超聲聯(lián)合微泡增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的研究進(jìn)展?

范真真 張?zhí)K妍 張美如 王裕琳

(天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院 天津 300072)

0 引言

細(xì)胞是最小的生命單元。將功能性的生物分子或者材料遞送到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，是解碼細(xì)胞功能、改變細(xì)胞命運(yùn)以及重新編碼細(xì)胞行為的重要一步。正是由于細(xì)胞內(nèi)遞送在基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床治療上的重要價(jià)值，為了實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程，眾多的物理、化學(xué)和生物方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)。Stewart等[1]近期的綜述對(duì)所有以干擾細(xì)胞膜為基礎(chǔ)的細(xì)胞藥物遞送技術(shù)進(jìn)行了完整的論述。超聲和微泡聯(lián)合使用，通過(guò)微泡的聲空化與細(xì)胞膜的相互作用，實(shí)現(xiàn)靶向的細(xì)胞內(nèi)藥物遞送。超聲是一種體外施加的、具有良好的組織穿透深度、時(shí)空高度可控的物理能量。而作為超聲造影劑的微泡已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用，因此超聲聯(lián)合微泡的細(xì)胞內(nèi)藥物遞送技術(shù)在臨床應(yīng)用方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

1997年，Miller教授的研究組首次報(bào)道了超聲和超聲造影劑微泡聯(lián)合使用顯著增加了質(zhì)粒DNA對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率[2]，從而開(kāi)啟了超聲聯(lián)合微泡增強(qiáng)藥物靶向遞送的研究方向。在Web of Science以“ultrasound”、“microbubble”和“delivery”為關(guān)鍵詞，搜索到的文章數(shù)目隨年份的關(guān)系如圖1所示。在20余年的發(fā)展進(jìn)程中，現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)和機(jī)理闡釋貫穿始終。從研究對(duì)象來(lái)說(shuō)，從體外細(xì)胞試驗(yàn)逐漸進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并于2013年首次進(jìn)入了臨床試驗(yàn)；從技術(shù)發(fā)展的角度來(lái)說(shuō)，不斷豐富微泡的功能性以及提高超聲對(duì)微泡聲學(xué)響應(yīng)的可控性是近年來(lái)的研究重點(diǎn)。本文圍繞超聲聯(lián)合微泡實(shí)現(xiàn)藥物遞送的發(fā)生機(jī)理，綜述了近年來(lái)的研究進(jìn)展，并就未來(lái)的發(fā)展提出了作者的幾點(diǎn)建議和思考。

圖1 Web of Science以“ultrasound”、“microbubble”和“delivery”為主題的文章數(shù)目與年份關(guān)系Fig.1 The number of papers on“ultrasound”,“microbubble”and“delivery”versus years in Web of Science

1 微泡的聲學(xué)動(dòng)態(tài)響應(yīng)

微泡在細(xì)胞旁發(fā)生的聲空化是增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的物理基礎(chǔ)。超快速照相機(jī)的直接觀測(cè)，清晰地展示了單個(gè)微泡在穩(wěn)態(tài)空化時(shí)發(fā)生的微泡壁的周期性振動(dòng)，及其對(duì)細(xì)胞膜周期性地?cái)D壓[3](圖2(a))；在瞬態(tài)空化時(shí)微泡壁劇烈振動(dòng)甚至破碎、崩塌[4](圖2(b))或形成高速微流體噴流[5](圖2(c))，這些劇烈的沖擊會(huì)使細(xì)胞膜局部下凹、形成小孔甚至死亡。微泡空化時(shí)在周圍空間會(huì)形成微流體流(圖2(d))，從而對(duì)附近的細(xì)胞膜施加剪切力[6?7]。當(dāng)有多個(gè)微泡比鄰時(shí)，在次級(jí)聲輻射力的驅(qū)動(dòng)下，微泡會(huì)聚集，甚至融合為更大的微泡(圖2(e))，可能進(jìn)一步降低周圍細(xì)胞的存活率[8?9]。

圖2 微泡的幾種不同的聲學(xué)動(dòng)態(tài)響應(yīng)Fig.2 Several different acoustic dynamic responses of microbubbles

