檢測(cè)一氧化氮的熒光探針研究進(jìn)展

吳志文，張振濤

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

一氧化氮(NO)是一種重要的氣體分子，是通過(guò)三種不同的一氧化氮合酶(內(nèi)皮型一氧化氮合酶eNOS；神經(jīng)元一氧化氮合酶nNOS；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS)將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸而產(chǎn)生的[1]。從生理學(xué)上講，NO是一種內(nèi)源性的表皮舒張因子，可刺激血管平滑肌舒張，并且還充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)和免疫系統(tǒng)中的抗感染分子，以抵抗感染。從病理上講，NO與穩(wěn)態(tài)障礙發(fā)作有關(guān)[2-4]。由于其明確的意義，開發(fā)用于實(shí)時(shí)追蹤生物系統(tǒng)中NO水平的靈敏方法和工具，對(duì)于人類的健康至關(guān)重要。在過(guò)去的幾十年中，電化學(xué)，電子順磁共振，化學(xué)發(fā)光，比色法和熒光法等許多分析技術(shù)已被用于檢測(cè)不同環(huán)境下的NO[5-11]。在這些方法中，基于熒光的生物成像方法因其出色的靈敏度和選擇性，高分辨率，無(wú)創(chuàng)性，廣泛的被用于NO的檢測(cè)，目前，已經(jīng)開發(fā)出用于檢測(cè)NO的各種小分子熒光探針。特別是在過(guò)去的五年中，已經(jīng)報(bào)道了各種具有改善的熒光性質(zhì)和傳感能力的NO熒光探針，其中一些在監(jiān)測(cè)生物系統(tǒng)中的外源性和內(nèi)源性NO方面顯示出巨大的潛力。本綜述總結(jié)了近年來(lái)報(bào)道的新型NO熒光探針。討論了采用不同NO識(shí)別基團(tuán)和方法的有機(jī)物和金屬配合物熒光探針，以及它們?cè)隗w外和體內(nèi)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)外源性和內(nèi)源性NO的應(yīng)用。

通常，基于有機(jī)物的NO熒光探針通常包含兩個(gè)關(guān)鍵元素，即NO識(shí)別位點(diǎn)和熒光團(tuán)。NO識(shí)別位點(diǎn)可以與NO發(fā)生特異性化學(xué)反應(yīng)，并激發(fā)熒光團(tuán)發(fā)生特異性發(fā)性，起到捕捉NO的作用，很多官能團(tuán)可以用作NO識(shí)別位點(diǎn)，例如鄰苯二胺，可以與NO發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成苯并三唑；二氫吡啶(Hantzsch酯)，可以與NO發(fā)生氧化反應(yīng)，將二氫吡啶芳構(gòu)化；芳香族仲胺，可以與NO反應(yīng)，生成N-亞硝產(chǎn)物。為了實(shí)現(xiàn)NO探針的細(xì)胞器靶向能力，還會(huì)配備一些官能團(tuán)作為遞送載體，以將探針特異性地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞器，如帶正電荷的三苯基膦可以靶向到線粒體，帶弱堿性嗎啉可以靶向溶酶體。

1 基于有機(jī)物的NO熒光探針

1.1 基于鄰苯二胺環(huán)化的熒光探針

由長(zhǎng)野研究小組最早開發(fā)的基于鄰苯二胺的NO熒光探針是生物系統(tǒng)中NO檢測(cè)最廣泛使用的探針[5,12-17]。在沒(méi)有NO的情況下，將發(fā)生從富電子的鄰苯二胺基團(tuán)到熒光團(tuán)的光致電子轉(zhuǎn)移(PET)過(guò)程，以猝滅熒光。在富氧條件下與NO反應(yīng)后，富電子的鄰苯二胺部分可以轉(zhuǎn)化為吸電子的苯并三唑環(huán)，從而阻斷PET過(guò)程并激發(fā)熒光團(tuán)，從而提供可檢測(cè)的熒光發(fā)射。

2016年，Chen J B等[18]將鄰二胺基苯基連接到了3,5-(2-羥基苯基)-二亞甲基吡咯上，首次合成了硼螯合熒光探針(BOPB)(圖1)，該探針在622/643 nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)下，可以敏感且選擇性地響應(yīng)，并且可以用于小鼠肝臟中的NO的檢測(cè)。與之前報(bào)道的用于確定NO的熒光探針?lè)椒ㄏ啾?，該方法具有更長(zhǎng)的檢測(cè)波長(zhǎng)(675 nm)，最短的衍生時(shí)間(12 min)和最低的LOD(0.02 nM)。

