青蒿琥酯通過miR-21/PTEN通路對(duì)人大腸癌CCL229細(xì)胞惡性生物學(xué)行為抑制作用的研究

鞏會(huì)杰，唐建榮，姚蘭杰，馮鵬飛

青蒿琥酯通過miR-21/PTEN通路對(duì)人大腸癌CCL229細(xì)胞惡性生物學(xué)行為抑制作用的研究

鞏會(huì)杰，唐建榮，姚蘭杰，馮鵬飛

駐馬店市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 駐馬店 463000

探究青蒿琥酯對(duì)人大腸癌CCL229細(xì)胞惡性生物學(xué)行為抑制作用的機(jī)制。采用MTT法檢測青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞活力的影響；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞凋亡的影響；采用Transwell法檢測青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞侵襲能力的影響；采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞集落形成能力的影響；采用Western blotting法檢測青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞內(nèi)自噬特異性蛋白如自噬效應(yīng)蛋白（Beclin1）、輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ蛋白（light chain 3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ）、自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related protein 5，Atg5）、Atg5-Atg12復(fù)合物以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白如緊密連接蛋白（ZO-1）、上皮鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏蛋白（neuronal cadherin，N-cadherin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Slug）和第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）表達(dá)的影響；采用qRT-PCR法檢測青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)的影響；通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證與的靶向關(guān)系；考察過表達(dá)或抑制與對(duì)青蒿琥酯抑制CCL229細(xì)胞惡行生物學(xué)行為的影響。青蒿琥酯顯著降低CCL229細(xì)胞存活率（＜0.05、0.01、0.001），顯著促進(jìn)CCL229細(xì)胞凋亡（＜0.001），顯著抑制CCL229細(xì)胞侵襲和克隆形成能力（＜0.001），顯著上調(diào)CCL229細(xì)胞內(nèi)Atg5-Atg12復(fù)合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、ZO-1、E-cadherin表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著下調(diào)N-cadherin和Slug蛋白表達(dá)水平（＜0.05）。CCL229細(xì)胞內(nèi)mRNA高表達(dá)（＜0.01），青蒿琥酯顯著抑制CCL229細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平（＜0.05）。過表達(dá)顯著抑制青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞的促凋亡作用（＜0.001），顯著減弱青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞侵襲和克隆形成能力的抑制作用（＜0.01），顯著抑制青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞Atg5-Atg12復(fù)合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、ZO-1、E-cadherin表達(dá)水平的上調(diào)作用（＜0.05、0.01），顯著抑制青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞N-cadherin和Slug蛋白表達(dá)水平的下調(diào)作用（＜0.01）；抑制則作用相反。是的下游靶基因，過表達(dá)顯著抑制CCL229細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)水平（＜0.01），抑制顯著上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)水平（＜0.01），過表達(dá)顯著抑制野生型PTEN（）質(zhì)粒的熒光素酶活性（＜0.01）。過表達(dá)與抑制表達(dá)對(duì)CCL229細(xì)胞作用一致，同時(shí)過表達(dá)和不會(huì)影響青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用。青蒿琥酯能夠通過調(diào)控miR-21和PTEN表達(dá)誘導(dǎo)CCL229細(xì)胞凋亡和自噬，并抑制細(xì)胞增殖和侵襲。

大腸癌；青蒿琥酯；miRNA；增殖；侵襲；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；自噬；凋亡

大腸癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下[1]。目前手術(shù)、化療和放療是治療大腸癌的主要手段[2]。5-氟尿嘧啶是用于治療實(shí)體瘤的主要藥物，臨床廣泛應(yīng)用于大腸癌的治療，治療效果較好[3]，然而化療對(duì)患者帶來的不良反應(yīng)不容小覷，因此尋找有效且不良反應(yīng)較小的藥物對(duì)提升大腸癌患者的治療效果至關(guān)重要。