在穩(wěn)態(tài)空化時(shí)，自由的氣體小泡的半徑隨時(shí)間的振動(dòng)可以用Rayleigh-Plesset公式進(jìn)行描述[10]；加入了微泡膜結(jié)構(gòu)的流變性的物理模型，更為準(zhǔn)確地描述了具有膜結(jié)構(gòu)的現(xiàn)代微泡在聲場(chǎng)中的振動(dòng)[11]。Forbes等[12]提出了理論模型及實(shí)驗(yàn)觀測(cè)，表明了微泡空化形成的微流對(duì)細(xì)胞膜的剪切力可以導(dǎo)致聲孔效應(yīng)。Guo等[13]通過(guò)使用邊界單元法，把微泡和細(xì)胞視為液體中的球體，對(duì)微泡與細(xì)胞的相互作用過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)的理論研究。Yang等[14]近期的綜述圍繞微泡與微泡的相互作用，系統(tǒng)討論了微泡、細(xì)胞的物理參數(shù)，超聲參數(shù)、細(xì)胞微環(huán)境等對(duì)藥物遞送效果的影響。微泡在細(xì)胞或者黏彈性各異的生物物質(zhì)旁發(fā)生空化現(xiàn)象，從而實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的目的。Dollet等[15]近期的綜述從理論到實(shí)驗(yàn)觀測(cè)回顧了生物物質(zhì)的存在對(duì)微泡聲學(xué)動(dòng)態(tài)響應(yīng)的影響。

對(duì)微泡膜的修飾，進(jìn)一步增強(qiáng)了微泡的功能性，可以實(shí)現(xiàn)微泡對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的靶向附著，或者成為藥物的載體，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向釋放。Kooiman等[16]使用超高分辨顯微成像觀測(cè)了不同化學(xué)成分的膜所包裹的微泡，與基質(zhì)相連所形成的不同的附著面積和形變。Rong等[17]使用了獨(dú)特的成像策略，觀察到了靶向微泡與細(xì)胞相連后，所呈現(xiàn)出的6種不同的形態(tài)，如圖3(a)所示。圖3(a)中第一行代表靶向微泡與細(xì)胞相連的形態(tài)的示意圖，第二行代表兩通道疊加的熒光圖像，第三行代表每種形態(tài)對(duì)應(yīng)的邊界檢測(cè)結(jié)果。在大多數(shù)情況下，靶向微泡會(huì)有一小部分黏附在細(xì)胞膜上，這使得微泡在超聲激勵(lì)下不能進(jìn)行各向同性的球面振動(dòng)。Lajoinie等[18]提出了非球面、軸對(duì)稱的數(shù)學(xué)模型，描述了靶向微泡在聲場(chǎng)中的體積振動(dòng)，如圖3(b)所示。圖3(b)中的上圖為相同微泡大小(R0=2.4μm)和不同壓力(kPa)(顏色)下，塌縮階段的尖端的形狀(左圖)，z表示在微泡形狀的不同位置高度，r表示微泡對(duì)應(yīng)位置z的橫切面半徑。磷脂表面積S的是仰角θ的函數(shù)(右圖)；下圖為具有不同初始半徑R0的靶向微泡在210 kPa壓強(qiáng)驅(qū)動(dòng)下的模擬形狀。該模型被用于預(yù)測(cè)加載在微泡膜上的藥物分子隨微泡振動(dòng)而釋放的過(guò)程。Baresch等[19]實(shí)現(xiàn)了單束渦旋聲場(chǎng)在復(fù)雜環(huán)境中對(duì)微泡的捕獲和操控，以及微泡振動(dòng)而導(dǎo)致的可控的載藥釋放。

圖3 靶向微泡形態(tài)及振動(dòng)模擬Fig.3 Morphology and oscillation simulation of targeted microbubbles

2 細(xì)胞響應(yīng)

