甲氨蝶呤血藥濃度和基因檢測(cè)在治療低危妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中的價(jià)值研究Δ

唐紅波，馮 欣，段 微，陰赪宏，康海利，張雪艷，韓朝宏，王鶴堯,，崔 剛，張相林

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院藥事部，北京 100026； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科腫瘤科，北京100026； 3.中日友好醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100029)

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(gestational trophoblastic neoplasia，GTN)是由妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞異常發(fā)育及增殖所致的與妊娠相關(guān)的腫瘤，分為低危妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(low-risk gestational trophoblastic neoplasia，LRGTN)和高危妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。LRGTN的一線治療藥物有甲氨蝶呤和放線菌素D[1]。甲氨蝶呤費(fèi)用相對(duì)低，單藥化療方案使用廣泛，但是不良反應(yīng)較常見(jiàn)，部分患者甚至出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)和耐藥[2]。已有的研究結(jié)果顯示，影響藥物代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和作用靶標(biāo)的基因的多態(tài)性不僅與甲氨蝶呤的療效相關(guān)，也與其不良反應(yīng)密切相關(guān)，但不同研究間結(jié)果的差異較大，目前還無(wú)法利用血藥濃度和基因多態(tài)性精準(zhǔn)指導(dǎo)甲氨蝶呤針對(duì)LRGTN的個(gè)體化治療[3]。為了進(jìn)一步提高LRGTN 治療的有效性、安全性和經(jīng)濟(jì)性，減少甲氨蝶呤引起的不良反應(yīng)和耐藥，避免延誤病情，本課題組在前期研究[4]基礎(chǔ)上，初步探討甲氨蝶蛉血藥濃度監(jiān)測(cè)及代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因多態(tài)性檢測(cè)作為L(zhǎng)RGTN個(gè)體化治療的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

選擇2017年4—7月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診的3例LRGTN患者。第1次化療前進(jìn)行國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(international federation of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO)預(yù)后評(píng)分。納入標(biāo)準(zhǔn)：血常規(guī)、肝腎功能均正常?；颊呔走x甲氨蝶呤化療方案，單次劑量為0.4 mg/(kg·d)，每日同一時(shí)間肌內(nèi)注射，連續(xù)給藥5 d為1個(gè)療程?；熎陂g監(jiān)測(cè)血常規(guī)、肝腎功能、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)水平和藥品不良反應(yīng)。不良反應(yīng)分級(jí)參照世界衛(wèi)生組織《抗癌藥物常見(jiàn)毒副反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》，分為輕度、中度和重度[5]。

1.2 甲氨蝶呤血藥濃度測(cè)定

應(yīng)用EDTA-抗凝管采集患者靜脈血2 ml，以3 000 r/min離心15 min后取血漿，應(yīng)用免疫熒光法測(cè)定甲氨蝶呤濃度。

1.3 染色體核型分析

應(yīng)用EDTA-抗凝管采集患者靜脈血2 ml，分離純化獲得白細(xì)胞混懸液。應(yīng)用多重?cái)?shù)字熒光分子雜交及雜交測(cè)序；當(dāng)寡核苷酸與染色體雜交時(shí)，其所攜帶的熒光基團(tuán)會(huì)對(duì)染色體進(jìn)行標(biāo)記；利用熒光檢測(cè)設(shè)備，即可直接檢測(cè)雜交染色的結(jié)果，從而完成目標(biāo)序列的檢測(cè)。應(yīng)用測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒，在熒光檢測(cè)儀上完成自動(dòng)化分析。檢測(cè)的基因包括：亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)C677T和A1298C以及編碼P糖蛋白的ATP結(jié)合盒B亞家族成員1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ATP binding cassette subfamily B member 1 transporter，ABCB1)/多藥耐藥基因1(multi-drug resistance 1，MDR1)T3435C。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況

3例患者均首先應(yīng)用甲氨蝶呤進(jìn)行化療，1例患者出現(xiàn)中度發(fā)熱和皮疹，1例患者出現(xiàn)發(fā)熱、Ⅲ度骨髓抑制(粒細(xì)胞群絕對(duì)值最低值為0.88)和耐藥(甲氨蝶呤化療2個(gè)療程后血HCG水平由49.2 IU/L升至93.5 IU/L)，1例患者出現(xiàn)發(fā)熱、Ⅱ度骨髓抑制(血紅蛋白為94 g/L，粒細(xì)胞群絕對(duì)值最低值為1.14)、肝功能指標(biāo)升高[丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)為43 IU/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)為74 IU/L)]和耐藥(甲氨蝶呤化療3個(gè)療程，血HCG水平降低不明顯)。上述3例患者均更換化療方案繼續(xù)治療，至血HCG水平降至正常，患者未出現(xiàn)復(fù)發(fā)和明顯的不良反應(yīng)?；颊吒黜?xiàng)指標(biāo)情況見(jiàn)表1。