微小RNA（miRNA，miR）是一類在真核生物中起轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的非編碼小分子RNA，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)行為中起重要作用[4]。研究表明，miRNA在腫瘤中的異常表達(dá)可作為抑癌基因參與大腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)[5-6]。miR-21在大腸癌患者血清中異常高表達(dá)[7]，且參與大腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等過程[8]。青蒿琥酯是從傳統(tǒng)中藥青蒿中提取出的一種天然倍半萜烯，是治療瘧疾的安全藥物[9]。Efferth等[10]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤[11]、宮頸癌[12]、乳腺癌[13]、前列腺癌[14]等多種腫瘤具有抑制作用，但其抗腫瘤的作用機(jī)制尚不清楚。本研究探究青蒿琥酯抑制大腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人大腸癌CCL229細(xì)胞株和人正常腸上皮HIEC細(xì)胞株購自上?？道噬锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 藥品與試劑

青蒿琥酯（60 mg/支）購自桂林南藥股份有限公司；5-氟尿嘧啶（0.25 g/支）購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；胎牛血清（批號(hào)SA190501）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)C22400500BT）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)C11995500CP）、Trizol試劑（批號(hào)15596-026）、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)RR047A）、SYBR Green Real-Time PCR MasterMix試劑盒（批號(hào)RR420A）、Lipofectamine 2000試劑盒（批號(hào)11668-027）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RAPI蛋白裂解液（批號(hào)P0013）、BCA試劑盒（批號(hào)P0010S）購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒（批號(hào)GM01-500T）、Annexin V-FITC/PI試劑盒（批號(hào)40302ES20）購自上海翊圣生物科技有限公司；Dual-Luciferase Reporter Assay Kit試劑盒（批號(hào)ab228530）購自美國Promega公司；Transwell小室（批號(hào)353090）購自美國Corning公司；緊密連接蛋白（ZO-1）抗體（批號(hào)13663）、上皮鈣黏蛋白（epithelial cadheri，E-cadherin）抗體（批號(hào)3195）、神經(jīng)鈣黏蛋白（neuronal cadherin，N-cadherin）抗體（批號(hào)61572S）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Slug）抗體（批號(hào)9585）、第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）抗體（批號(hào)9188）、自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related protein 5，Atg5）抗體（批號(hào)9980）、Atg12抗體（批號(hào)4180）、自噬效應(yīng)蛋白（Beclin 1）抗體（批號(hào)3495）、輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ蛋白（light chain 3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ）兔抗人單克隆抗體（批號(hào)4599）購自美國CST公司；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）鼠抗人單克隆抗體（批號(hào)20536-1-AP）、HRP標(biāo)記的IgG抗體購自美國Protein Tech Group公司；引物由山東維真生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.3 儀器

超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備一廠）；恒溫培養(yǎng)箱（美國Forma Scientific公司）；低溫高速離心機(jī)（德國Heraeus公司）；倒置顯微鏡和光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀器（華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

CCL229細(xì)胞和HIEC細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞存活率的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的CCL229細(xì)胞，以2×104/孔接種于96孔板中，100 μL/孔，設(shè)置對(duì)照組、青蒿琥酯（5、10、20、40 μg/mL）組和5-氟尿嘧啶（40 μg/mL）組，待細(xì)胞貼壁后，各給藥組加入100 μL相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，37 ℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞凋亡的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的CCL229細(xì)胞，以1×105/mL接種于6孔板中，2 mL/孔，設(shè)置對(duì)照組、青蒿琥酯（20 μg/mL）組和5-氟尿嘧啶（40 μg/mL）組，待細(xì)胞貼壁后，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，1000×離心5 min后棄上清，PBS沖洗3次后重懸細(xì)胞，加入1 mL 70%預(yù)冷乙醇溶液固定細(xì)胞；加入PBS離心沉淀去除固定液，加入100 μL RNA消化酶（100 μg/mL），37 ℃水浴30 min，加入100 μL碘化丙啶（PI，50 μg/mL）染色液，4 ℃避光染色30 min后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.4 青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞侵襲能力的影響

將Matrigel和無血清RPMI 1640培養(yǎng)基按1∶1配制成細(xì)胞外基質(zhì)膠，Transwell小室中加入30 μL細(xì)胞外基質(zhì)膠。按“2.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，在Transwell小室的上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。擦除小室濾膜內(nèi)表面細(xì)胞，于4%多聚甲醛中固定，PBS沖洗3次后使用0.1%結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下對(duì)穿過膜的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.5 青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞克隆形成的影響

