HPLC指紋圖譜結合化學計量學比較同株不同生長年限亳白芍化學成分差異

徐 超，林 杰，金傳山, 2*，劉軍玲

HPLC指紋圖譜結合化學計量學比較同株不同生長年限亳白芍化學成分差異

徐 超1，林 杰1，金傳山1, 2*，劉軍玲3*

1. 安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012 2. 中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012 3. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051

對同株不同生長年限的白芍化學成分差異進行比較研究，為白芍藥材最佳采收和質(zhì)量控制提供實驗數(shù)據(jù)支持?；贖PLC方法建立的白芍指紋圖譜，應用于同株不同生長年限白芍，并對其相似性和差異性進行分析，在此基礎上對其中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、1,2,3,4,6--五沒食子酰葡萄糖、苯甲酰芍藥苷7種成分進行含量測定。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）計算相似度，運用主成分分析（PCA）和聚類分析對樣品進行模式識別研究。同株不同生長年限的白芍指紋圖譜相似性較高，特征峰差異性體現(xiàn)于有4個峰在低年限中存在，另有1個峰只在高年限中存在。有5個峰存在增加趨勢，15個峰存在降低趨勢。白芍生長過程中芍藥內(nèi)酯苷呈現(xiàn)降低趨勢，芍藥苷、1,2,3,4,6--五沒食子酰葡萄糖呈現(xiàn)增加趨勢。白芍隨著年限的增加，其最高年限的比值始終最大，且其干質(zhì)量比例增加。相似度結果顯示白芍不同年限間表現(xiàn)出較強的一致性，相鄰年限間相似性更大，聚類分析發(fā)現(xiàn)，白芍隨著生長年限增加，含量逐漸穩(wěn)定。另采用綜合質(zhì)量數(shù)對不同年限白芍進行評價，結果顯示白芍5年生采收最佳。同株不同生長年限白芍化學成分和主要成分含量上存在一定差異，建議在第5年采收。

白芍；指紋圖譜；化學計量學；生長年限；沒食子酸；氧化芍藥苷；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；苯甲酸；1,2,3,4,6--五沒食子酰葡萄糖；苯甲酰芍藥苷

白芍為毛茛科植物芍藥Pall.的干燥根[1]，主產(chǎn)于安徽亳州、浙江磐安、四川中江等地，習稱亳白芍、杭白芍、川白芍，其中安徽亳州的白芍產(chǎn)量最大[2]。亳白芍多為規(guī)范化栽培種植，于栽培后3～5年夏秋二季采挖，但受其環(huán)境和市場價格波動的影響，實際采挖期在2～5年不等。由于白芍為多年生宿根植物，其每株白芍在栽下后的每年都會發(fā)出新根，每株白芍中的不同根生長年限或不同，如5年生白芍存在5、4、3年生根等，而4年生白芍中有4、3年生根等，目前，對白芍生長年限的研究僅限于不同年份的差異，而同株不同生長年限白芍產(chǎn)量和質(zhì)量是否有區(qū)別至今未見報道。因此，本實驗采用HPLC方法對同株不同生長年限白芍的指紋圖譜研究及其中7種成分含量測定，并采用聚類分析和主成分分析等化學計量學方法分析（PCA）不同生長年限亳白芍在生長過程中化學組分種類和積累存在的差異，對亳白芍采收提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；島津ATY224-電子天平（日本Shimadzu），賽多利斯Sartorius百萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；津騰GM-0.5A隔膜真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）

1.2 材料

對照品沒食子酸（批號YAO505YA14，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、氧化芍藥苷（批號Y31D5J1，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號Z16M6B1，質(zhì)量分數(shù)≥91.4%）、芍藥苷（批號X27F8C30162，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、苯甲酸（批號TS0911CA14，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、1,2,3,4,6--五沒食子酰葡萄糖（批號P29F7F10218，質(zhì)量分數(shù)≥99%）、苯甲酰芍藥苷（批號P02D7F26004，質(zhì)量分數(shù)≥98%），以上對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。3、4、5年生亳白芍各10株，均于2017年12月采集自亳州市十八里鎮(zhèn)的安徽協(xié)和成飲片有限公司，將白芍根部取下，洗凈泥土，備用。經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學藥學院金傳山教授鑒定，30株亳白芍樣品均為毛茛科植物白芍Pall.的干燥根，符合《中國藥典》2015年版的要求。

