水霉病對草魚血液生化指標(biāo)和肌肉泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的影響

許娜，劉馨璐，劉璐，湯蓉，李大鵬

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 長江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室， 湖北 武漢 430070)

養(yǎng)殖魚類在捕撈、運(yùn)輸或接觸不良環(huán)境脅迫時(shí)容易受到損傷，可能誘發(fā)豎鱗病、赤皮病及水霉病等疾病，嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。水霉病是一種常見真菌性疾病[1]。在魚類體表鱗片脫落等受傷情況下，病菌入侵傷口并向外生長，致使病變部位體表附著棉絮狀灰白色菌絲，導(dǎo)致組織發(fā)炎、壞死，并最終致其死亡[2]。

血液中的葡萄糖(GLU)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)以及乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等，作為常見的魚類血液生化指標(biāo)，其含量水平和酶活水平可以反映出機(jī)體物質(zhì)代謝和能量代謝的基本情況，機(jī)體發(fā)生的生理或病理變化也可通過血液生化指標(biāo)的變化反映出來[3-4]。目前魚類血液生化指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，但不少研究結(jié)果顯示魚類養(yǎng)殖環(huán)境、營養(yǎng)條件的改變以及感染疾病都會(huì)引起血液生化指標(biāo)發(fā)生顯著變化。高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)血清總蛋白(TP)和TG等含量顯著增加，以應(yīng)對擁擠脅迫時(shí)機(jī)體對能量的需求[5]。史氏鱘(Acipenserschrenckii)饑餓3 d 后血漿TG和CHO濃度顯著增高，提示在食物剝奪期間魚體脂質(zhì)代謝增強(qiáng)[6]。大西洋鮭(Salmosalar)感染冷水弧菌病的血清TP、白蛋白(ALB)、TG和CHO均顯著降低，而ALT活性顯著升高，表明肝細(xì)胞功能不全，阻礙物質(zhì)代謝[7]。大黃魚(Pseudosciaenacrocea)患哈維氏弧菌病后血清ALT和AST含量顯著增加，表明魚體在病原菌作用下肝臟組織受損，引起血清酶含量迅速上升[8]。因此，魚類血液生化指標(biāo)是魚類研究中評估其狀態(tài)的重要參考指標(biāo)。

生物和非生物條件的變化是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的應(yīng)激因素，會(huì)引起機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的動(dòng)態(tài)變化[9-10]。熱休克蛋白(HSP)又稱為應(yīng)激蛋白，通常被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的生物標(biāo)志物[11]。細(xì)胞應(yīng)激引起細(xì)胞蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊，若受損蛋白質(zhì)不及時(shí)降解，將積累形成對細(xì)胞有害的聚集體，干擾細(xì)胞正常功能[12]。HSPs可作為分子伴侶參與受損蛋白質(zhì)的修復(fù)，一旦無法修復(fù)，泛素連接酶(CHIP)將介導(dǎo)泛素化HSPs標(biāo)記的伴侶蛋白底物，激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)，誘導(dǎo)受損蛋白的降解，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝穩(wěn)態(tài)，保持細(xì)胞的完整性以發(fā)揮其正常功能[13-16]。UPS是真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解的主要承擔(dān)者，細(xì)胞內(nèi)衰老、損傷或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)都可通過此途徑被降解[17]。該系統(tǒng)由泛素(ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)及26S蛋白酶體等組成[18]。UPS降解蛋白質(zhì)一般是通過多個(gè)泛素分子在E1、E2和E3的作用下與目標(biāo)底物蛋白結(jié)合，形成一條多聚泛素鏈，進(jìn)而被26S蛋白酶體識別，降解為小肽或氨基酸[19]。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是中國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量排名第一的魚類，年產(chǎn)量超過550萬 t[20]。草魚對外界環(huán)境變化較為敏感，魚體受傷較易感染水霉病。本研究對比分析感染水霉病和健康草魚血液生化指標(biāo)和肌肉泛素-蛋白酶體系統(tǒng)活性，進(jìn)而探討水霉病對草魚生理機(jī)能和骨骼肌蛋白質(zhì)降解情況的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