2.2 甲氨蝶呤的血藥濃度

3例患者第1個(gè)療程末次給藥后24 h的甲氨蝶呤血藥濃度分別為0.012、0.021和0.012 μmol/L；第3例患者于第1

表1 患者各項(xiàng)指標(biāo)情況Tab 1 Various indicators of patients

次化療的1、3、5次給藥后2和24 h取血測(cè)甲氨蝶呤濃度，血藥濃度分別為0.953、0.016、1.132、0.012、0.934和0.012 μmol/L。

2.3 甲氨蝶呤相關(guān)基因多態(tài)性

本研究測(cè)定了甲氨蝶呤代謝相關(guān)的基因多態(tài)性MTHFR C677T、MTHFR A1298C以及與甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因ABCB1 T3435C，結(jié)果見(jiàn)表1。MTHFR C677T基因型方面，不良反應(yīng)較輕的1例患者為CC型；不良反應(yīng)嚴(yán)重的2例患者為CT型，其ABCB1 T3435C基因型也均為雜合突變型。3例患者的MTHFR A1298C基因型均為野生型。

3 討論

3.1 甲氨蝶呤治療LRGTN的作用機(jī)制

甲氨蝶呤是一種葉酸拮抗劑，可干擾滋養(yǎng)細(xì)胞分裂。除葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)R)外，該藥還主要通過(guò)還原型葉酸載體(reduced folate carrier，RFC)進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)結(jié)合(親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)原有的二氫葉酸)，阻斷二氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生理活性的四氫葉酸(四氫葉酸為體內(nèi)合成嘌呤核苷酸和嘧啶脫氧核苷酸的重要輔酶)，從而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸合成過(guò)程中一碳單位的轉(zhuǎn)移作用受阻，導(dǎo)致DNA的生物合成明顯受到抑制，其對(duì)胸腺核苷酸合成酶亦有抑制作用[6]。患有滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞處于增殖活躍狀態(tài)，甲氨蝶呤對(duì)其的抑制作用更敏感，因此，臨床常用低劑量[0.4 mg/(kg·d)]甲氨蝶呤治療，即可達(dá)到很好的治療效果。參與甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的主要包括FR和RFC，甲氨蝶呤在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的關(guān)鍵酶主要包括葉酰多聚谷氨酸合成酶(folyl polyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS)、γ-谷氨酸水解酶(γ-glutamyl hydrolase，GGH)、DHFR和MTHFR,將甲氨蝶呤排出細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)體包括溶質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體家族編碼的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1(organic anion transporting polypeptide B1，OATPB1)、多藥耐藥蛋白和乳腺癌耐藥蛋白等[7-8]。雖然上述酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因多態(tài)性、蛋白表達(dá)水平對(duì)甲氨蝶呤治療LRGTN時(shí)血藥濃度的影響研究可能因?yàn)楦鞣N因素而沒(méi)有統(tǒng)一確切的結(jié)論，但必須肯定的是，甲氨蝶呤藥物基因組學(xué)研究對(duì)于實(shí)施“個(gè)體化”給藥具有重大意義[7]。

甲氨蝶呤進(jìn)入細(xì)胞后在FPGS的催化下轉(zhuǎn)化為更具活性、能停留在細(xì)胞內(nèi)更長(zhǎng)時(shí)間且更具毒性的活性產(chǎn)物多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(methotrexate polyglutamate，MTXPG)；同時(shí)，GGH可作用于MTXPG，將其還原為甲氨蝶呤，維持MTXPG在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡，甲氨蝶呤再經(jīng)蛋白泵泵出細(xì)胞外。甲氨蝶呤及其活性代謝物MTXPG都可與DHFR相結(jié)合，也可作用于胸苷酸合成酶，抑制其作用，導(dǎo)致DNA合成受阻[9]。甲氨蝶呤導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞分化受阻的同時(shí)，正常細(xì)胞也受到損害而發(fā)生不良反應(yīng)。亞葉酸、左亞葉酸可以給正常細(xì)胞直接補(bǔ)充活性葉酸，部分緩解甲氨蝶呤的不良反應(yīng)，但是不會(huì)影響甲氨蝶呤對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的毒性。具體機(jī)制目前尚未研究清楚，可能是由于正常細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性葉酸的RFC-1正常，亞葉酸進(jìn)入細(xì)胞多，正常細(xì)胞內(nèi)FPGS活性低，GGH活性高，MTXPG蓄積少，亞葉酸與之結(jié)合解毒相對(duì)容易；而滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜RFC-1受損，亞葉酸進(jìn)入細(xì)胞少，細(xì)胞內(nèi)MTXPG蓄積多，亞葉酸解毒難度大。