2 方法

2.1 同株不同生長年限的白芍樣品收集

白芍中的纖維在酸性環(huán)境下，可被間苯三酚染為紫色?；诖嗽砜蓪Σ煌L年限白芍進行鑒別。截取所測白芍橫切面，滴入一滴濃鹽酸溶液，再滴加一滴間苯三酚溶液，靜置。通過鑒別斷面纖維束圈數(shù)多少（年輪），判別每根白芍的生長年限。通過染色法，實驗將3年生同株白芍分為3、2年生者，將4年生同株白芍分為4、3、2年生者，將5年生同株白芍分為5、4、3、2年生者。并分別將各年限白芍鮮藥加工為白芍藥材。

表1 不同生長年限白芍樣品信息

2.2 色譜條件

依據(jù)課題組前期研究實驗條件[3-4]，色譜柱為Waters Symmetry ShieldTM RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美國Waters公司）流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），二元梯度洗脫程序為：0～20 min，95%～80%B；20～30 min，80%～75%B；30～45 min，75%～70%B；45～55 min，70%～65% B。柱溫25 ℃，體積流量1.0 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長0～8 min，274 nm；8～14 min，214 nm；14～18 min，257 nm；18～20.5 min，232 nm；20.5～28 min，220 nm；28～34 min，228 nm；34～38 min，217 nm；38～55 min，229 nm，檢測時間為55 min。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取對照品沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、1,2,3,4,6--五沒食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷適量于25 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，得含沒食子酸65.12 μg/mL、氧化芍藥苷115.80 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷18.40 μg/mL、芍藥苷19.16 μg/mL、苯甲酸204.70 μg/mL、1,2,3,4,6--五沒食子酰葡萄糖35.28 μg/mL和苯甲酰芍藥苷25.04 μg/mL混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

白芍藥材，粉碎，過4號篩，取0.5 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入15 mL稀乙醇，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30 min，放冷，定容至刻度線，搖勻，以0.45 μm有機濾頭濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 A）進行分析，確定共有峰，生成對照圖譜并進行相似度計算。以相對共有峰峰面積為變量，將數(shù)據(jù)導入SPSS24.0軟件進行PCA分析，篩選導致樣品間差異的化學成分。

3 結果與分析

3.1 指紋圖譜的構建和色譜峰的分析

取9批白芍樣品，按“2.3”項下方法制備各供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣HPLC測定，記錄色譜圖，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 A）進行分析、比較，經(jīng)多點校正和自動匹配后，生成對照指紋圖譜、疊加圖及對照指紋圖譜見圖1、2。9批白芍樣品共得到21個共有峰，與對照品對比，指認出其中7個共有峰，分別為沒食子酸（峰5）、氧化芍藥苷（峰13）、芍藥內(nèi)酯苷（峰18）、芍藥苷（峰21）、苯甲酸（峰44）、1,2,3,4,6--五沒食子酰葡萄糖（峰46）、苯甲酰芍藥苷（峰55）。其中芍藥苷（峰21）峰面積寬，分離度高，峰形較好，設為參照峰（S）。

圖1 9批白芍樣品的指紋圖譜疊加圖

5-沒食子酸 13-氧化芍藥苷 18-芍藥內(nèi)酯苷 21-芍藥苷 44-苯甲酸 46-1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖 55-苯甲酰芍藥苷