按“2.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色后對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞接種于6孔板，加入3 mL含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基，隔天更換培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后對(duì)各組集落數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.6 青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞自噬特異性蛋白及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

按“2.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，于室溫封閉1 h，分別加入Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、Atg5、Atg12、ZO-1、E-cadherin、N-cadherin、Slug、β-actin抗體（1∶2000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的IgG抗體（1∶10 000），于室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后使用ECL發(fā)光試劑盒顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.7 CCL229細(xì)胞和HIEC細(xì)胞中miR-21 mRNA表達(dá)

設(shè)置CCL229組、HIEC組和青蒿琥酯（20 μg/mL）組，HIEC組加入HIEC細(xì)胞，其余各組加入CCL299細(xì)胞，以1×105/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，青蒿琥酯組加入藥物，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAG- ACTGA-3’，下游引物5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.8 過表達(dá)或抑制miR-21對(duì)CCL229細(xì)胞miR-21 mRNA表達(dá)的影響

設(shè)置對(duì)照組、過表達(dá)陰性對(duì)照組（miR-NC mimics）、過表達(dá)組（miR mimics）、抑制陰性對(duì)照組（miR-NC inhibitor）、抑制組（miR inhibitor）。按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將、（）、、（）轉(zhuǎn)染至CCL229細(xì)胞內(nèi)，48 h后，按“2.7”項(xiàng)下方法檢測CCL229細(xì)胞中mRNA表達(dá)情況。序列：5’-UA- GCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’；序列：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。

2.9 過表達(dá)或抑制miR-21對(duì)青蒿琥酯促CCL229細(xì)胞凋亡的影響

設(shè)置對(duì)照組、過表達(dá)組（miR mimics）、抑制組（miR inhibitor）。按“2.8”項(xiàng)下方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，各組加入青蒿琥酯（20 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按“2.3”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.10 過表達(dá)或抑制miR-21對(duì)青蒿琥酯抑制CCL229細(xì)胞侵襲能力的影響

按“2.9”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞侵襲情況。

2.11 過表達(dá)或抑制miR-21對(duì)青蒿琥酯抑制CCL229細(xì)胞克隆形成的影響

按“2.9”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞克隆形成情況。

2.12 過表達(dá)或抑制miR-21對(duì)青蒿琥酯調(diào)控CCL229細(xì)胞自噬特異性蛋白及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

按“2.9”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測自噬特異性蛋白及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)情況。

2.13 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-21與PTEN靶向關(guān)系

將和的3’-UTR靶序列插入到螢火蟲熒光素酶基因下游。將miR-NCmimics、miR mimics載體與、載體分別共轉(zhuǎn)染到CCL229細(xì)胞內(nèi)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，棄上清，加入0.5 mL含10%胎牛血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書檢測熒光素酶，采用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲和海腎熒光值，并以海腎熒光值作為內(nèi)參。

2.14 過表達(dá)或抑制miR-21對(duì)CCL229細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響

設(shè)置對(duì)照組、過表達(dá)組（miR mimics）、抑制劑組（miR inhibitor）。按“2.8”項(xiàng)下方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)情況。

2.15 CCL229細(xì)胞和HIEC細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)

按“2.7”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)情況。

2.16 過表達(dá)或抑制PTEN對(duì)CCL229細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響

設(shè)置對(duì)照組、過表達(dá)陰性對(duì)照組（pc-NC）、過表達(dá)組（pc-PTEN）、抑制陰性對(duì)照組（si-NC）、抑制組（si-PTEN）和過表達(dá)聯(lián)合過表達(dá)組（pc-PTEN＋miR mimics），按“2.8”項(xiàng)下方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測CCL229細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)情況。序列為：5’-GACGGGAAGACAAGUUCAUTT-3’。