圖1 BOPB探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

同年，F(xiàn)eng W等[19]合成了一種基于1,8-萘甲酰亞胺的鄰苯二胺熒光探針LysoNONaph(圖2)，用于對(duì)溶酶體中的NO進(jìn)行成像。該探針在pH值為3.8～12的范圍內(nèi)不敏感，對(duì)NO的選擇性高，靈敏度低，檢出限低至4.57 mmol/L，因此可以用于細(xì)胞溶酶體成像。

圖2 LysoNONaph探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

2018年，Zhang J等[20]通過(guò)將鄰苯二氨基與BODIPY染料相連接，成功設(shè)計(jì)出了一種用于檢測(cè)NO和亞硝酸鹽的雙響應(yīng)式熒光探針1(圖3)。該探針本質(zhì)上由于PET效應(yīng)而不會(huì)發(fā)熒光，但是在中性條件下用NO處理或在酸性環(huán)境中用亞硝酸鹽處理時(shí)，探針會(huì)迅速變?yōu)楦邿晒鉅顟B(tài)，具有高選擇性和低檢測(cè)限。在細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，使用DEA·NONOate作為NO的源并在細(xì)胞內(nèi)Cys和GSH的輔助下，探針1可以觀察到藍(lán)色熒光。

圖3 探針1的合成及探針1對(duì)NO的預(yù)期傳感機(jī)理

圖4 探針2對(duì)NO的傳感機(jī)制

同年，WangQ等[22]合成了一種選擇性和靈敏的陽(yáng)離子熒光探針(ROPD)(圖5)，該探針以鄰苯二胺基作為反應(yīng)位點(diǎn)，以羅丹明作為熒光團(tuán)。該探針在寬pH范圍內(nèi)在水相中顯示出對(duì)NO的高選擇性和靈敏度，并具有快速響應(yīng)。同時(shí)，探針ROPD可以透過(guò)細(xì)胞膜，可用于實(shí)時(shí)觀察L929和HeLa細(xì)胞中的外源NO，以及應(yīng)激的RAW 264.7細(xì)胞中的內(nèi)源性NO。

圖5 ROPD探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

2019年，Jiang WL等[23]合成了dRB-OPD的熒光探針(圖6)并用于識(shí)別NO。該探針以鄰苯二胺基作為反應(yīng)位點(diǎn)，以脫氧羅丹明B作為熒光團(tuán)。dRB-OPD顯示40秒鐘內(nèi)對(duì)NO的快速響應(yīng)，熒光增強(qiáng)170倍。此外，該探針相對(duì)于脫氫抗壞血酸(DHA)，抗壞血酸(AA)和甲基乙二醛(MGO)表現(xiàn)出對(duì)NO的高選擇性。特別地，該探針可以避免來(lái)自若丹明內(nèi)酰胺基熒光NO探針(RB-OPD)中發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸(Cys)的嚴(yán)重干擾?？梢杂糜跈z測(cè)HepG2和RAW 264.7細(xì)胞中的外源性和內(nèi)源性NO。

圖6 dRB-OPD探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

1.2 基于芳族仲胺N-亞硝化的熒光探針

基于芳族仲胺N-亞硝化的熒光探針對(duì)NO的檢測(cè)具有完美的選擇性，因?yàn)橛捎谥侔坊鶊F(tuán)的電子密度控制，與基于鄰苯二胺類的熒光探針不同，該探針不受其他活性氧發(fā)生反應(yīng)/氮物種(RNS/ROS)和活性羰基物質(zhì)(RCS)物質(zhì)的干擾。此外，芳族仲胺與各種金屬離子的配位能力較低，這對(duì)于其高選擇性也至關(guān)重要。

2017年，Mao Z等[24]設(shè)計(jì)了一種基于芳香族仲胺的N-亞硝化的新型熒光探針NCNO(圖7)，探針NCNO可以在ROS，RNS和RCS之間以明顯的選擇性和靈敏度識(shí)別NO。由于其雙光子激發(fā)和紅光發(fā)射，可以檢測(cè)到活細(xì)胞和深層組織中的NO。該探針還首次被用于監(jiān)測(cè)缺血再灌注損傷(IRI)小鼠腎臟中的NO。