3.2 特征峰差異性分析

上述9批樣品以色譜峰保留時間在±0.1 min 內(nèi)且DAD光譜吸收曲線圖一致的情況下視為同一化學組分，其中峰面積小于10的視為低響應噪音峰，通過安捷倫化學工作站自動積分得出9個樣品中共檢出的56個不同成分色譜峰，按保留時間順序依次編號為1～56，得出9×56的峰面積數(shù)據(jù)矩陣。通過對9×56峰面積數(shù)據(jù)矩陣進行統(tǒng)計分析得出，不同生長年限的亳白芍在化學組分上存有一定規(guī)律性差異。峰6、7、39、48僅存在于低年限白芍樣品。其中峰6、48存在于3年生白芍第2、3年、4年生白芍第2年，5年生白芍第2、3年樣品中，峰39存在3年生白芍第2、3年，4、5年生白芍第2年中。峰7則僅存在于3、4、5年生白芍第2年中。另外，3、4、5年生白芍第2年白芍皆沒有峰38。組分積累量差異體現(xiàn)于：峰13、16、18、19、20、22、24、37、38、43、50、51、52、53、55呈現(xiàn)降低趨勢、峰4、5、32、44、46則呈現(xiàn)增加趨勢。

3.3 相似度評價

將9批不同年限亳白芍樣品色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 A版）”軟件中，在保留時間窗口設定為0.1 min的中位數(shù)法下采用多點校正后進行自動匹配，軟件計算得出各樣品及與對照圖譜的相似度，結果見表2。由結果可知，以對照圖譜（R）為參照，除5年生第2年亳白芍相似度為0.952外其余均大于0.97，表現(xiàn)出較強的一致性；另一方面，以9批不同生長年限樣品間的相似度可知，3～5年亳白芍不同生長年限下，以最后一年為相似度為1.000，呈現(xiàn)增加趨勢。綜上所述可知，不同生長年限亳白芍之間組分呈現(xiàn)較強的一致性，且隨著生長年限增加相似性增加。

表2 不同生長年限白芍相似度結果

3.4 聚類分析

系統(tǒng)聚類法亦稱階梯或?qū)哟尉垲惙?，是聚類分析諸方法中最為常見的一種，其基本思想是將多個樣品各自作為一類，將相關系數(shù)距離最近的2類合并成一新類，得到的新類再和其他類進行相關系數(shù)的距離分析，直至所有的樣品合為一大類，形成聚類圖，最后根據(jù)聚類實際情況進行適當?shù)姆诸?。聚類分析結果見圖3。除5年生白芍第2年樣品距離較遠外，其他樣品距離皆近。其中5年生第4年、第5年聚為一類，4年生第3年、第4年聚為一類，且這2類后聚為一大類，說明白芍在生長過程中會趨于穩(wěn)定。

圖3 樣品聚類分析樹狀圖

3.5 PCA

PCA分析是通過對原始指標相互關系的研究，找出少數(shù)幾個既保留原始指標的主要信息且互不相關的綜合指標，用以概括原始指標信息的多元統(tǒng)計方法。將上述9批亳白芍樣品指紋圖譜色譜數(shù)據(jù)矩陣導入SPSS 24.0軟件。KMO統(tǒng)計量和Bartlett檢驗結果表明可以進行PCA，提取初始特征值大于1的主成分1個，解釋了總變異的99.150%，說明所提取的該主成分可以代表色譜峰面積的絕大多數(shù)信息，見表3。

表3 特征值和方差貢獻率

3.6 白芍不同年限干質(zhì)量、鮮質(zhì)量占比研究

將不同生長年限白芍樣品進行稱定質(zhì)量，并對其烘干后重新稱定質(zhì)量。結果見表4。白芍隨著年限的增長，其最高年限所占比例最大。且根據(jù)鮮、干質(zhì)量比可以看出，同株不同生長年限白芍中年限低的白芍比重會降低，而年限高的白芍比重會增加。

3.7 不同生長年限白芍7種成分含量測定

計算其中沒食子酸、苯甲酸、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、1,2,3,4,6-五沒食子酰芍藥苷7種成分含量，結果見表5。