2.17 過表達(dá)或抑制PTEN對(duì)青蒿琥酯降低CCL229細(xì)胞存活率的影響

設(shè)置對(duì)照組、過表達(dá)組（pc-PTEN）、抑制組（si-PTEN）和過表達(dá)聯(lián)合過表達(dá)組（pc-PTEN＋miR mimics），按“2.8”項(xiàng)下方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，各組加入青蒿琥酯（20 μg/mL），培養(yǎng)24 h，按“2.2”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞存活率。

2.18 過表達(dá)或抑制PTEN對(duì)青蒿琥酯促CCL229細(xì)胞凋亡的影響

按“2.17”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.3”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.19 過表達(dá)或抑制PTEN對(duì)青蒿琥酯抑制CCL229細(xì)胞侵襲能力的影響

按“2.17”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.4”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞侵襲情況。

2.20 過表達(dá)或抑制PTEN對(duì)青蒿琥酯抑制CCL229細(xì)胞克隆形成的影響

按“2.17”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞克隆形成情況。

2.21 過表達(dá)或抑制PTEN對(duì)青蒿琥酯調(diào)控CCL229細(xì)胞自噬特異性蛋白及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

按“2.17”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測自噬特異性蛋白及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)情況。

2.22 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用GraphPad Prism 8.2繪制統(tǒng)計(jì)圖，兩組間比較采用檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞存活率、凋亡、侵襲及克隆形成的影響

如圖1所示，青蒿琥酯（5、10、20、40 μg/mL）作用24、48、72 h均可顯著抑制CCL229細(xì)胞存活率（＜0.05、0.01、0.001），呈劑量和時(shí)間相關(guān)性；與5-氟尿嘧啶組比較，青蒿琥酯（20 μg/mL）可顯著抑制CCL229細(xì)胞活力（＜0.05），因此選擇20 μg/mL青蒿琥酯進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

如圖2-A所示，與對(duì)照組比較，青蒿琥酯組細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.001），優(yōu)于5-氟尿嘧啶。如圖2-B所示，與對(duì)照組比較，青蒿琥酯組細(xì)胞侵襲能力顯著降低（＜0.001），優(yōu)于5-氟尿嘧啶；如圖2-C所示，與對(duì)照組比較，青蒿琥酯組細(xì)胞克隆形成能力顯著降低（＜0.001），優(yōu)于5-氟尿嘧啶。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與5-氟尿嘧啶組比較：#P＜0.05

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與青蒿琥酯組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

如圖3所示，與對(duì)照組比較，青蒿琥酯組CCL229細(xì)胞內(nèi)自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復(fù)合物、Atg5、Beclin1和LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），EMT相關(guān)蛋白ZO-1、E-cadherin表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），N-cadherin和Slug蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。

3.2 miR-21在CCL229細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及作用

如圖4-A所示，與CCL229細(xì)胞比較，HIEC細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），青蒿琥酯組CCL229細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。如圖4-B所示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體或抑制載體至CCL229細(xì)胞內(nèi)，CCL229細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平顯著升高或降低（＜0.01、0.001）。

如圖5-A所示，過表達(dá)顯著抑制青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞的促凋亡作用（＜0.001），抑制顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞的促凋亡作用（＜0.01）。如圖5-B所示，過表達(dá)顯著減弱青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞侵襲能力的抑制作用（＜0.01），抑制顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞侵襲能力的抑制作用（＜0.05）。如圖5-C所示，過表達(dá)顯著減弱青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用（＜0.01），抑制顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用（＜0.05）。

如圖6所示，過表達(dá)顯著抑制青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復(fù)合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ以及EMT相關(guān)蛋白ZO-1、E-cadherin表達(dá)水平的上調(diào)作用（＜0.05、0.01），顯著抑制青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞N-cadherin和Slug蛋白表達(dá)水平的下調(diào)作用（＜0.01）；抑制顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復(fù)合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ以及EMT相關(guān)蛋白ZO-1、E-cadherin表達(dá)水平的上調(diào)作用（＜0.05、0.01），顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞N-cadherin和Slug蛋白表達(dá)水平的下調(diào)作用（＜0.01）。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與青蒿琥酯組比較：#P＜0.05

與CCL229細(xì)胞比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與HIEC細(xì)胞比較：#P＜0.05；與對(duì)照組比較：@@P＜0.01 @@@P＜0.001