3.2 基因多態(tài)性與甲氨蝶呤血藥濃度、不良反應(yīng)的相關(guān)性

本研究中，3例患者的甲氨蝶呤谷濃度均<0.1 μmol/L，肌內(nèi)注射后2 h的血藥濃度在0.934～1.132 μmol/L范圍內(nèi)，連續(xù)給藥5次后2 h的血藥濃度較第1次給藥后2 h的血藥濃度沒(méi)有明顯提高，反復(fù)給藥甲氨蝶呤在血液中未見(jiàn)明顯蓄積，檢測(cè)出的血藥濃度均低于中毒血藥濃度(5 μmol/L)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[10]。甲氨蝶呤血藥濃度雖然很低，但是不良反應(yīng)并不少見(jiàn)，有些甚至還比較嚴(yán)重，推測(cè)其原因可能與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體及代謝基因多態(tài)性有關(guān)[2，11]。這一相關(guān)性在甲氨蝶呤大劑量(400 mg/m2，1日1次，給藥1周)靜脈滴注治療侵蝕性葡萄胎的療效觀察中得到證實(shí)[12]。宋再偉等[5]系統(tǒng)評(píng)價(jià)了骨肉瘤患者M(jìn)THFR、RFC-1和MDR1基因多態(tài)性對(duì)大劑量甲氨蝶呤不良反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，MTHFR C677T突變可能導(dǎo)致大劑量甲氨蝶呤不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，MTHFR A1298C多態(tài)性與大劑量甲氨蝶呤不良反應(yīng)無(wú)顯著相關(guān)性，與本研究結(jié)果一致。而RFC1 G81A或MDR1 C3435T多態(tài)性與甲氨蝶呤不良反應(yīng)的相關(guān)性尚不明確。

目前沒(méi)有權(quán)威部門(mén)提供小劑量甲氨蝶呤血藥濃度的界定值。有研究建議，甲氨蝶呤濃度<0.05 μmol/L時(shí)可以不測(cè)定[10]。也有學(xué)者認(rèn)為，甲氨蝶呤不良反應(yīng)與其血藥濃度相關(guān)，需要監(jiān)測(cè)血藥濃度并用亞葉酸鈣解救，但是證據(jù)并不充足，尚需要更多的研究提供依據(jù)。相同劑量的甲氨蝶呤對(duì)不同類型腫瘤細(xì)胞的殺傷作用可能并非完全一致，小劑量甲氨蝶呤就可以殺死處于增殖活躍狀態(tài)的滋養(yǎng)細(xì)胞，可能與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞合體化導(dǎo)致其敏感性增加有關(guān)[13]；雖然劑量小，但是不良反應(yīng)仍較多，部分不良反應(yīng)還很嚴(yán)重，除了與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等基因突變有關(guān)外，是否還有其他機(jī)制，也尚待研究探討。

本研究中，不良反應(yīng)較輕患者的MTHFR C677T基因型為野生型，而不良反應(yīng)較重的2例患者的MTHFR C677T和ABCB1 T3435C基因型均為雜合突變型，MTHFR A1298C基因型為野生型。由此可見(jiàn)，MTHFR A1298C與甲氨蝶呤不良反應(yīng)不相關(guān)，而MTHFR C677T和ABCB1 T3435C雜合突變或者純合突變時(shí)，會(huì)發(fā)生骨髓抑制、肝功能指標(biāo)升高等嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