2.1 細(xì)胞膜上出現(xiàn)瞬態(tài)、可逆的小孔

當(dāng)較為劇烈的聲空化發(fā)生在細(xì)胞附近時(shí)，會(huì)在細(xì)胞膜上打開(kāi)小孔。小孔的形成首先是在超聲作用后迅速固定的細(xì)胞上得到證實(shí)。Prentice等[5]使用原子力顯微鏡，觀察到了細(xì)胞上直徑為16μm的小孔(圖4(a))。Schlicher等[20]以及Qiu等[21]使用掃描電鏡和透射電鏡，觀察到了細(xì)胞膜上直徑在1μm左右的小孔(圖4(b))。隨后，一些實(shí)時(shí)技術(shù)被引入到了聲孔的觀測(cè)中。Zhou等[22]和Fan等[23]使用全細(xì)胞膜片鉗，監(jiān)測(cè)整個(gè)細(xì)胞的過(guò)膜電流的實(shí)時(shí)變化。當(dāng)有小孔打開(kāi)時(shí)，過(guò)膜電流會(huì)突然增大，而后隨著小孔的閉合而逐漸減小直至恢復(fù)為零；并通過(guò)對(duì)過(guò)膜電流的擬合，估算出可逆小孔的直徑在10～200 nm(圖4(c))。Hu等[24]使用共聚焦熒光顯微成像，對(duì)熒光染色的細(xì)胞膜進(jìn)行了實(shí)時(shí)直接觀測(cè)；觀察到了直徑為5.3μm的可逆小孔(圖4(d))。

Prentice等[5]使用原子力顯微鏡觀察到了深為1μm的小孔，以及一些穿透細(xì)胞直達(dá)基質(zhì)的孔。Helfield等[7]使用實(shí)施共聚焦熒光顯微鏡觀察到了空化所致的小孔穿透了細(xì)胞的上下表層。Rong等[25]在超聲作用后迅速固定的細(xì)胞中觀察到了細(xì)胞核內(nèi)、細(xì)胞底部都出現(xiàn)了質(zhì)粒DNA。這些結(jié)果表明，小孔的深度可以穿透整個(gè)細(xì)胞。

在聲空化作用下，質(zhì)膜上孔是否發(fā)生以及發(fā)生位置會(huì)受到微泡大小和微泡與細(xì)胞之間距離的影響[26?27]。不同的細(xì)胞之間距離與微泡直徑的相對(duì)大小對(duì)應(yīng)于不同的膜穿孔效率[26,28?30]。因此，改變膜穿孔效率可以通過(guò)調(diào)整微泡與細(xì)胞之間的距離(d)與微泡大小(D)的比值(d/D)來(lái)實(shí)現(xiàn)[26,28?30]。除了改變超聲發(fā)生模式外，也可以采用利用配體或抗體修飾微泡的方式，即將被修飾的微泡與細(xì)胞表面受體相結(jié)合進(jìn)而改善輸送效率。該方式作為應(yīng)用于靶向藥物輸送的新的途徑，具有相當(dāng)大的臨床治療價(jià)值。

小分子物質(zhì)碘化丙啶是不可滲透細(xì)胞膜的，在細(xì)胞外不顯熒光；當(dāng)它進(jìn)入細(xì)胞與核酸結(jié)合后，會(huì)顯示出紅色熒光。碘化丙啶的這種熒光特性使其成為實(shí)時(shí)指示細(xì)胞膜上的小孔的理想指示劑，在聲孔效應(yīng)的機(jī)理性研究中廣泛使用。碘化丙啶的實(shí)時(shí)熒光顯微成像顯示，在空化現(xiàn)象發(fā)生后，細(xì)胞膜上的小孔隨即迅速打開(kāi)，之后逐漸收縮至閉合；成功閉合的過(guò)程一般在100 s之內(nèi)[7?8,17,23,30?31]。全細(xì)胞膜片鉗記錄過(guò)膜電流，比熒光成像具有更高的時(shí)間分辨率(0.5 ms)，但是由于超聲振動(dòng)極易振掉膜片鉗與細(xì)胞膜形成的緊密吸附，限制了膜片鉗的記錄能力。Zhou等[22]和Fan等[23]使用全細(xì)胞膜片鉗記錄到的小孔成功閉合發(fā)生在10 s之內(nèi)。Hu等[24]對(duì)熒光染色的細(xì)胞膜進(jìn)行了實(shí)時(shí)直接觀測(cè)，結(jié)果顯示小孔成功閉合的過(guò)程在50 s之內(nèi)?？傊】椎闹睆?、位置、深度和閉合時(shí)間由多種因素共同決定，包括超聲參數(shù)[32]、微泡特性[8]、微泡和細(xì)胞的距離[29,33]等。這些小孔的存在增加了血管通透性，有助于膜上藥物的轉(zhuǎn)移。