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.3 PTEN為miR-21的下游靶基因

生物信息學(xué)網(wǎng)站（ENCORI）預(yù)測結(jié)果如圖7-A所示，與mRNA 3’-UTR端存在部分靶向結(jié)合序列。如圖7-B所示，過表達(dá)顯著抑制CCL229細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)水平（＜0.01），抑制表達(dá)顯著上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)水平（＜0.01）。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果如圖7-C所示，過表達(dá)顯著抑制野生型PTEN（）質(zhì)粒的熒光素酶活性（＜0.01），但對(duì)突變型PTEN（）質(zhì)粒的熒光素酶活性無顯著影響。

3.4 青蒿琥酯通過miR-21/PTEN抑制CCL229惡性生物學(xué)行為

如圖8-A所示，與CCL229細(xì)胞比較，HIEC細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），青蒿琥酯組CCL229細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。如圖8-B所示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體或抑制載體至CCL229細(xì)胞內(nèi)，CCL229細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高或降低（＜0.01）。

A-miR-21與PTEN mRNA靶向結(jié)合位點(diǎn) B-過表達(dá)或抑制miR-21對(duì)CCL229細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)的影響 C-過表達(dá)miR-21對(duì)CCL229細(xì)胞熒光素酶活性的影響；與對(duì)照組比較：##P＜0.01

與CCL229細(xì)胞比較：**P＜0.01；與HIEC細(xì)胞比較：#P＜0.05；與對(duì)照組比較：@@P＜0.01

如圖9所示，過表達(dá)顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞存活率的抑制作用（＜0.05），抑制顯著減弱青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞存活率的抑制作用（＜0.01）。

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

如圖10-A所示，過表達(dá)顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞的促凋亡作用（＜0.05），抑制顯著減弱青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞的促凋亡作用（＜0.001）。如圖10-B所示，過表達(dá)顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞侵襲能力的抑制作用（＜0.05），抑制顯著減弱青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞侵襲能力的抑制作用（＜0.01）。如圖10-C所示，過表達(dá)顯著減弱青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用（＜0.05），抑制顯著減弱青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用（＜0.05）。

如圖11所示，過表達(dá)顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復(fù)合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ以及EMT相關(guān)蛋白ZO-1、E-cadherin表達(dá)水平的上調(diào)作用（＜0.05、0.01），顯著增強(qiáng)青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞N-cadherin和Slug蛋白表達(dá)水平的下調(diào)作用（＜0.01）；抑制顯著抑制青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復(fù)合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ以及EMT相關(guān)蛋白ZO-1、E-cadherin表達(dá)水平的上調(diào)作用（＜0.05、0.01），顯著抑制青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞N-cadherin和Slug蛋白表達(dá)水平的下調(diào)作用（＜0.01）。

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

此外，同時(shí)過表達(dá)和對(duì)青蒿琥酯抑制CCL229細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為無顯著影響。

4 討論

青蒿素及其衍生物如蒿甲醚、青蒿琥酯、雙氫青蒿素等具有抗瘧疾、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[15-17]。Efferth等[10]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對(duì)白血病細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞株表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對(duì)黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤也有一定程度的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯可抑制CCL229細(xì)胞存活率，且呈劑量和時(shí)間相關(guān)性；青蒿琥酯可促進(jìn)CCL229細(xì)胞凋亡，抑制CCL229細(xì)胞侵襲和克隆形成能力。大腸癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響患者術(shù)后生存率的主要因素[18]。大腸癌的轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素共同導(dǎo)致的結(jié)果，其中EMT發(fā)揮重要的作用[19]。EMT的發(fā)生涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，包括細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)、上皮標(biāo)志物下調(diào)、間質(zhì)標(biāo)志物上調(diào)等[20]。EMT是多種癌癥侵襲和早期轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要過程[21]，本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯顯著上調(diào)CCL229細(xì)胞內(nèi)ZO-1和E-cadherin蛋白表達(dá)水平，顯著下調(diào)N-cadherin和Slug蛋白表達(dá)水平，表明青蒿琥酯能抑制CCL229細(xì)胞侵襲，與Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。自噬過程是一種細(xì)胞內(nèi)的降解系統(tǒng)，可將細(xì)胞質(zhì)成分遞送至溶酶體并參與自噬體的形成，在細(xì)胞的發(fā)育及對(duì)外界刺激的響應(yīng)中極為重要[22]。自噬過程在乳腺癌[23]、口腔癌[24]、大腸癌[25]等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯顯著上調(diào)CCL229細(xì)胞內(nèi)Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、Atg5和Atg5-Atg12復(fù)合物蛋白表達(dá)水平，表明青蒿琥酯能夠誘導(dǎo)CCL229細(xì)胞發(fā)生自噬。此外，本研究發(fā)現(xiàn)20 μg/mL青蒿琥酯對(duì)CCL229細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用優(yōu)于40 μg/mL 5-氟尿嘧啶。與化療藥物5-氟尿嘧啶相比，青蒿琥酯不會(huì)直接殺傷癌細(xì)胞，主要通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡從而抑制癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