試驗(yàn)草魚(93.55±2.99) g購自湖北省黃岡市團(tuán)風(fēng)縣百容良種場，養(yǎng)殖于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)基地。水溫為20～23 ℃，pH為(8.06±0.02)，溶解氧為(6.55±0.08) mg/L。養(yǎng)殖期間發(fā)現(xiàn)有的草魚體表附著灰白色絮狀物，用手術(shù)鑷取其置于培養(yǎng)皿中，70%乙醇處理后通過顯微鏡觀察，可見管狀菌絲，有分枝但無分隔，菌絲梢端膨大，釋放的動(dòng)孢子呈梨形，具兩條等長的前鞭毛，以此確定為水霉科，水霉屬(Saprolegnia)。隨機(jī)選取10尾感染水霉病的草魚(體表肉眼可見附著厚重水霉，處于患病后期)作為患病組，體重為(91.21±4.51) g，體長為(17.71±0.29) cm；另于無水霉感染養(yǎng)殖缸中挑選10尾體表鱗片完整，無損傷無出血的健康草魚作為對照組，體重為(95.89±4.04) g，體長為(18.22±0.24) cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

采用MS-222(間氨基苯甲酸乙酯，200 mg/L)進(jìn)行魚體麻醉，尾動(dòng)脈采血，室溫靜置分層后3 000 r/min離心30 min分離血清，-80 ℃保存用于血液生化指標(biāo)的測定。采集草魚背部白肌液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中用于基因和蛋白相對定量表達(dá)分析。

1.2.2 血液生化指標(biāo)測定

葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)在Selectra XL型全自動(dòng)生化分析儀(荷蘭威圖科學(xué)公司)上測定。試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司(批號依次分別為193681、180531、170631、182041、187881、181371、192711、190651和190681)。

1.2.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)水平檢測

使用總RNA提取試劑盒(武漢科爾普生物科技有限公司，批號130318)提取背部肌肉總RNA；使用Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR (gDNA digester plus) 試劑盒(YEASEN，批號H1816441)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；使用HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus) 試劑盒(YEASEN，批號H3901010)并在Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR Detection System (Applied Biosystems，USA)上進(jìn)行熒光定量反應(yīng)。引物序列(表1)及實(shí)驗(yàn)方法參考本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文章[21]。

1.2.4 泛素化蛋白含量的測定

使用Dot-blot方法測定草魚背部肌肉泛素化蛋白含量。肌肉總蛋白提取使用RIPA裂解緩沖液(廣州捷倍斯生物科技有限公司，批號1707GB010)，濃度由BCA蛋白試劑盒測定(廣州捷倍斯生物科技有限公司，批號1911BCA011)，通過Odyssey CLx (LI-COR, CLx-0813)顯影分析, 使用Image J讀取各斑點(diǎn)灰度值, 進(jìn)行相對定量分析[21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算，使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，使用Graphpad Prism.V 5.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 感染水霉病對草魚血液生化指標(biāo)的影響

患病組與對照組草魚的血液生化指標(biāo)測定結(jié)果見表2。與對照組相比，患病組草魚的血清CHO、ALB、TP和TG濃度分別下降了22.69%、28.17%、25.56%和17.89%(P<0.05)，GLU濃度有下降趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；疾〗M草魚血清AST和LDH活性分別是對照組的2.02和1.97倍(P<0.05)，但ALP和ALT活性在兩組間沒有顯著性差異。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

表2 患病組和對照組草魚的血液生化指標(biāo)Tab.2 Blood biochemical indices of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group

2.2 感染水霉病對草魚肌肉nrf2和hsp基因表達(dá)的影響

水霉病感染顯著上調(diào)草魚的nrf2和hsp基因表達(dá)。

患病組草魚肌肉nrf2 mRNA表達(dá)水平是對照組的6.56倍，hsp70 mRNA表達(dá)水平是對照組的6.21倍，hsp90 mRNA表達(dá)水平是對照組的2.61倍(P<0.01，圖1)。

圖1 患病組和對照組草魚nrf2、hsp70、hsp90的相對表達(dá)量“**”表示組間差異極顯著(P < 0.01)。下同。Fig.1 Relative expressions of nrf2, hsp70 and hsp90 of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group“**” indicate extremely significant differences among groups(P<0.01).The same below.