關(guān)于小孔閉合的機(jī)制，多項(xiàng)研究表明[34?36]，鈣離子經(jīng)小孔流入細(xì)胞內(nèi)是小孔成功閉合的必要條件。Leow等[35]觀察到在靶向微泡附著的位置，在超聲作用后，僅在存活的細(xì)胞的細(xì)胞膜上出現(xiàn)起泡的現(xiàn)象，因此推測(cè)細(xì)胞膜的起泡是幫助細(xì)胞恢復(fù)平衡狀態(tài)的方式。聲孔尺寸很小，且在存活的細(xì)胞中是瞬態(tài)存在，這給研究小孔閉合的生物學(xué)機(jī)制提出了不小的挑戰(zhàn)。作為一種機(jī)械損傷，聲孔很可能也是經(jīng)歷擴(kuò)張、收縮和閉合3個(gè)階段；細(xì)胞經(jīng)歷感知小孔、修復(fù)小孔、閉合小孔和重塑細(xì)胞膜及細(xì)胞骨架的過(guò)程；修復(fù)過(guò)程可能由鈣肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白驅(qū)動(dòng)，由細(xì)胞膜的流動(dòng)性、內(nèi)吞、胞吐作用參與完成[37]。小孔的閉合能夠?qū)崿F(xiàn)是保證細(xì)胞維持活性的必要條件，對(duì)于臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)也是保證超聲聯(lián)合微泡技術(shù)應(yīng)用的安全性和實(shí)用性的必然要求。

圖4 細(xì)胞膜上小孔的形態(tài)和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Fig.4 Morphology and real-time monitoring of the pores on the cell membrane

2.2 其他細(xì)胞層響應(yīng)

當(dāng)有小孔打開(kāi)時(shí)，實(shí)時(shí)熒光顯微成像可觀察到同時(shí)發(fā)生的自小孔流入的鈣離子流。由于細(xì)胞內(nèi)外存在的巨大的自由鈣離子濃度的差異(細(xì)胞培養(yǎng)液的鈣離子濃度為0.9 mM，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度在100 nM以下)，在濃度梯度的驅(qū)使下，鈣離子迅速的從小孔進(jìn)入細(xì)胞，在5～10 s內(nèi)達(dá)到濃度峰值，之后逐漸恢復(fù)到平衡態(tài)(大約100 s左右)[23,38]。隨后，與發(fā)生聲孔效應(yīng)相鄰的一些細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)延遲的、峰值更小的鈣離子濃度的波動(dòng)(即細(xì)胞間的鈣波)[23,38]。鈣離子是重要的第二信使，參與諸多細(xì)胞功能的調(diào)控，因此聲孔效應(yīng)所引發(fā)的鈣波有可能參與較為長(zhǎng)期、更大范圍的生物效應(yīng)的調(diào)控。

細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜相連，是貫穿整個(gè)細(xì)胞的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)。細(xì)胞骨架為細(xì)胞提供機(jī)械強(qiáng)度和力學(xué)支撐，在維持細(xì)胞形態(tài)、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形變和遷移和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫姘l(fā)揮著重要作用。Chen等[39]、Fan等[31]以及Wang等[33]都觀察到聲孔效應(yīng)迅速引發(fā)細(xì)胞骨架的分解，從聲孔處發(fā)展到整個(gè)細(xì)胞，即使細(xì)胞存活下來(lái)，細(xì)胞骨架在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(60 min)未能恢復(fù)。

當(dāng)細(xì)胞受到空化作用刺激時(shí)，內(nèi)吞作用被觸發(fā)。一方面，如前文所述，內(nèi)吞作用促進(jìn)了膜的重新閉合，另一方面空化刺激的內(nèi)吞作用也被認(rèn)為是一種主動(dòng)傳遞途徑，大分子物質(zhì)可以被吸收進(jìn)入細(xì)胞。但由于內(nèi)吞作用的觸發(fā)主要與聲空化作用刺激相關(guān)的生物或/和物理信號(hào)有關(guān)，從而引起細(xì)胞本身活躍的行為，因此很難得到內(nèi)吞作用與微泡作用域之間的空間關(guān)系。

