Survivin異常表達(dá)對前列腺癌轉(zhuǎn)移及TGF?β/Smad通路的調(diào)節(jié)作用

徐子寒，彭云，董世強(qiáng)，侯定坤，王海濤△

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性第2大常見惡性腫瘤，2018 年全球新確診PCa 患者127.6 萬例，死亡 35.9 萬例［1］。中國男性的 PCa 發(fā)病率也在快速上升［2］。大多數(shù)PCa 患者在確診時已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療手段局限于內(nèi)分泌治療和放療。凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）在調(diào)控細(xì)胞周期和腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用［3］。生存素（Survivin）是IAPs 家族中分子質(zhì)量最小的成員，在結(jié)直腸癌［4］、胰腺癌［5］、肝癌［6］等多種腫瘤組織中廣泛表達(dá)。早期研究發(fā)現(xiàn)Survivin 在PCa 中參與去勢抵抗［7?8］，抑制細(xì)胞凋亡［9?11］。目前已發(fā)現(xiàn)在卵巢癌［12］和腎癌［13］中，Survivin 通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)程來增加腫瘤的侵襲性。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）?β/Smad 作為參與腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程的經(jīng)典通路［14?15］，在乳腺癌［16］、肺癌［17］中發(fā)揮促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用。因此，筆者推測Survivin可通過調(diào)節(jié)TGF?β/Smad通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)PCa 的轉(zhuǎn)移。本文旨在闡明Survivin 在PCa 轉(zhuǎn)移中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 （1）組織標(biāo)本。選取2018年1月—2019年1月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和天津市泌尿外科研究所收集的15例良性前列腺增生（BPH）活檢標(biāo)本和60例PCa活檢標(biāo)本，60 例 PCa 中 Gleason 分級為 6、7、8、9+10 者各 15 例。（2）細(xì)胞及主要試劑。人前列腺增生上皮細(xì)胞株BPH 購自天津市泌尿外科研究所，人PCa 細(xì)胞株LNCaP、Du?145、PC?3 均購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。RMPI?1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司。青/鏈霉素（100×）、總蛋白提取試劑、PMSF 溶液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Western blot 相關(guān)試劑購自北京索萊寶生物技術(shù)公司。兔抗人TGF?β1、Smad2/3、磷酸化Smad2/3（pSmad2/3）、Smad4、GAPDH 一抗購自英國Abcam 公司。Survivin、上皮細(xì)胞鈣黏素（E?cadherin）、神經(jīng)鈣黏素（N?cadherin）、羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。HiFi?Script cDNA第一鏈合成試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）試劑盒購自美國羅氏生物科技公司。CCK?8 試劑盒購自 MCE 公司。Transwell 小室與基質(zhì)膠（Matrigel）購自美國 Corning 公司，SP?9001 免疫組化通用試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中Survivin 表達(dá) 登錄TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/），進(jìn)入Repository界面，選擇文檔類型為RNA?seq，選擇病例類型Prostate Gland，共有496 例PCa 數(shù)據(jù)。排除數(shù)據(jù)庫中腫瘤純度低于0.7 的標(biāo)本、福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）和重復(fù)標(biāo)本后，共收集PCa 標(biāo)本467 例，癌旁組織標(biāo)本52 例。利用R 程序（https://www.r?project.org/）對Survivin在PCa組織與癌旁組織、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同Gleason分級中的表達(dá)情況和預(yù)后進(jìn)行分析。

1.2.2 免疫組化染色 將石蠟包埋的組織標(biāo)本切片于65 ℃孵育2 h，二甲苯中脫蠟復(fù)水后枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2溶液孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。進(jìn)一步用Survivin 單克隆抗體（1∶2 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000 稀釋），室溫放置15 min，最后用蘇木素與二氨基聯(lián)苯胺作顯色劑進(jìn)行復(fù)染。由3 位病理科醫(yī)生獨(dú)立對BPH、PCa 標(biāo)本的免疫組化結(jié)果進(jìn)行評分。綜合組織染色強(qiáng)度和染色比例進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度評分：0分（無色，無表達(dá)）、1分（淺黃色，弱表達(dá)）、2分（深黃色，中度表達(dá)）、3分（棕褐色，高表達(dá)）。陽性腫瘤細(xì)胞百分率評分：1 分（0～25%）、2 分（26%～50%）、3 分（51%～75%）、4 分（76%～100%）。最后用染色強(qiáng)度積分與陽性細(xì)胞比例評分的乘積評價陽性程度，根據(jù)總得分將組織免疫組化評分，分為低表達(dá)（1～4分）和高表達(dá)（5～12分）。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 BPH 細(xì)胞與PCa 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI?1640 培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每1～2 d 更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至80%～90% 時用胰蛋白酶消化傳代。Survivin 過表達(dá)（NM_001168.3）、敲低慢病毒質(zhì)粒載體購自北京合生基因公司。取對數(shù)生長期的LNCaP 細(xì)胞和PC?3 細(xì)胞，以1×106個/孔接種于6 孔板中，待細(xì)胞密度為30%～50%時，LNCaP 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Survivin 過表達(dá)慢病毒（Survivin?OE）組和對照慢病毒（Vector）組 ；PC?3 細(xì) 胞 分 別 轉(zhuǎn) 染 Survivin 敲 低 慢 病 毒（Survivin?KD）組和對照慢病毒（NC）組。Survivin shRNA 序列 ：5'?CACCGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGACGAATCTTGA?CAGAAAGGAAAGCGC?3'。NC 序列：5'?CACCGGTTCTCC?GAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA?3'。