圖7 NCNO探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

2019年Huo Y等[25]合成了一種芳香族仲胺N-亞硝化的探針1及可靶向線粒體的衍生物探針Mito1(圖8)，作為熒光NO探針，該用于區(qū)分M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)水平差異。這兩種探針具有獨(dú)特的能力，能夠同時(shí)響應(yīng)NO的兩種二次氧化物，即N2O3和ONOO3，因此，與大多數(shù)通常僅響應(yīng)N2O3的現(xiàn)有熒光NO探針相比，反映細(xì)胞內(nèi)的NO更加敏感和可靠。進(jìn)一步表明該探針在癌癥免疫療法研究和相關(guān)的抗癌藥物篩選中成像的應(yīng)用潛力。

1906年《治安法官法》最終取消了治安法官的財(cái)產(chǎn)資格，僅規(guī)定任命的治安法官不得不住在本郡或居住在所擔(dān)任治安法官的郡七英里內(nèi)。1949年《治安法官法》擴(kuò)大到離該郡15英里范圍內(nèi)居住，1979年《治安法官法》再一次規(guī)定直到今天仍是有關(guān)治安法官資格僅有的法令?，F(xiàn)在治安法官的任命往往可慮下列情況：

圖8 探針1和Mito1探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

1.3 基于二氫吡啶氧化的熒光探針

二氫吡啶(Hantzsch酯)可以被NO定量氧化，以平穩(wěn)地提供相應(yīng)的吡啶部分。因此，二氫吡啶基團(tuán)可以用作NO捕獲基團(tuán)，用于開發(fā)新型熒光探針。更有趣的是，二氫吡啶與NO的反應(yīng)可以在厭氧環(huán)境下進(jìn)行，這將明顯提高熒光探針對(duì)NO的選擇性。

2016年，Ma S F等[26]合成了由7-甲氧基香豆素(作為熒光團(tuán))和二氫吡啶衍生物(作為NO的受體)組成DHP-1熒光探針(圖9)，用于檢測(cè)NO。探針DHP-1的光學(xué)特性和活細(xì)胞成像顯示出對(duì)NO的快速響應(yīng)，其熒光強(qiáng)度比背景增強(qiáng)了80倍，并且對(duì)NO的選擇性高于其他活性氧或氮。DHP-1探針還可用于在生物學(xué)相關(guān)pH范圍內(nèi)檢測(cè)活細(xì)胞中的NO。

圖9 DHP-1 探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

同年，Wang H L等[27]合成了香豆素的水溶性二氫吡啶的衍生物DHPS(圖10)，并將其成功應(yīng)用于水溶液中的熒光傳感一氧化氮(NO)。DHPS探針的熒光極弱，而加入NO溶液后其熒光極大地打開，并顯示出高的選擇性和對(duì)NO的敏感性。檢測(cè)限為18 nM。細(xì)胞毒性試驗(yàn)證明DHPS和PYS都是生物相容的，DHPS已被成功應(yīng)用于追蹤RAW 264.7細(xì)胞中內(nèi)源性產(chǎn)生的NO。

圖10 DHPS探針的結(jié)構(gòu)

2018年，Gao C等[28]通過(guò)將二氫吡啶和三苯基膦(TPP)部分引入到硼聯(lián)吡啶(BODIPY)染料中，設(shè)計(jì)并合成了用于一氧化氮(NO)的線粒體靶向探針Mito-DHP(圖11)。Mito-DHP通過(guò)在無(wú)氧條件下將二氫吡啶芳構(gòu)化為熒光吡啶產(chǎn)物，可以有效地檢測(cè)一氧化氮。Mito-DHP探針對(duì)多種活性氧/氮(ROS/ RNS)表現(xiàn)出對(duì)NO的高選擇性，以及高靈敏度(25 nM的檢測(cè)限)，pH穩(wěn)定性和生物相容性。