內(nèi)皮細(xì)胞間往往通過(guò)多種蛋白質(zhì)大分子相互連接，而其中部分種類的蛋白質(zhì)又往往與細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架相連?？栈饔每赡軙?huì)引起膜穿孔，進(jìn)而引起細(xì)胞骨架、內(nèi)皮間連接(包括緊密連接、黏附連接和間隙連接)和黏著斑的變化，并且這一過(guò)程中可能伴隨著細(xì)胞的收縮。在這些生物效應(yīng)的影響和作用下，內(nèi)皮間隙形成[26]。內(nèi)皮間隙的形成往往可以改變血管的完整性，便于大分子物質(zhì)輸送到血管外組織中。除此之外，像聲空化作用下細(xì)胞膜小孔的打開(kāi)和封閉一樣，內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接也存在恢復(fù)機(jī)制。這一機(jī)制也為暫時(shí)打開(kāi)血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)提供了可能[40]。內(nèi)皮細(xì)胞間連接的打開(kāi)和恢復(fù)的程度和動(dòng)力學(xué)既取決于超聲聯(lián)合微泡作用的模式和強(qiáng)度也包括微泡與細(xì)胞相對(duì)位置關(guān)系。但是，由于技術(shù)原因，目前對(duì)于聲空化與內(nèi)皮細(xì)胞間隙變化的動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)系了解仍不足[26]。除了以上提到可逆小孔的形成、鈣離子內(nèi)流、細(xì)胞骨架的分解和打開(kāi)細(xì)胞與細(xì)胞間的連接以外，細(xì)胞對(duì)聲穿孔的響應(yīng)也包括活性氧族(Reactive oxygen species,ROS)的釋放[26]。2018年，Jia等[41]發(fā)現(xiàn)聲孔作用下細(xì)胞中的ROS水平與聲穿孔程度有關(guān)。Qin等[26]近期的綜述中對(duì)聲空化引發(fā)的生物效應(yīng)進(jìn)行了全面的回顧。

3 細(xì)胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程

不可滲透細(xì)胞膜的小分子物質(zhì)，如碘化丙啶(分子量668 Da)，進(jìn)入細(xì)胞的方式是通過(guò)在細(xì)胞膜上打開(kāi)的瞬態(tài)的小孔，在濃度梯度的驅(qū)動(dòng)下流入細(xì)胞內(nèi)部[7,38]。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的小分子物質(zhì)往往呈連續(xù)均勻分布，如圖5(a)所示。小孔閉合后，其在細(xì)胞內(nèi)分布的動(dòng)態(tài)變化可以用二維無(wú)源擴(kuò)散問(wèn)題進(jìn)行擬合，在幾分鐘之內(nèi)達(dá)到平衡狀態(tài)[23]。通過(guò)小孔是不可滲透細(xì)胞膜的小分子物質(zhì)經(jīng)聲空化介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞的最主要的方式(小分子物質(zhì)的進(jìn)入位置與微泡的位置完全對(duì)應(yīng)，且沒(méi)有微泡處沒(méi)有小分子物質(zhì)的進(jìn)入)。而隨著細(xì)胞外物質(zhì)的分子量的增加(如分子量為4 kDa和2 MDa的右旋糖苷，直徑分別約為1.23 nm和32.78 nm)，在經(jīng)過(guò)超聲和微泡作用后，其進(jìn)入細(xì)胞的總量逐漸減少，其在細(xì)胞內(nèi)的分布越來(lái)越不均勻，呈現(xiàn)出離散的斑點(diǎn)狀，與微泡位置的對(duì)應(yīng)關(guān)系逐漸減弱[20,32,42](圖5(b))。