3.8 最佳采收期確定

為了確定亳白芍不同年限最佳采收期，將干質(zhì)量代表白芍產(chǎn)量，7種主要化學成分比例總值代表白芍質(zhì)量，建立亳白芍綜合質(zhì)量數(shù)，該年限下綜合質(zhì)量數(shù)為該年限白芍中7種成分含量與該年限下干質(zhì)量乘積，該年份綜合質(zhì)量數(shù)為該年7種成分含量與該年限下干質(zhì)量乘積之和，結果見表6。實驗結果表明，10株3、4、5年生白芍中綜合質(zhì)量數(shù)含量最高的是5年生白芍，其產(chǎn)量最大，質(zhì)量較高，因此白芍最佳采收期為5年。

表4 不同生長年限白芍干、鮮質(zhì)量比例

表5 不同生長年限白芍7種成分含量測定

表6 不同生長年限亳白芍質(zhì)量綜合分析

4 討論

藥物采收的科學合理對保證中藥材質(zhì)量優(yōu)質(zhì)均一具有極其重要的作用，更是對中藥臨床使用的重要保障[5-6]。傳統(tǒng)上對中藥材的采收具有相應的規(guī)定，如根和根莖為植物的貯藏器官，在地上部分開始生長時，往往會消耗根中貯藏的養(yǎng)分，故宜在植物生長停止，花葉萎謝的休眠期，或春季發(fā)芽之前采收。葉類及全草類中藥應在植物生長最旺盛時，或在花蕾將開放時，或在花盛開而果實種子尚未成熟時采收，此時植物已經(jīng)完全長成，而且生命力最旺盛。樹皮類相對而言皮多在清明到夏至時間采集，此時植物體內(nèi)液汁較多、形成層細胞分裂迅速，樹皮易于剝離，同時有效成分含量高，如杜仲、厚樸。根皮在冬季采收，如牡丹皮、地骨皮等。中藥在治療疾病時發(fā)揮作用的并不是單一成分，而是大類成分的總體作用。在自然資源的藥材的生長過程中，物質(zhì)的新增或減少會造成藥效的差異。采收年限過早，藥物轉(zhuǎn)化不及，導致藥效達不到要求；而采收年限過遲，有效成分可能轉(zhuǎn)化，藥效亦達不到要求。

本實驗研究的白芍，來源于毛茛科植物芍藥的根，通常來說白芍栽種后3～5年均有采收，過早采收產(chǎn)量低，過遲采收則根心空，不僅產(chǎn)量低，品質(zhì)也會受到影響[7-8]。一般來說，根類植物多采收于秋冬季或初春時節(jié)，此時植株地上部分枯萎或僅發(fā)芽露苗，物質(zhì)營養(yǎng)多貯藏于地下部分，根的物質(zhì)含量及種類最多。白芍含有多個化學組分群，主要為單萜及其苷類化合物、三萜類化合物、黃酮類化合物、鞣質(zhì)類和多糖等[9]，白芍中含有的糖苷類成分如芍藥苷及含量較少的氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等對學習記憶能力有一定的改善作用[10]；其中的沒食子酸類成分如沒食子酸、1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖等具有抗氧化、抗炎作用[11]；而苯甲酸則被認為是對植物生長和人體吸收有害成分?！吨袊幍洹?015年版只規(guī)定了白芍采收時節(jié)為夏、秋兩季采收，并未對其年限進行規(guī)定。對于白芍不同采收年限間化學成分差異，已有部分報道。李同莉等[12]對不同年限不同部位的亳白芍進行高效液相色譜指紋圖譜研究，并對其中芍藥苷含量進行測定，結果表明隨著生長年限的增加，芍藥苷含量及指紋圖譜主成分含量均逐漸減少，因此采收亳白芍應以生長2～3年者為好，且應保留細根入藥。而禤雪梅[13]則采用高效液相色譜法（HPLC）測定不同生長年限白芍中沒食子酸和芍藥苷的含量，隨著生長年限的增加，白芍中沒食子酸含量逐漸降低，芍藥苷的含量逐漸增加。