研究發(fā)現(xiàn)，多種在大腸癌細(xì)胞株和組織中異常表達(dá)，如、、、等在大腸癌組織中呈高表達(dá)水平，、、等在大腸癌組織中呈低表達(dá)水平[26]。本研究結(jié)果顯示，相較于HIEC細(xì)胞，mRNA在CCL229細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，過表達(dá)后CCL229細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯的敏感性顯著降低，抑制后CCL229細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯的敏感性顯著增加，表明參與了CCL229細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及EMT等過程，青蒿琥酯可能通過下調(diào)表達(dá)，從而抑制CCL229細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

PTEN是重要的腫瘤抑制基因，PTEN的缺失可能會(huì)導(dǎo)致癌癥干細(xì)胞的惡性增殖或正常干細(xì)胞分化能力的丟失[27]，本研究發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白在CCL229細(xì)胞中異常下調(diào)，過表達(dá)可顯著增強(qiáng)CCL229細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯的敏感性，抑制可顯著抑制CCL229細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯的敏感性，表明大腸癌的發(fā)生可能與PTEN表達(dá)的缺失具有一定的相關(guān)性。Jiang等[28]發(fā)現(xiàn)可通過影響表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲；Lin等[29]發(fā)現(xiàn)lncRNA DUXAP8通過負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖。本研究通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測的下游靶基因，結(jié)果顯示，是的下游靶基因，且過表達(dá)會(huì)顯著抑制PTEN蛋白在CCL229細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。此外，將過表達(dá)載體與過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至CCL229細(xì)胞內(nèi)，并不會(huì)對(duì)青蒿琥酯的敏感性產(chǎn)生顯著影響，表明青蒿琥酯可能通過作用于miR-21/PTEN，從而抑制CCL229細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上，青蒿琥酯通過調(diào)控miR-21和PTEN的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，并抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Greathouse K L, White J R, Padgett R N,. Gut microbiome meta-analysis reveals dysbiosis is independent of body mass index in predicting risk of obesity-associated CRC [J]., 2019, 6(1): e000247.

[2] Marks K M, West N P, Morris E,. Clinicopathological, genomic and immunological factors in colorectal cancer prognosis [J]., 2018, 105(2): 99-109.

[3] Fang L, Jiang Y, Yang Y X,. Determining the optimal 5-FU therapeutic dosage in the treatment of colorectal cancer patients [J]., 2016, 7(49): 81880- 81887.

[4] Correia de Sousa M, Gjorgjieva M, Dolicka D,. Deciphering miRNAs’ action through miRNA editing [J]., 2019, 20(24): 6249.

[5] Zhou X, Lu Z P, Wang T S,. Plasma miRNAs in diagnosis and prognosis of pancreatic cancer: A miRNA expression analysis [J]., 2018, 673: 181-193.

[6] Wasik M A. Distinct miRNA profile in prognosis of early CTCL [J]., 2018, 131(7): 711.

[7] Hao J P, Ma A. The ratio of miR-21/miR-24 as a promising diagnostic and poor prognosis biomarker in colorectal cancer [J]., 2018, 22(24): 8649-8656.