2.3 感染水霉病對草魚肌肉泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的影響

感染水霉病引起草魚肌肉UPS相關(guān)基因表達(dá)量和蛋白含量的改變。與對照組相比，患病組草魚肌肉中chip、ub、psma2、psmc1、murf1和mafbx的mRNA表達(dá)量皆顯著上調(diào)，分別是對照組的1.57、5.15、7.98、4.70、11.98和3.36倍(P<0.01，圖2)?；疾〗M草魚肌肉中泛素化蛋白含量較對照組也顯著性增加(P<0.05，圖3)。

圖2 患病組和對照組草魚肌肉UPS相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expressions of genes related to UPS of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group

圖3 患病組和對照組草魚肌肉泛素化蛋白的相對含量“*”表示組間差異顯著(P<0.05)。Fig.3 Relative content of ubiquitinated protein of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group“*” indicate significant differences among groups(P<0.05).

3 討論

CHO主要在肝臟中合成，是碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝的主要降解產(chǎn)物和指標(biāo)，肝臟也是合成TG和TP的主要器官，因此血清蛋白質(zhì)、膽固醇等物質(zhì)含量與肝臟功能密切相關(guān)，其在血清中的含量變化可表示肝功能的好壞[22]。研究顯示魚類感染疾病后期血清TP、CHO、TG和ALB等生化指標(biāo)呈下降趨勢。余銀春等[23]發(fā)現(xiàn)感染嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的烏鱧(Channaargus)血清TP、CHO濃度顯著下降，間接表明魚體的肝臟組織發(fā)生病變。類似的結(jié)果在張書環(huán)[24]和本研究中也被發(fā)現(xiàn)，說明感染疾病使魚類肝臟受損，合成能力下降，導(dǎo)致血清CHO、TP和TG等物質(zhì)含量減少。美洲紅點(diǎn)鮭(Salvelinusfontinalis)感染柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcloumnare)后血清TP和ALB濃度降低，可能是由于急性免疫過程中蛋白質(zhì)分解代謝增加或肝臟病變導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少所致[25]。本研究發(fā)現(xiàn)水霉菌感染也顯著降低草魚血清ALB和TP含量。機(jī)體在病原入侵后啟動(dòng)免疫防御機(jī)制，白蛋白可作為載體對病原進(jìn)行清除而被迅速消耗[26]。感染疾病后機(jī)體分解代謝的增加以及食物攝入的減少可能也是血清蛋白含量降低的原因[25]。

ALT和AST主要分布于肝、腎和肌肉等組織器官的細(xì)胞中，正常情況下在血清中保持低水平且相對穩(wěn)定的酶活，當(dāng)肝臟等組織受到損傷或脅迫時(shí)，血液中這兩種酶活將升高，因此二者是肝臟等組織器官受損的重要指示酶[22]。研究發(fā)現(xiàn)，水霉菌感染的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[27]和鯉(Cyprinuscarpio)[28]的肝臟、脾臟和腎臟3種組織均有不同程度的損傷，洋蔥霍爾德氏菌(Burkholcepacid)感染的加州鱸(Micropterussalmoides)[29]、柱狀黃桿菌感染的黃顙魚(Ruditapesphilippinarum)[30]以及水霉菌感染的草魚血清中AST活性皆顯著上升，說明感染疾病損傷機(jī)體肝腎等組織器官，細(xì)胞內(nèi)酶大量逸出，導(dǎo)致血清酶活性顯著增強(qiáng)。LDH在橫紋肌細(xì)胞內(nèi)含量最高，其在血清中的含量變化與魚體肌肉組織的健康狀況有關(guān)[31]。氣單胞菌(Aeromonas)感染或病毒性出血性敗血癥引起虹鱒皮膚發(fā)生病變或肌肉出現(xiàn)條紋狀或瘀點(diǎn)性出血，伴隨著血清LDH活性增長[32-33]。本試驗(yàn)中患病組草魚LDH活性顯著增強(qiáng)，表明其肌肉組織受損，阻礙肌肉代謝，這與草魚感染處體表的鱗片皮膚潰爛直見肌肉的現(xiàn)象相吻合。ALP是一種重要的代謝調(diào)控酶，在魚類非特異性免疫方面具有重要作用，有助于提高魚的抗病力[34]。研究未發(fā)現(xiàn)累枝蟲(Epistylisunioi)寄生的黃顙魚[35]和水霉菌感染的草魚血清ALP活性有顯著變化，說明患病魚非特異性免疫能力下降，抗病能力減弱。

