肝硬化患者血漿cfDNA中TERT熱點(diǎn)突變率研究

薛曉霞，何美琳，梁國威*

(1.北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)科,北京100049；2.航天中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科,北京100049)

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)啟動(dòng)子區(qū)-124bp C/T和-146bp C/T突變是多種自我更新率較低的組織來源的腫瘤突變驅(qū)動(dòng)基因[1-4]，其在肝細(xì)胞性肝癌(HCC)中的突變率在60%左右，而在肝硬化中突變率為6%-19%，是肝硬化向HCC轉(zhuǎn)化過程中的最早和唯一的癌變突變驅(qū)動(dòng)基因[5]。目前，該熱點(diǎn)突變已成為肝硬化患者早期癌變的研究靶點(diǎn)。

目前，肝硬化患者組織活檢依從性差，難以獲得滿意的組織標(biāo)本[6]。循環(huán)游離DNA(cfDNA)作為“液體活檢”標(biāo)本，在肝硬化患者中TERT熱點(diǎn)突變的檢出率為8.6%左右[7]，而在肝硬化患者隨訪、監(jiān)測TERT突變的研究中顯示，患者癌變前后TERT熱點(diǎn)突變也由陰性轉(zhuǎn)為陽性[8]，提示檢測cfDNA中TERT熱點(diǎn)突變對于監(jiān)測肝硬化患者是否早期發(fā)生癌變具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前，關(guān)于肝硬化患者cfDNA中測定TERT熱點(diǎn)突變的相關(guān)研究較少[5,7-8]，相關(guān)研究有待于進(jìn)一步完善。本研究在80例肝硬化患者cfDNA中檢測TERT基因-124bp C/T和-146bp C/T熱點(diǎn)突變，旨在進(jìn)一步明確肝硬化患者TERT熱點(diǎn)突變的發(fā)生率及其突變與肝硬化患者臨床基本資料的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集航天中心醫(yī)院2019年10月-2020年11月確診肝硬化患者80例，其中男性40例，女性40例，年齡范圍33-94歲，平均年齡66.4±16.1歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Child-Pugh肝功評分(A、B、C級)，結(jié)合患者出現(xiàn)腹水、肝性腦病及門脈高壓引起的食管、胃底靜脈明顯曲張或破裂出血，臨床明確診斷肝硬化患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除各種疑似或明確診斷原發(fā)性肝癌或肝轉(zhuǎn)移癌患者和除肝癌外疑似或明確診斷的各種腫瘤患者。納入研究者簽署知情同意書，本研究通過航天中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查(項(xiàng)目批號(hào)：20190830-YN-01)。

1.2 方法

收集研究對象的基礎(chǔ)資料，包括性別、年齡，有無腹水和臨床肝性腦病診斷。檢測肝功(TBiL、ALB、ALT和AST)、凝血指標(biāo)(PT、PTA、APTT)、腫瘤標(biāo)志物(AFP、CEA、CA199)、病毒性肝炎指標(biāo)(HBV兩對半、HCV抗體)。其中肝功指標(biāo)采用AU 2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(貝克曼庫爾特，美國)、凝血指標(biāo)采用top2全自動(dòng)凝血分析儀(貝克曼庫爾特，美國)，由公司提供配套試劑。腫瘤標(biāo)志物和病毒性肝炎指標(biāo)采用美國雅培公司 i2000 免疫分析儀進(jìn)行檢測，由雅培公司提供配套試劑。

1.3 外周血cfDNA提取

留取2 h內(nèi)EDTA抗凝外周全血3 mL，4℃、2 000×g離心10 min， 吸出的血漿層再次4℃、16 000×g 離心10 min后，留取500 μL血漿后，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血漿游離DNA提取試劑盒(目錄號(hào)：DP709)提取cfDNA，按試劑盒說明操作，洗脫體積35 μL，-80℃保存待測。

1.4 cfDNA中TERT熱點(diǎn)突變率檢測

采用2步PCR擴(kuò)增法檢測TERT熱點(diǎn)突變，首先，采用普通PCR富集cfDNA模板(引物及反應(yīng)條件見表1)，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后稀釋1000倍作為模板進(jìn)行突變率檢測；第二步采用擴(kuò)增阻滯原理結(jié)合熒光定量PCR(ARMS-qPCR)檢測突變率(引物及反應(yīng)條件見表1)，即采用ARMS-qPCR和內(nèi)參-qPCR分別同時(shí)檢測待測樣本，根據(jù)5套突變率標(biāo)準(zhǔn)品測得的循環(huán)閾值(Ct值)的平均值，以Lg突變率對應(yīng)ΔΔCt值，分別建立-124(C/T)和-146(C/T)的突變率標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，ΔΔCt值=ΔCt值待測標(biāo)本-ΔCt值100%M；ΔCt值待測標(biāo)本=待測標(biāo)本ARMS-qPCR的Ct值 - 待測標(biāo)本內(nèi)參-qPCR的Ct值，ΔCt值100%M=100%突變標(biāo)準(zhǔn)品ARMS-qPCR的Ct值-100%突變標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)參-qPCR的Ct值。突變率回歸曲線分別為：-124M%=10(1.979-0.272×ΔΔCt值)，-146M%=10(1.993-0.258×ΔΔCt值)。采用所建方法測定30例表觀健康人結(jié)果顯示，-124(C/T)和-146(C/T)突變率檢測下限皆為0.05%(方法學(xué)評價(jià)具體數(shù)據(jù)未列出)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本資料