質(zhì)粒DNA是環(huán)狀DNA鏈，一般有多于1000個(gè)堿基對(duì)，分子量大于1 MDa，直徑大約在幾百納米。與小分子物質(zhì)相比，質(zhì)粒DNA在空化作用下進(jìn)入細(xì)胞的方式更為多樣，有效的進(jìn)入時(shí)間更長(zhǎng)。Mehier-Humbert等[43]觀察到與脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(借助內(nèi)吞作用)相比，超聲和微泡作用后，質(zhì)粒DNA快速地大量地出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中(因此作者推測(cè)是由小孔進(jìn)入)，但是沒(méi)有保護(hù)的質(zhì)粒DNA也更快地被DNA酶降解。Liu等[44]觀察到了約30%的質(zhì)粒DNA在超聲和微泡作用后30 min以離散的斑點(diǎn)狀出現(xiàn)在細(xì)胞(包括細(xì)胞核)中。Rong等[25]捕捉到在有靶向微泡附著的位置上，質(zhì)粒DNA正在跨越細(xì)胞膜(圖5(c))，證明了小孔是質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞的一種可行途徑；同時(shí)還觀察到細(xì)胞內(nèi)有多處的質(zhì)粒DNA與微泡的位置無(wú)關(guān)，且在較低聲壓，無(wú)聲孔效應(yīng)的條件下，也有質(zhì)粒DNA快速的進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。因此該論文得出結(jié)論超聲和微泡介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程是一個(gè)快速的、發(fā)生在全細(xì)胞尺度的、激發(fā)多種過(guò)膜機(jī)制的(打開(kāi)小孔、內(nèi)吞作用和尚未闡明的快速全細(xì)胞尺度的進(jìn)入方式等)動(dòng)態(tài)過(guò)程。

圖5 不同尺寸物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程Fig.5 The process of substances of different sizes entering the cell

4 臨床試驗(yàn)的進(jìn)展

癌癥組織一般具有致密的結(jié)締組織基質(zhì)，不僅壓迫血管減少了血液灌流[45](從而減少了藥物輸送)，而且使得藥物難以穿透基質(zhì)抵達(dá)癌細(xì)胞[46]。此外由于癌細(xì)胞的無(wú)限增殖，癌組織內(nèi)部的滲透壓升高[47]，進(jìn)一步抑制了基于擴(kuò)散的藥物遞送。癌組織的這些病理特點(diǎn)嚴(yán)重降低了化療藥物的遞送效率?；熕幬镏饕淖饔脵C(jī)制是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此對(duì)正常細(xì)胞具有較大的副作用。靶向給藥技術(shù)與化療藥物的聯(lián)合使用，能夠增強(qiáng)癌組織對(duì)化療藥物的攝取，同時(shí)降低化療藥物對(duì)全身健康細(xì)胞的副作用，因此靶向給藥技術(shù)對(duì)于基于化療的癌癥治療具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

增厚的、致密的和藥物幾乎無(wú)法穿透的基質(zhì)是胰腺癌的顯著特征，迫切需要靶向給藥技術(shù)增強(qiáng)化療效果。2013年，Kotopoulis等[48]報(bào)道了超聲、微泡、吉西他濱針對(duì)胰腺癌的聯(lián)合使用，結(jié)果顯示該療法增加了患者耐受化療的周期數(shù)，延長(zhǎng)了患者的生存期。2016年，Dimcevski等[49]開(kāi)展了超聲、微泡、吉西他濱聯(lián)合使用治療胰腺癌的臨床試驗(yàn)，評(píng)估了治療的安全性、潛在毒性以及患者的中位生存期，證實(shí)了該療法不會(huì)引起額外的毒性或增加化療藥物原有的副作用，延長(zhǎng)了患者的壽命，如圖6所示。2018年，Wang等[50]報(bào)道了一項(xiàng)在我國(guó)開(kāi)展的針對(duì)胰腺癌肝轉(zhuǎn)移患者，采用超聲、微泡和化療藥物聯(lián)合使用的臨床研究，未引發(fā)患者產(chǎn)生其他毒副作用，表明該療法具有良好的安全性。目前，更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)正在我國(guó)開(kāi)展中。

圖6 利用超聲和微泡治療胰腺癌的臨床試驗(yàn)Fig.6 Clinical trial using ultrasound and microbubbles in the treatment of pancreatic cancer