[8] Ding T, Cui P P, Zhou Y,. Antisense oligonucleotides against miR-21 inhibit the growth and metastasis of colorectal carcinoma via the DUSP8pathway [J]., 2018, 13: 244-255.

[9] Adebayo J O, Tijjani H, Adegunloye A P,. Enhancing the antimalarial activity of artesunate [J]., 2020, 119(9): 2749-2764.

[10] Efferth T, Rücker G, Falkenberg M,. Detection of apoptosis in KG-1a leukemic cells treated with investigational drugs [J]., 1996, 46(2): 196-200.

[11] Papanikolaou X, Johnson S, Garg T,. Artesunate overcomes drug resistance in multiple myeloma by inducing mitochondrial stress and non-caspase apoptosis [J]., 2014, 5(12): 4118-4128.

[12] Trimble C L, Levinson K, Maldonado L,. A first-in-human proof-of-concept trial of intravaginal artesunate to treat cervical intraepithelial neoplasia 2/3 (CIN2/3) [J]., 2020, 157(1): 188-194.

[13] Pirali M, Taheri M, Zarei S,. Artesunate, as a HSP70 ATPase activity inhibitor, induces apoptosis in breast cancer cells [J]., 2020, 164: 3369-3375.

[14] Wang Z Z, Wang C, Wu Z Y,. Artesunate suppresses the growth of prostatic cancer cells through inhibiting androgen receptor [J]., 2017, 40(4): 479-485.

[15] Ji P, Wang L, Wang S Q,. Hyaluronic acid-coated metal-organic frameworks benefit the ROS-mediated apoptosis and amplified anticancer activity of artesunate [J]., 2020, 28(10): 1096-1109.

[16] Hamoya T, Fujii G, Iizumi Y,. Artesunate inhibits intestinal tumorigenesis through inhibiting wnt signaling [J]., 2021, 42(1): 148-158.

[17] 費(fèi)偉東, 葉軼青, 陳玥, 等. 雙氫青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡及其機(jī)制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(13): 3473-3481.

[18] Qi L, Song F Y, Ding Y Q. Regulatory mechanism of ITGBL1 in the metastasis of colorectal cancer [J]., 2020, 10: 259.

[19] Li Q Y, Lai Q H, He C C,. RUNX1 promotes tumour metastasis by activating the Wnt/β-catenin signalling pathway and EMT in colorectal cancer [J]., 2019, 38(1): 334.

[20] Siraj A K, Pratheeshkumar P, Divya S P,. TGFβ-induced SMAD4-dependent apoptosis proceeded by EMT in CRC [J]., 2019, 18(7): 1312-1322.

[21] Saitoh M. Involvement of partial EMT in cancer progression [J]., 2018, 164(4): 257-264.

[22] Yan X J, Zhou R M, Ma Z Y. Autophagy-cell survival and death [J]., 2019, 1206: 667-696.

[23] Ulasov I V, Borovjagin A V, Timashev P,. KISS1in breast cancer progression and autophagy [J]., 2019, 38(3): 493-506.

[24] Lin F, Gao L, Su Z Y,. Knockdown of KPNA2 inhibits autophagy in oral squamous cell carcinoma cell lines by blocking p53 nuclear translocation [J]., 2018, 40(1): 179-194.

[25] Wang Y F, Zhang S Y, Dang S W,. Overexpression of microRNA-216a inhibits autophagy by targeting regulated MAP1S in colorectal cancer [J]., 2019, 12: 4621-4629.

[26] 胡婷, 陳梅香, 閆雍容, 等. miR-21在大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用及機(jī)制探討 [J]. 山東醫(yī)藥, 2012, 52(31): 7-10.

[27] Zhang B G, Zhang X B, Jin M,. CagA increases DNA methylation and decreases PTEN expression in human gastric cancer [J]., 2019, 19(1): 309-319.

[28] Jiang J H, Lv Q Y, Yi Y X,. MicroRNA-200a promotes proliferation and invasion of ovarian cancer cells by targeting PTEN [J]., 2018, 22(19): 6260-6267.