80例肝硬化患者中， TBiL、DBiL、TP、AST、PT、PTA、APTT、AFP、CEA、CA199在男、女性之間無顯著性差異(P>0.05)，而年齡、ALT水平在男、女性之間有顯著性差異(P<0.05)，見表2。

表1 ARMS-qPCR方法測定TERT熱點(diǎn)突變的引物和探針序列

表2 80例肝硬化患者基本資料

2.2 80例肝硬化患者血漿cfDNA標(biāo)本TERT突變率檢測結(jié)果

采用所建方法對80例肝硬化患者cfDNA中TERT突變進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示TERT基因突變陽性有6(7.5%)例，其中-124bp位點(diǎn)突變4例(5%)，突變率分別為0.13%、0.27%、0.46%和0.52%；-146bp位點(diǎn)2例(2.5%)，突變率分別為1.92%和2.77%。

2.3 TERT陽性病例基礎(chǔ)資料比較

TERT突變與臨床基本資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與TERT未突變組比較，TERT突變(-124bp和-146bp，6例)陽性組患者的血清ALB水平顯著降低，CA199水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而與年齡、性別、有無HBV感染、HCV感染、肝功指標(biāo)(TBiL、TP、ALT和AST)、凝血常規(guī)指標(biāo)(PT、PTA、APTT)、腫瘤標(biāo)志物(AFP、CEA)和Child-Pugh分級均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

本研究采用ARMS-qPCR方法，在80例肝硬化患者cfDNA中檢測到-124位點(diǎn)突變4例(5%)，-146位點(diǎn)突變2例(2.5%)，總計(jì)突變率為6例(7.5%)。進(jìn)一步分析顯示TERT突變陽性組患者的血清ALB水平顯著低于非突變組，CA199水平顯著高于非突變組，而與其他臨床基礎(chǔ)資料和檢測指標(biāo)無顯著相關(guān)性。

TERT是肝硬化患者中發(fā)生HCC風(fēng)險(xiǎn)的癌前病變的新生生物標(biāo)志物。研究表明，在肝硬化向肝癌的惡性轉(zhuǎn)變過程中，TERT的突變發(fā)生率逐漸增加。在病理組織標(biāo)本的研究顯示，低級別分化不良性結(jié)節(jié)、高級別分化不良性結(jié)節(jié)和早期HCC中分別檢測到TERT突變率是6%、19%和61%[5]，而在cfDNA中檢測到TERT的突變率為8.6%左右[7]。本研究檢測肝硬化患者cfDNA中TERT基因突變率為7.50%，提示檢測肝硬化患者cfDNA中TERT熱點(diǎn)突變或可監(jiān)測肝硬化患者的早期癌變。

最新研究顯示，在對肝硬化患者進(jìn)行跟蹤隨訪時(shí)，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者在癌變后-124位點(diǎn)突變轉(zhuǎn)呈陽性[8]，說明TERT在肝硬化向HCC轉(zhuǎn)變的早期監(jiān)測中具有重要的臨床意義。流調(diào)資料顯示，肝硬化患者年癌變率2%-5%[9]，結(jié)合本研究和以往研究[7]在cfDNA中檢測到TERT突變率為7.5%和8.6%，兩者發(fā)生率基本一致，進(jìn)一步提示在肝硬化患者cfDNA中監(jiān)測TERT基因突變必要性和重要性。

本研究TERT突變陽性患者中，血清ALB水平顯著降低，CA199水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Child-Pugh評分、TBiL、DBiL、TP、ALT、AST、PT、PTA、APTT、AFP、CEA與TERT陰性患者之間雖存在差異，差異未見顯著相關(guān)性(P>0.05)，這可能是由于陽性樣本總體偏少所致，有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究在肝硬化患者cfDNA中檢測到TERT突變率發(fā)生率為7.5%，提示TERT可作為監(jiān)測肝硬化患者發(fā)生HCC的早期生物標(biāo)志物。由于肝硬化患者進(jìn)行組織活檢具有患者依從性差、有創(chuàng)性和組織異質(zhì)性的局限性，而cfDNA標(biāo)本易于反復(fù)取材更適用于臨床常規(guī)檢測，因此，在肝硬化患者cfDNA中檢測TERT位點(diǎn)突變，進(jìn)而監(jiān)測肝硬化早期癌變具有重要的臨床指導(dǎo)意義。