和細胞質(zhì)中，當(dāng)N?甲基?D?天冬氨酸（NMDA）誘導(dǎo)的細胞發(fā)生凋亡時，核內(nèi)的HDAC5 被快速磷酸化并轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，皮層神經(jīng)元中核定位的HDAC5 的異位表達抑制了NMDA 誘導(dǎo)的細胞凋亡，在加入TSA 處理細胞后可抑制HDAC5對NMDA的作用，促進神經(jīng)元凋亡。本研究通過抑制HDAC，觀察組蛋白乙?；揎検欠裼绊懶∈蠛ｑR神經(jīng)細胞HT?22 的凋亡，并利用TSA作用于正常及高糖條件下培養(yǎng)的HT?22 細胞，觀察其對細胞凋亡是否有影響。

組蛋白乙?；腿ヒ阴；谏窠?jīng)元老化、萎縮和退行性疾病中起重要作用。Wang 等［19］發(fā)現(xiàn)TSA可能通過抑制多巴胺能神經(jīng)元的存活率和增加其對神經(jīng)毒素的易感性參與帕金森的發(fā)病過程。Salminen等［20］發(fā)現(xiàn)TSA能影響大鼠小腦顆粒神經(jīng)元和小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞的代謝，高水平的組蛋白乙?；烧T導(dǎo)神經(jīng)元應(yīng)激反應(yīng)和細胞凋亡發(fā)生。本研究中ELISA 結(jié)果顯示，TSA 作用后HDAC 活性降低，HAT活性增加；流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率顯著增加，且在高糖條件下，細胞凋亡更嚴(yán)重；在蛋白水平上，TSA 能顯著下調(diào) Bcl?2 的表達，上調(diào)Caspase?3 的表達。這些結(jié)果表明TSA 可能通過抑制HDAC 增加組蛋白乙?；?，誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)元HT?22細胞的凋亡。

綜上所述，TSA能誘導(dǎo)HT?22細胞的凋亡，并且在高糖條件下，TSA對HT?22細胞凋亡的影響更大。TSA可能通過增加組蛋白乙?；秸T導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡，從而參與DE認(rèn)知功能障礙的機制。