在進(jìn)行腦部疾病的藥物治療時(shí)，血腦屏障的存在是藥物進(jìn)入腦部患處的巨大障礙。超聲聯(lián)合微泡技術(shù)憑借其可實(shí)現(xiàn)聲空化的特點(diǎn)能夠短暫和局部打開(kāi)血腦屏障，為解決這一問(wèn)題提供了新的選擇[51]。同時(shí)，這也為靶向輸送化療藥物到腦部腫瘤處提供了新的途徑。目前已經(jīng)進(jìn)行了大量的預(yù)臨床實(shí)驗(yàn)，例如2013年，F(xiàn)an等[52]通過(guò)將抗惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(BCNU)封裝在與VEGF-A配體偶聯(lián)的靶向微泡中，實(shí)現(xiàn)靶向藥物的輸送和釋放，減少了腫瘤發(fā)展；2014年，Burke等[53]將納米粒子(Nano-particles,NP)藥物載體偶聯(lián)到MBs形成MB-NP復(fù)合劑(MB-NP composite agents,MNCA)，改善了納米載體的遞送并且在超聲的作用下增加了NP向腫瘤的遞送，抑制了腫瘤生長(zhǎng)，小鼠存活率顯著提高。臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中，2016年，Carpentier等[54]開(kāi)展的臨床試驗(yàn)中證明了脈沖超聲聯(lián)合微泡技術(shù)對(duì)于復(fù)發(fā)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者是安全且耐受性良好的。

除了利用超聲聯(lián)合微泡技術(shù)研究胰腺癌和腦腫瘤之外，人們也將目光投向其他癌癥希望能夠通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物的增敏效果，提高化療藥物對(duì)腫瘤組織的殺傷效果。目前針對(duì)于原發(fā)性結(jié)腸癌導(dǎo)致的肝轉(zhuǎn)移和乳腺癌患者的臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中[51]。

超聲和微泡的聯(lián)合使用是一項(xiàng)具有廣泛應(yīng)用性的靶向給藥技術(shù)，除了用于增強(qiáng)化療藥物的靶向提送、提高癌癥治療效果以外，其他活躍的研究領(lǐng)域還包括：用于增加血腦屏障的通透性，提高針對(duì)神經(jīng)和精神類疾病藥物在大腦的富集；促進(jìn)針對(duì)心血管疾病藥物的靶向遞送；增加血管-脊髓屏障的滲透性，提高藥物進(jìn)入脊髓的效率；增加藥物的經(jīng)皮給藥效率等。Stride等[55]近期的綜述對(duì)超聲聯(lián)合微泡在臨床應(yīng)用中的進(jìn)展進(jìn)行了回顧。

5 總結(jié)與展望

超聲聯(lián)合微泡增強(qiáng)藥物遞送技術(shù)經(jīng)過(guò)20余年的發(fā)展，在微泡聲空化的物理機(jī)制、細(xì)胞的各種生物響應(yīng)、藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)特征等方面均取得了豐富的研究成果，使得人們對(duì)該技術(shù)發(fā)生機(jī)理的認(rèn)知不斷加深。目前，該技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的階段，安全性和有效性得到了初步的驗(yàn)證。