[29] Lin M G, Hong Y K, Zhang Y,. Mechanism of lncRNA DUXAP8 in promoting proliferation of bladder cancer cells by regulating PTEN [J]., 2018, 22(11): 3370-3377.

Inhibitory effect of artesunate on malignant biological behavior of human colorectal cancer CCL229 cells through miR-21/PTEN pathway

GONG Hui-jie, TANG Jian-rong, YAO Lan-jie, FENG Peng-fei

Department of Gastroenterology, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China

To explore the mechanism of inhibitory effect of artesunate on malignant biological behavior of human colorectal cancer CCL229 cells.MTT method was used to detect the effect of artesunate on viability of CCL229 cells; Flow cytometry was used to detect the effect of artesunate on apoptosis of CCL229 cells; Transwell method was used to detect the effect of artesunate on invasion of CCL229 cells; Clone formation experiment was used to detect the effect of artesunate on colony forming ability of CCL229 cells; Western blotting was used to detect the effects of artesunate on expressions of intracellular autophagy-specific proteins such as autophagy effector protein (Beclin1), light chain 3-Ⅰ/Ⅱ protein (LC3-Ⅰ/Ⅱ), autophagy related protein 5 (Atg5), Atg5-Atg12 complex, and epithelial-mesenchymal transition (EMT) related proteins such as tight junction protein (ZO-1), epithelial cadherin (E-cadherin), neuronal cadherin (N-cadherin), zinc finger transcription factor (Slug) and phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) in CCL229 cells; qRT-PCR was used to detect the effect of artesunate on expression ofmRNA in CCL229 cells; The dual luciferase reporter gene experiment was used to verify the targeting relationship betweenand; Effect of overexpression or inhibition ofandon biological behavior of artesunate in inhibiting CCL229 cells was investigated.Artesunate significantly inhibited the survival rate of CCL229 cells (< 0.05, 0.01, 0.001), promoted the apoptosis of CCL229 cells (< 0.001), inhibited CCL229 cell invasion and clone formation ability (< 0.001), up-regulated the expressions of Atg5-Atg12 complex, Atg5, Beclin1, LC3-Ⅰ/Ⅱ, ZO-1, E-cadherin in CCL229 cells (< 0.05, 0.01), and significantly down-regulated the expressions of N-cadherin and Slug (< 0.05). The expression ofmRNA in CCL229 cells was high (< 0.01), artesunate significantly inhibited the expression ofmRNA in CCL229 cells (< 0.05). Overexpression ofsignificantly inhibited the pro-apoptotic effect of artesunate on CCL229 cells (< 0.001), weakened the inhibitory effect of artesunate on CCL229 cell invasion and clonal formation (< 0.01), inhibited the up-regulation of artesunate on expressions of Atg5-Atg12 complex, Atg5, Beclin1, LC3-Ⅰ/Ⅱ, ZO-1, and E-cadherin in CCL229 cells (< 0.05, 0.01), and significantly inhibited the down-regulation of artesunate on expressions of N-cadherin and Slug protein in CCL229 cells (< 0.01); The inhibition ofexpression had the opposite effect.was the downstream target gene of. Overexpression ofsignificantly inhibited the expression of PTEN in CCL229 cells (< 0.01), the inhibited expression ofsignificantly upregulated the expression of PTEN (< 0.01), overexpression ofsignificantly inhibited the luciferase activity of wild-type PTEN (WT-PTEN) plasmid (< 0.01). Overexpression ofhad the same effect with inhibition ofexpression on CCL229 cells, while overexpression ofanddid not affect the inhibitory effect of artesunate on malignant biological behavior of CCL229 cells.Artesunate can induce apoptosis, autophagy and inhibit cell proliferation and invasion of CCL229 cells by regulating the expression of miR-21 and PTEN.

colorectal cancer; artesunate; miRNA; proliferation; invasion; epithelial-mesenchymal transition; autophagy; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2021)08 - 2331 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.016

2020-12-22

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目（20A320085）

鞏會(huì)杰（1980—），女，碩士，主治醫(yī)師，從事肝病、炎癥性腸病、急性胰腺炎、消化道腫瘤等研究。Email: zmdgonghuijie@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]