1.2.4 Western blot 檢測 TGF?β/Smad 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 用細(xì)胞總蛋白試劑提取4組細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度后取20 μg上樣，進(jìn)行12%SDS?PAGE電泳，分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉，洗膜，加入兔抗人一抗（1∶2 000 稀釋）及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000 稀釋），ECL 發(fā)光顯色，以GAPDH 蛋白作為內(nèi)參照，用Image J 軟件對 Survivin、TGF?β/Smad 信號通路相關(guān)蛋白TGF?β1、pSmad2/3、Smad2/3、Smad4 和 EMT 相關(guān)蛋白 E?cadherin、N?cadherin條帶的光密度（OD）值進(jìn)行分析，相對表達(dá)量=目標(biāo)灰度值/內(nèi)參灰度值。通過Western blot 檢測PCa細(xì)胞PC?3轉(zhuǎn)染Survivin敲低慢病毒與LNCaP轉(zhuǎn)染Survivin過表達(dá)慢病毒的效率。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK?8 法檢測細(xì)胞增殖能力。慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組同1.2.3，將細(xì)胞按照2 000個/孔接種至96孔板上，每組設(shè)3個復(fù)孔；于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h向每孔加入CCK?8 試劑各10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后在酶標(biāo)儀上檢測450 nm處的OD值，并繪制增殖曲線。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力。在小室中鋪基質(zhì)膠，用不含血清的RMPI?1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，按照PC?3 細(xì)胞2×104個/mL，LNCaP 細(xì)胞5×104個/mL 接種于上室中，下室中加入500 μL 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h 后取出。用4%多聚甲醛固定位于下室中的細(xì)胞，用蘇木素染色后在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量方差分析，兩個分類變量的關(guān)聯(lián)性用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中Survivin 表達(dá)與PCa 臨床特征及轉(zhuǎn)移的關(guān)系 TCGA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，PCa組織中Survivin 的mRNA 水平升高（t=8.840，P＜0.01）。在PCa 患者中，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Survivin 表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)者（t=4.725，P＜0.01）；且隨著 Gleason 分級 的 升高，Survivin 表達(dá)水平越高（F=4.780，P＜0.01）；Survivin高表達(dá)的PCa 患者的無進(jìn)展生存時間明顯短于Survivin 低表達(dá)的患者（Log?rankχ2=17.814，P＜0.01）。見圖1。

2.2 PCa 組織標(biāo)本中Survivin 蛋白表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系 免疫組化染色顯示，PCa 標(biāo)本中Survivin 蛋白高表達(dá)比例（60.0%，36/60）明顯高于BPH 組織（26.7%，4/15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.357，P＜0.05）。Survivin在BPH和PCa中的表達(dá)情況見圖2。不同臨床特征患者Survivin 表達(dá)水平比較發(fā)現(xiàn)，Survivin 高表達(dá)比例T3+T4 期患者高于T1+T2 期，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，見表1。

2.3 PCa 和BPH 細(xì)胞系中Survivin 蛋白表達(dá)水平比較 BPH 細(xì)胞中 Survivin 蛋白表達(dá)水平（0.323±0.053）低于 PCa 細(xì)胞系 LNCaP（0.445±0.053）、Du?145（0.568±0.045）和 PC?3（0.792±0.044），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=49.850，P＜0.01），見圖3。

2.4 敲低和過表達(dá)Survivin后PC?3和LNCaP細(xì)胞中Survivin 蛋白表達(dá)變化 在PC?3細(xì)胞中，Survivin 在Survivin?KD組（0.599±0.029）表達(dá)低于NC組（0.923±0.025），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，t=14.770，P＜0.01）；在 LNCaP 細(xì) 胞 中 ，Survivin?OE 組（0.989±0.015）Survivin 表達(dá)水平高于Vector 組（0.633±0.020），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，t=24.770，P＜0.01），見圖4。