本次實驗對同株不同生長年限下亳白芍進行了指紋圖譜的建立和分析，并對其中7種成分的含量進行測定。對同株不同生長年限白芍進行鮮干重的測量，結果顯示白芍隨著年限的增加，其最高年限的比值始終最大，且其干重比例增加。從7種化學成分含量差異來看，同株不同生長年限白芍在生長過程中芍藥內(nèi)酯苷呈現(xiàn)降低趨勢，芍藥苷、1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖呈現(xiàn)增加趨勢。因此，僅從單一成分含量評價中藥材質(zhì)量存在一定的局限性。不同生長年限白芍指紋圖譜相似度結果顯示白芍不同年限間表現(xiàn)出較強的一致性，相鄰年限間相似性更大，主成分分析和聚類分析結果也證明了這一點。對指紋圖譜56個色譜峰組分進行分析，結果顯示白芍有4個峰僅存在于低年限中，一個峰僅存在于高年限白芍中。此外，56個峰中，有5個峰呈現(xiàn)增加趨勢，有15個峰呈現(xiàn)降低趨勢。另外對實驗結果進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，白芍隨著生長年限增加，含量逐漸穩(wěn)定。由于白芍在5年產(chǎn)量大，成分含量相對穩(wěn)定，綜合質(zhì)量值大，因此建議采用第5年進行采收。本實驗通過多指標、多角度、多化學計量學方法對同株不同生長年限白芍進行整體分析，為確定白芍最佳采收時期提供了一定的科學依據(jù)和參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparison of chemical composition ofin Bozhou with HPLC fingerprint and chemometrics in different growth years of same plant

XU Chao1, LIN Jie1, JIN Chuan-shan1, 2, LIU Jun-ling3

1. Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 2. Anhui Key Laboratory of New Technology in the Manufacture of Chinese Herbal Medicine Tablets, Hefei 230012, China 3. Anhui Institute for Food and Drug Control,Hefei 230051, China

To compare and study the chemical composition differences ofwith different growth, in order to provide experimental data support for the best collection and quality control of.Based on HPLC method, the fingerprint ofwas applied to different growth years of the same plant, and its similarity and difference were analyzed. On this basis, the contents of seven components were determined. The similarity was calculated by the Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine (2012A version), and the pattern recognition of the samples was studied by principal component analysis (PCA) and cluster analysis.The fingerprint ofwith different growth years of the same plant was similar, and the difference of characteristic peaks was reflected in the existence of four peaks in the low years. One peak only existed in the high years. There was an increasing trend in five peaks and a decreasing trend in 15 peaks. During the growth ofin Bozhou, alibiflorin showed a decreasing trend, while paeoniflorin and 1,2,3,4,6-pentagalloyglucose showed an increasing trend during the growth of.With the increase of years, the ratio of the highest years ofwas always the largest, and the proportion of dry weight ofincreased. The similarity results showed that there was a strong consistency among different years of, and the similarity between adjacent years was greater. Cluster analysis showed that the content ofwas stable with the increase of growth years. In addition, the comprehensive mass number was used to evaluatein different years. The results showed that the best harvest time ofwas in the fifth year.The chemical components and main components ofwith different growth years were different. It is suggested thatshould be collected in the fifth year.

; fingerprint; chemometrics; growth years; gallic acid; oxidized paeoniflorin; paeoniflorin; paeoniflorin; benzoic acid; 1,2,3,4,6--pentagalloyl glucose; benzoylpaeoniflorin

R286.2

A

0253 - 2670(2021)08 - 2408 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.025

2020-11-03

國家重點研發(fā)計劃資助項目（2017YFC1701600）

徐 超（1996—），碩士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量標準規(guī)范化研究。Tel: 15056087839 E-mail: 2757924369@qq.com

金傳山（1963—），男，碩士，教授。Tel: 13355512699 E-mail: jcs4@sohu.com

劉軍玲（1973—），女，碩士，主管藥師。E-mail: liujun-ling1973@sina.com

[責任編輯 時圣明]