圍繞機(jī)理性研究，作者有以下幾點(diǎn)建議和思考。(1)在更為接近體內(nèi)環(huán)境的實(shí)驗(yàn)條件下開(kāi)展機(jī)理性研究。目前已有的機(jī)理性研究中所用的細(xì)胞均為懸浮狀態(tài)或?yàn)楦街谟操|(zhì)基底上的單細(xì)胞層。這與細(xì)胞的體內(nèi)生存狀態(tài)(如附著在細(xì)胞外基質(zhì)上、暴露在一定的物理化學(xué)分子條件中、與組織中其他細(xì)胞相互作用等)相差很大。而且體內(nèi)具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。以癌癥治療為例，經(jīng)靜脈注射進(jìn)入血液循環(huán)后，微泡需要首先在目標(biāo)組織中跨越血管壁(同時(shí)盡量避免出血)，穿越細(xì)胞外基質(zhì)后，抵達(dá)癌細(xì)胞。隨后，微泡在超聲照射下，增加癌細(xì)胞的通透性。隨著組織工程、生物材料、3D打印等技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建出能夠反映體內(nèi)三維結(jié)構(gòu)的體外組織模型，并在其中開(kāi)展機(jī)理性研究，將大大推進(jìn)人們對(duì)于該技術(shù)在體內(nèi)的發(fā)生機(jī)理的認(rèn)識(shí)，更好地指導(dǎo)臨床試驗(yàn)中治療策略的制定、參數(shù)設(shè)計(jì)等工作，提高治療效果。(2)深入研究在穩(wěn)態(tài)聲空化下更為廣泛的生物效應(yīng)。由于臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)是保障安全(盡量避免出血、健康組織不可逆的損傷等)，因此臨床應(yīng)用更青睞安全性更好的較低的超聲照射。目前已有的機(jī)理性研究多聚焦于聲孔效應(yīng)，未來(lái)可加大在較低超聲強(qiáng)度下穩(wěn)態(tài)聲空化引發(fā)的更為廣泛的生物效應(yīng)，比如激發(fā)免疫細(xì)胞活性、抑制癌細(xì)胞癌變進(jìn)程或者遷移能力和降低癌組織基質(zhì)細(xì)胞的分泌能力等。這些生物效應(yīng)可能是間接但安全有效地增強(qiáng)藥物靶向遞送的途徑。(3)探究減小聲空化所帶來(lái)的不良生物效應(yīng)的措施。在將超聲聯(lián)合微泡的靶向給藥技術(shù)不斷向臨床應(yīng)用推進(jìn)的進(jìn)程中，大量細(xì)胞死亡、出血等是超聲空化所引起的各種不良生物效應(yīng)[26,56]。除了調(diào)整微泡劑量和超聲參數(shù)來(lái)減小不良生物效應(yīng)外，也可以采用縮短空化作用下膜孔的開(kāi)啟和閉合的窗口時(shí)間的方法。該方法有助于提高基于聲孔效應(yīng)的藥物遞送的效率和安全性[26]。例如，可以考慮從生化角度去影響膜閉合，利用細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平觸發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞和胞吐作用進(jìn)而促進(jìn)膜孔封閉的特點(diǎn)，來(lái)影響Ca2+相關(guān)的信號(hào)通路[26]。此外，采用更小的微泡也有可能減小不良生物效應(yīng)。與作用于細(xì)胞和組織微米級(jí)小泡相比，直徑在1μm以下的納米小泡可以滲透過(guò)血管壁，并可能在癌組織基質(zhì)中有更深的滲透深度，因此很有可能能夠減少出血。納米級(jí)微泡的制備技術(shù)在近年來(lái)發(fā)展很快。納米級(jí)小泡尺寸過(guò)小，且包含氣體，因此在發(fā)展之初難以觀察和研究其動(dòng)態(tài)響應(yīng)等。關(guān)注納米級(jí)微泡的聲學(xué)響應(yīng)及藥物遞送機(jī)理是十分必要的。相信成像技術(shù)的快速發(fā)展必將允許人們對(duì)納米級(jí)小泡的聲學(xué)響應(yīng)及藥物遞送機(jī)理開(kāi)展更為深入的研究。

與此同時(shí)，一些新的工程方法的引入，擴(kuò)展了基于聲空化的細(xì)胞藥物遞送的實(shí)現(xiàn)方式，推進(jìn)了其向著高度可控、高通量的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)的方向發(fā)展。Li等[57]利用聲子晶體增強(qiáng)的近壁聲流實(shí)現(xiàn)了可逆的聲孔效應(yīng)。Belling等[58]利用在毛細(xì)管中的聲流實(shí)現(xiàn)了高通量的基于聲孔效應(yīng)的向多種人類細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染。

總之，作為一項(xiàng)非侵入式的、非病毒的藥物遞送技術(shù)，超聲和微泡的聯(lián)合使用在臨床應(yīng)用上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(具有良好的靶向性、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)圖像引導(dǎo)等)。經(jīng)過(guò)20余年的發(fā)展，人們已經(jīng)在其發(fā)生機(jī)理上積累了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)知。同時(shí)也應(yīng)該客觀地認(rèn)識(shí)到，目前的臨床試驗(yàn)結(jié)果和理想的治療效果之間還存在很大差距。未來(lái)，需要在臨床醫(yī)生、物理學(xué)家、化學(xué)家和生物學(xué)家的共同努力下，不斷提高該技術(shù)的安全性、靶向性和有效性，最終使患者受益。