3.3 基因多態(tài)性與甲氨蝶呤耐藥的相關(guān)性

甲氨蝶呤耐藥仍是GTN治療的研究熱點(diǎn)問(wèn)題[1]。因此，有必要對(duì)GTN的耐藥和復(fù)發(fā)進(jìn)行討論和研究。我國(guó)2018年《妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病診斷與治療指南(第四版)》中明確提出了耐藥標(biāo)準(zhǔn)，即經(jīng)規(guī)范化療2～3個(gè)周期后，血HCG水平不降低(或降低幅度<50%)、病灶不縮小，或在治療過(guò)程中出現(xiàn)新的病灶、血HCG水平升高。約有25%的GTN患者在初始化療后發(fā)生耐藥，3%的患者會(huì)復(fù)發(fā)，上述患者需要進(jìn)一步的挽救化療或聯(lián)合治療，最后會(huì)有0.5%～5%的患者因?yàn)槎嘀啬退幎劳鯷14-15]。最大腫瘤病灶5 cm、轉(zhuǎn)移病灶5個(gè)、血清β-HCG水平>105IU/ L、FIGO/世界衛(wèi)生組織預(yù)后評(píng)分5～6分可能是化療耐藥的高危因素[16-18]。陳夢(mèng)捷等[14]對(duì)高預(yù)后評(píng)分的GTN患者化療效果及耐藥因素進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，年齡>40歲、終止妊娠與初次治療的間隔時(shí)間較長(zhǎng)是導(dǎo)致預(yù)后評(píng)分5～6分的LRGTN患者對(duì)聯(lián)合化療耐藥的高危因素。耐藥是一個(gè)多系統(tǒng)共同參與的復(fù)雜過(guò)程，涉及多基因和多條信號(hào)通路的改變。目前的研究方向主要包括細(xì)胞內(nèi)藥物的外排機(jī)制、細(xì)胞內(nèi)藥物重新分布改變、細(xì)胞凋亡抑制和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞自噬等[19]。甲氨蝶呤耐藥機(jī)制并未研究清楚，主要觀點(diǎn)包括：(1)RFC介導(dǎo)的甲氨蝶呤攝取障礙，而不是P糖蛋白介導(dǎo)的外排，因?yàn)镻糖蛋白優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)親水性有機(jī)化合物，而并非如甲氨蝶呤這種二價(jià)陰離子化合物；(2)ABCB1/MDR1基因多態(tài)性，包括C3435T、G2677T/A、C1236T、T266C、G571A、T1985G和G3751A等位點(diǎn)；(3)MDR編碼蛋白質(zhì)P糖蛋白表達(dá)和功能改變[20]。耐藥產(chǎn)生的根本原因在于滋養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)甲氨蝶呤長(zhǎng)期誘導(dǎo)后出現(xiàn)耐藥表型，導(dǎo)致影響甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的多個(gè)基因表達(dá)的改變，可溶性CD105(內(nèi)皮聯(lián)蛋白)也可通過(guò)調(diào)控骨形態(tài)蛋白9/Smads通路參與到絨毛膜癌耐藥過(guò)程[21-22]。本研究中，發(fā)生甲氨蝶呤耐藥的2例患者未顯示出明顯的上述臨床特征，未出現(xiàn)耐藥的患者的MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因型均為野生型，而出現(xiàn)耐藥的2例患者的MTHFR C677T和ABCB1 T3435C基因型均為雜合突變型，MTHFR A1298C基因型為野生型。本研究結(jié)果初步顯示，甲氨蝶呤治療LRGTN出現(xiàn)耐藥與MTHFR C677T和ABCB1 T3435C突變有關(guān)，其他機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，甲氨蝶呤不良反應(yīng)的嚴(yán)重程度、耐藥與MTHFR C677T和ABCB1 T3435C的基因型有關(guān)，與MTHFR A1298C的基因型無(wú)關(guān)；甲氨蝶呤血藥濃度與基因多態(tài)性之間未見(jiàn)明顯的相關(guān)性，甲氨蝶呤血藥濃度均處于低水平，患者血藥濃度之間沒(méi)有差異，不良反應(yīng)的嚴(yán)重程度、耐藥與血藥濃度未見(jiàn)相關(guān)性。但是，本研究只是基于3例患者甲氨蝶呤血藥濃度和基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行的初步探討，有待更多的研究進(jìn)一步驗(yàn)證?？傊醪窖芯拷Y(jié)果顯示，代謝酶MTHFR和轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCB1的基因突變會(huì)導(dǎo)致甲氨蝶呤嚴(yán)重不良反應(yīng)和耐藥的發(fā)生，在用藥前，建議檢測(cè)甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因分型，根據(jù)患者基因分型判斷是否可以首選甲氨蝶呤作為化療藥，制定個(gè)體化治療方案，以期提高療效、減少嚴(yán)重不良反應(yīng)和耐藥的發(fā)生，進(jìn)一步縮短治療時(shí)間和節(jié)約醫(yī)療成本。