黃建等[28]研究發(fā)現(xiàn)，感染水霉病的鯉組織細(xì)胞內(nèi)氧化水平-抗氧化水平失衡，魚體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞的正常生理功能，導(dǎo)致組織損傷。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)是機(jī)體對抗氧化應(yīng)激最重要的內(nèi)源性信號通路，Nrf2是機(jī)體在應(yīng)對氧化應(yīng)激時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞防御體系的關(guān)鍵調(diào)控因子[36]。研究表明，氧化應(yīng)激激活Nrf2，并啟動(dòng)下游蛋白酶體/分子伴侶類基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)以抵抗有害刺激[37]。黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)感染鯉春病毒血癥病毒(infection with spring viraemia of carp virus，SVCV)后上皮瘤細(xì)胞Nrf2的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量均顯著增加[38]，草魚在48 h的急性擁擠脅迫后肌肉nrf2和hsp70 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)[39]，細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)被誘導(dǎo)。而草魚在70 d的慢性擁擠脅迫后，肌肉的nrf2和hsp90 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生變化，說明魚體適應(yīng)了脅迫環(huán)境，應(yīng)激反應(yīng)不顯著[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染水霉病草魚的肌肉nrf2、hsp70和hsp90 mRNA水平均顯著高于對照組，說明細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)生了氧化應(yīng)激，Nrf2調(diào)控因子被激活以啟動(dòng)細(xì)胞防御體系，增強(qiáng)機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力，并上調(diào)分子伴侶HSP基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)以協(xié)調(diào)受損蛋白質(zhì)的降解。

目前普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激造成蛋白質(zhì)合成與降解失衡，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉萎縮[40]。在應(yīng)激條件下，細(xì)胞蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊，當(dāng)HSP作為分子伴侶重折疊不成功時(shí)，受損蛋白質(zhì)由泛素連接酶CHIP呈遞給UPS降解[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，比目魚(Pleuronectiformes)[41]和草魚[39]在擁擠脅迫后，骨骼肌中UPS相關(guān)基因的表達(dá)量和泛素化蛋白質(zhì)的含量皆顯著上調(diào)。在本研究中，感染水霉病也引起草魚肌肉ub等UPS相關(guān)基因表達(dá)量的顯著上升和泛素化蛋白質(zhì)的高表達(dá)，表明生理和病理應(yīng)激條件下都能激活UPS，造成泛素化蛋白質(zhì)的積累。UPS被激活以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和降解過程的動(dòng)態(tài)平衡，維持細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[17]，失衡則會(huì)造成機(jī)體損傷。泛素連接酶MAFbx和MuRF1的基因表達(dá)水平可以作為骨骼肌蛋白質(zhì)降解的分子標(biāo)記物，在肌肉相關(guān)疾病的診斷中起到輔助作用[42]。感染水霉病草魚的murf1和mafbxmRNA水平的高表達(dá)說明骨骼肌蛋白質(zhì)降解被增強(qiáng)，最終可能導(dǎo)致肌肉萎縮。

綜上所述，水霉菌感染造成草魚血清酶活性增強(qiáng)，白蛋白、總蛋白和膽固醇等物質(zhì)含量降低，引起機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，激活骨骼肌泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，提高了蛋白質(zhì)降解速率。本研究關(guān)于血液生化指標(biāo)和肌肉UPS活性變化的研究，將有助于更深入地了解水霉病對草魚生理狀態(tài)的影響，為水霉病的診斷和防治提供科學(xué)的參考依據(jù)。