甲醛滅活豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗抗原液的最佳條件研究

胡江鋒，張志剛，陳瑞，張小娟

（1.楊凌綠方生物工程有限公司，陜西 楊凌 712100；2.陜西省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；3.陜西諾威利華生物科技有限公司，陜西 楊凌 712100）

豬圓環(huán)病毒（PCV）病是由豬圓環(huán)病毒引起的豬的一種多系統(tǒng)功能障礙性疾?。?］?，F(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，即PCV1 和PCV2，PCV1 為非致病性病毒，PCV2為致病性病毒，能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）［2］。該病毒1974年由德國學(xué)者Tischer首先從傳代的PK-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，我國最早則由朗洪武等［3］于2001 年報(bào)道。接種疫苗是預(yù)防由PCV2感染引發(fā)相關(guān)疾病的首要手段。在國內(nèi)市場上，生產(chǎn)和銷售的豬圓環(huán)病毒2型疫苗類型主要有全病毒滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗［4］。在疫苗制備過程中，抗原滅活是最關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)之一，抗原滅活效果直接影響到產(chǎn)品的質(zhì)量，甚至波及人類生命安全。目前，甲醛是最傳統(tǒng)、應(yīng)用最廣泛的化學(xué)滅活劑［5］，但甲醛濃度不夠，滅活就不徹底，容易引起疫苗安全事故，造成病毒擴(kuò)散；甲醛濃度偏大，雖滅活徹底，但有甲醛殘留，游離的甲醛隨疫苗注入動物機(jī)體后會產(chǎn)生刺激性反應(yīng)，甚至人類食用了注射部位有甲醛殘留的畜產(chǎn)品，會有致癌風(fēng)險(xiǎn)［6］。本試驗(yàn)探究了不同終濃度的甲醛對豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液滅活的效果，為該苗商品化、規(guī)?；a(chǎn)時(shí)設(shè)置最佳滅活條件提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料 無菌豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗抗原液（蛋白濃度為660 μg/mL），由陜西諾威利華科技有限公司提供；96孔PK-15細(xì)胞單層培養(yǎng)板、FITC 標(biāo)記的羊抗豬二抗、MEM 維持液、D-氨基葡萄糖鹽酸MEM，由楊凌綠方生物工程有限公司提供；無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基、PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）、10%甲醛溶液，由楊凌綠方生物工程有限公司提供；丙酮（分析純），購自成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2018030601。

1.2 方法

1.2.1 取豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液，搖勻，均分為5 瓶，每瓶400 mL，分別加入10%甲醛溶液，邊加邊搖，使甲醛終濃度分別為0.05%、0.07%、0.10%、0.15%和0.20%，置4～8 ℃下滅活72 h，期間每2 h 搖瓶一次。分別在滅活24 h、48 h、60 h 和72 h 時(shí)無菌取樣，按無菌檢驗(yàn)法［7］和滅活檢驗(yàn)方法［8］進(jìn)行抗原液滅活效果的檢驗(yàn)。

1.2.2 抗原液量增至每瓶3 000 mL，按1.2.1 方法和要求進(jìn)行滅活、取樣和檢驗(yàn)。

1.2.3 抗原液量增至每瓶10 000 mL，按1.2.1 方法和要求進(jìn)行滅活、取樣和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小量（400 mL）抗原液的滅活效果 不論甲醛終濃度為多少，每個(gè)測定時(shí)間點(diǎn)的滅活液均無細(xì)菌污染。當(dāng)甲醛終濃度為0.05%時(shí)滅活24 h、48 h、60 h、72 h，甲醛終濃度為0.07%時(shí)滅活24 h、48 h、60 h，甲醛終濃度為0.10%時(shí)滅活24 h、48 h，甲醛終濃度為0.15%時(shí)滅活24 h，滅活檢驗(yàn)的細(xì)胞均產(chǎn)生了特異性病變（CPE），說明這些滅活條件不能徹底滅活豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液。當(dāng)甲醛終濃度為0.07%時(shí)滅活72 h，甲醛終濃度為0.10%時(shí)滅活60 h，甲醛終濃度為0.15%時(shí)滅活48 h，甲醛終濃度為0.20%時(shí)滅活24 h，滅活檢驗(yàn)的細(xì)胞均未產(chǎn)生CPE，說明這些滅活條件能徹底滅活豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液。結(jié)果詳見表1。

2.2 中等量（3 000 mL）抗原液的滅活效果 不論甲醛終濃度為多少，每個(gè)測定時(shí)間點(diǎn)的滅活液均無細(xì)菌污染。當(dāng)甲醛終濃度為0.05%時(shí)滅活24 h、48 h、60 h、72 h，甲醛終濃度為0.07%時(shí)滅活24 h、48 h、60 h，甲醛終濃度為0.10%、0.15%時(shí)滅活24 h、48 h，滅活檢驗(yàn)的細(xì)胞均產(chǎn)生了特異性病變（CPE），說明這些滅活條件不能徹底滅活豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗抗原液。當(dāng)甲醛終濃度為0.07%時(shí)滅活72 h，甲醛終濃度為0.10%、0.15%時(shí)滅活60 h，甲醛終濃度為0.20%時(shí)滅活24 h，滅活檢驗(yàn)的細(xì)胞均未產(chǎn)生CPE，說明這些滅活條件能徹底滅活豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗抗原液。結(jié)果詳見表2。

表1 不同濃度甲醛對400 mL抗原液的滅活效果

2.3 大量（10 000 mL）抗原液的滅活效果 不論甲醛終濃度為多少，每個(gè)測定時(shí)間點(diǎn)的滅活液均無細(xì)菌污染。當(dāng)甲醛終濃度為0.05%時(shí)滅活24 h、48 h、60 h、72 h，甲醛終濃度為0.07%時(shí)滅活24 h、48 h、60 h，甲醛終濃度為0.10%、0.15%時(shí)滅活24 h、48 h，甲醛終濃度為0.20%時(shí)滅活24 h，滅活檢驗(yàn)的細(xì)胞均產(chǎn)生了特異性病變（CPE），說明這些滅活條件不能徹底滅活豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液。當(dāng)甲醛終濃度為0.07%時(shí)滅活72 h，甲醛終濃度為0.10%、0.15%時(shí)滅活60 h，甲醛終濃度為0.20%時(shí)滅活48 h，滅活檢驗(yàn)的細(xì)胞均未產(chǎn)生CPE，說明這些滅活條件能徹底滅活豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液。結(jié)果詳見表3。

表2 不同濃度甲醛對3 000 mL抗原液的滅活效果

表3 不同濃度甲醛對10 000 mL抗原液的滅活效果

3 結(jié)論與分析

本試驗(yàn)在已設(shè)定滅活溫度條件下，采用不同終濃度的甲醛滅活劑多次滅活不同量的豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗抗原液，通過對抗原滅活液的無菌檢驗(yàn)及滅活檢驗(yàn)，確定了能徹底滅活豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液的時(shí)間。結(jié)果得出，在4～8 ℃下采用0.07%甲醛終濃度滅活72 h，或0.10%和0.15%甲醛終濃度滅活60 h，或0.20%甲醛終濃度滅活48 h，均可達(dá)到徹底滅活豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液的目的。由于甲醛具有毒副作用及致癌性，為盡量減少其使用量，因而筆者傾向于采用0.07%甲醛終濃度于4～8 ℃滅活72 h，作為豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液較理想的滅活條件。

為進(jìn)一步準(zhǔn)確分析、改善、調(diào)整、驗(yàn)證豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗抗原液的最佳滅活條件，本試驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間區(qū)段有待再度細(xì)分并進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)探究。