Fig.1 Expression levels of Survivin mRNA in TCGA database of PCa patients圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中PCa患者Survivin mRNA表達(dá)水平

Fig.2 Expression levels of Survivin in BPH and PCa(Immunohistochemistry staining,×100)圖2 Survivin在BPH和PCa中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×100）

Fig.3 Expression levels of Survivin in human benign prostatic hyperplasia and prostate cancer cell lines圖3 人前列腺增生細(xì)胞系和PCa細(xì)胞系中Survivin蛋白表達(dá)水平

Fig.4 Changes in Survivin expression after knocking?down and overexpressing Survivin圖4 敲低和過表達(dá)Survivin后其蛋白表達(dá)變化

2.5 敲低和過表達(dá) Survivin 后 PC?3 和 LNCaP 細(xì)胞的增殖和侵襲能力變化 CCK?8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PC?3 細(xì)胞中，與 NC 組相比，Survivin?KD 組細(xì)胞增殖能力明 顯 下 降（n=3，F(xiàn)組間=2 033.000，F(xiàn)時間=577.900，F(xiàn)交互=125.700，P＜0.01）；在LNCaP 細(xì)胞中，Survivin?OE 組細(xì)胞增殖能力明顯高于Vector 組（n=3，F(xiàn)組間=1 794.000，F(xiàn)時間=396.500，F(xiàn)交互=82.130，P＜0.01），見圖5。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Survivin?KD組細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯少于 NC 組［（43.67±4.73）個/視 野vs.（101.67±7.64）個/視 野 ，t=11.190，P＜0.01］；而 Survivin?OE 組細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯多于Vector組［（63.67±5.03）個/視野vs.（33.33±3.51）個/視野，n=3，t=8.561，P＜0.01］，見圖6。

Fig.5 Thel proliferation curves of Survivin overexpression and knockdown in PCa cells圖5 敲低和過表達(dá)Survivin后PCa細(xì)胞增殖曲線

2.6 敲低和過表達(dá) Survivin 后 PC?3 和 LNCaP 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)變化 Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，在PC?3 細(xì)胞中，與 NC 組相比，Survivin?KD 組間質(zhì)標(biāo)志物N?cadherin 表達(dá)減少，上皮標(biāo)志物E?cadherin表達(dá)增加。在LNCaP 細(xì)胞中，與Vector 組相比，Survivin?OE 組 E?cadherin 表達(dá)減少，N?cadherin 表達(dá)增加，見圖7、表2。

Fig.6 Transwell results in PCa cells after knocking?down and overexpressing Survivin圖6 敲低和過表達(dá)Survivin后PCa細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Fig.7 Expression levels of EMT?associated proteins after knocking?down and overexpressing Survivin圖7 敲低和過表達(dá)Survivin后EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

2.7 敲低和過表達(dá) Survivin 后 PC?3 和 LNCaP 細(xì)胞TGF?β/Smad 通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化 進(jìn)一步探索Survivin調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，在PC?3 細(xì)胞中，與 NC 組相比，Survivin?KD 組 TGF?β1、pSmad2/3和Smad4表達(dá)減少（P＜0.01）；在LNCaP細(xì)胞中，與 Vector 組相比，Survivin?OE 組 TGF?β1、pSmad2/3、Smad4 均 表 達(dá) 增 加（P＜0.01），見 圖8、表3。

Tab.2 Comparison of the expression of EMT-associated proteins in PC-3 cells after knocking-down and overexpressing Survivin表2 敲低和過表達(dá)Survivin后EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 （）

Tab.2 Comparison of the expression of EMT-associated proteins in PC-3 cells after knocking-down and overexpressing Survivin表2 敲低和過表達(dá)Survivin后EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 （）

＊P＜0.01

組別NC組Survivin?KD組t Vector組Survivin?OE組t 3 3 3 3 1.009±0.025 0.724±0.034 11.780＊0.676±0.013 0.867±0.002 24.810＊0.242±0.006 0.995±0.029 44.530＊1.007±0.050 0.670±0.040 9.102＊n N?cadherin E?cadherin

Fig.8 Changes of TGF?β/Smad pathway?related proteins after knocking?down and overexpressing Survivin圖8 敲低和過表達(dá)Survivin后TGF?β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化

Tab.3 Comparison of TGF-β/Smad pathway-related protein levels in PC-3 cells after knocking-down and overexpressing Survivin表3 敲低和過表達(dá)Survivin后TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 （）

Tab.3 Comparison of TGF-β/Smad pathway-related protein levels in PC-3 cells after knocking-down and overexpressing Survivin表3 敲低和過表達(dá)Survivin后TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 （）

＊P＜0.01

組別NC組Survivin?KD組t Vector組Survivin?OE組t n3 3 3 3 TGF?β1 1.276±0.056 0.624±0.047 15.370＊0.719±0.006 1.033±0.002 79.110＊pSmad2/3 0.868±0.024 0.650±0.022 11.640＊0.854±0.030 1.174±0.032 12.590＊Smad4 0.813±0.040 0.582±0.063 5.353＊0.110±0.001 0.815±0.008 156.200＊

3 討論

雄激素剝奪是轉(zhuǎn)移性PCa（mPCa）的主要治療方案，但經(jīng)過18～24個月的中位緩解期后，大多經(jīng)過內(nèi)分泌治療的患者最終會發(fā)展為趨勢抵抗性PCa（CRPC），導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和疾病進(jìn)展［18］。CRPC 預(yù)后極差，中位生存期僅為1 年［19］。隨著世界范圍內(nèi)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，腫瘤基因靶向治療在臨床治療策略中的重要性日益增加。利用生物信息學(xué)技術(shù)對臨床獲取的PCa 組織進(jìn)行數(shù)據(jù)化分析，確定具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因，并通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證差異基因的促癌機(jī)制，最終可以找出精準(zhǔn)靶向癌基因的分子抑制劑，完成臨床轉(zhuǎn)化。

有研究發(fā)現(xiàn)Survivin 在多種腫瘤中表達(dá)明顯升高，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期［10］、抑制程序性凋亡［11］和促進(jìn)EMT［12?13］發(fā)揮促癌功能，但對于Survivin是否促進(jìn)PCa 轉(zhuǎn)移及EMT 具體機(jī)制的研究并未涉及。因此，本文將Survivin 確定為研究對象，探討其在PCa轉(zhuǎn)移中的作用。

在本研究中，首先利用生物信息學(xué)技術(shù)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫 PCa 標(biāo)本信息，發(fā)現(xiàn) Survivin 在人 PCa中的mRNA 水平顯著增加，其過表達(dá)水平與出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)?？紤]TCGA數(shù)據(jù)庫主要收錄歐美人群PCa標(biāo)本信息，因此筆者又收集了15例BPH標(biāo)本和60 例PCa 臨床標(biāo)本，利用免疫組化技術(shù)驗(yàn)證Survivin 在中國PCa 患者中的表達(dá)水平，結(jié)果表明Survivin的蛋白質(zhì)水平在PCa標(biāo)本中明顯過表達(dá)，其高表達(dá)水平提示PCa 出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、更差的臨床分期和不良預(yù)后。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Survivin在人PCa細(xì)胞系中過表達(dá)，尤其是PC?3細(xì)胞系。細(xì)胞侵襲和增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在前列腺細(xì)胞中Survivin過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲；反之，敲低Survivin 明顯抑制細(xì)胞的增殖與侵襲，進(jìn)一步證實(shí)了免疫組化結(jié)果。

TGF?β/Smad 通路通過磷酸化激活 Smad2 和Smad3 并與 Smad4 結(jié)合，三聚體磷酸化的 Smad 復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子共同介導(dǎo)EMT 靶基因的抑制或激活。同時，Smad復(fù)合物也可以在細(xì)胞核中誘導(dǎo)抑制上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白miRNA 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的 EMT 進(jìn)程［12，20］。在骨肉瘤［21］、結(jié)直腸癌［22］、非小細(xì)胞肺癌［23］中，Survivin 通過調(diào)節(jié)Smad2 磷酸化使腫瘤發(fā)生EMT。本研究發(fā)現(xiàn)，在PCa 細(xì)胞中敲低Survivin 可抑制TGF?β1、pSmad2/3、Smad4表達(dá)水平，抑制間質(zhì)標(biāo)志物N?cadherin 表達(dá)，促進(jìn)上皮標(biāo)志物E?cadherin表達(dá)；過表達(dá)Survivin可以促進(jìn)Smad2/3發(fā)生磷酸化，增加TGF?β1、Smad4和間質(zhì)標(biāo)志物N?cadherin 表達(dá)，抑制上皮標(biāo)志物E?cadherin 的表達(dá)，從而證實(shí)了Survivin 可以通過激活經(jīng)典TGF?β/Smad通路來促進(jìn)PCa細(xì)胞發(fā)生EMT。

綜上所述，Survivin 在前列腺腺癌中高表達(dá)，且與PCa的惡性程度及侵襲性有關(guān)，Survivin可以通過激活TGF?β/Smad 通路來促進(jìn)腫瘤發(fā)生EMT，進(jìn)而提高PCa 的轉(zhuǎn)移與侵襲能力。Survivin 是PCa 發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物，靶向Survivin/TGF?β/Smad通路可能為轉(zhuǎn)移性PCa 患者提供新的臨床治療策略。