圖11 Mito-DHP探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

1.4 其他類型的有機(jī)基NO熒光探針

2014年，Xin Lv等[29]通過(guò)將特定的NO識(shí)別基團(tuán)2-氨基-3-二甲基氨基聯(lián)苯連接到Bodipy染料中，構(gòu)建了熒光探針3(圖12)，該探針該探針可以選擇性地檢測(cè)ROS/RNS和AA/DHA/MGO上的NO，檢測(cè)限低至30 nM。將細(xì)胞用該探針預(yù)處理1小時(shí)并與DEA·NONONOate(50 mM)孵育1 h后，可以觀察到細(xì)胞中強(qiáng)烈的熒光。這些結(jié)果證實(shí)了探針1具有可視化活細(xì)胞中NO水平的潛力。

圖12 探針3對(duì)NO的傳感機(jī)制

2019年Liu Y等[30]合成了基于花青染料(Cy7)的熒光探針(圖13)，用于通過(guò)在Cy7染料的內(nèi)消旋位置上連接甲基氨基來(lái)檢測(cè)NO。由于分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程，該探針在800 nm處顯示微弱的熒光發(fā)射，而用NO處理后，該探針迅速變成高度NIR熒光狀態(tài)。檢測(cè)限低至11.3 nM。該探針對(duì)NO的選擇性超過(guò)活性氧，活性氮和金屬離子。更重要的是，該探針對(duì)NO的熒光反應(yīng)發(fā)生在生理上有利的NIR區(qū)域，從而使其能夠進(jìn)一步用于在背景干擾低且穿透深度較深的發(fā)炎小鼠模型中對(duì)內(nèi)源性NO成像。

圖13 Cy7-MA探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

同年，F(xiàn)u YL等[31]開發(fā)了一種新型熒光探針8-HB(圖14)，該探針以BODIPY作為熒光團(tuán)，并以8-取代的肼為活性部位來(lái)檢測(cè)NO。探針8-HB可以與NO/O2反應(yīng)生成熒光脫水的BODIPY，并伴有少量的8-疊氮化物BODIPY。 8-HB具有出色的靈敏性(LOD=22 nM)。此外，8-HB具有很低的細(xì)胞毒性和良好的生物相容性，并能在活的HepG2細(xì)胞中選擇性地檢測(cè)NO活性氧/氮物種(ONOO-、H2O2和ClO-) 并檢測(cè)活體RAW264.7細(xì)胞內(nèi)源性NO。

圖14 8-HB探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

2 基于金屬配合物的熒光探針

2.1 基于銅(II)配合物的NO熒光探針

基于Cu(II)的配合物是開發(fā)NO熒光探針的理想選擇。Cu(II)中不成對(duì)的電子與配體配位后，可以猝滅熒光團(tuán)產(chǎn)生的熒光。但是用NO處理后，Cu(II)平穩(wěn)地轉(zhuǎn)化為Cu(I)，從而使淬滅作用消除，熒光恢復(fù)。

圖15 Cu(II)探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

2017年，ALoas等[32]設(shè)計(jì)了兩種新的基于Cu(II)的探針(圖15)，用于一氧化氮的檢測(cè)。傳感器分別采用聚脯氨酸螺旋和哌嗪?jiǎn)卧鳛閯傂蚤g隔基，并通過(guò)FRET機(jī)制在7-羥基香豆素和熒光素生色團(tuán)之間進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移。這兩種探針通過(guò)其對(duì)生理pH值下對(duì)NO的敏感，直接和選擇性的比例響應(yīng)，并使它們具有增強(qiáng)的細(xì)胞滲透性和亞細(xì)胞定位功能。

2.2 基于銥(III)配合物的NO熒光探針

穩(wěn)定的銥(III)配合物由于其強(qiáng)而長(zhǎng)壽命的熒光發(fā)射，也可以用作基于金屬絡(luò)合物的熒光團(tuán)?？梢砸胍粋€(gè)NO識(shí)別基團(tuán)來(lái)激發(fā)PET過(guò)程并猝滅熒光，從而提供另一種基于金屬配合物的NO探針。

Wu C等[33]設(shè)計(jì)并合成了一種長(zhǎng)壽命的發(fā)光銥(III)配合物探針1(圖16)，用于監(jiān)測(cè)從硝普鈉(SNP)可控釋放的NO。探針1在580 nm處存在SNP時(shí)顯示15倍的開啟發(fā)光。探針對(duì)SNP的線性響應(yīng)在5～25 μM之間，檢測(cè)極限為0.18 μM。重要的是，證明了HeLa細(xì)胞中NO的發(fā)光開關(guān)檢測(cè)。

圖16 銥(III)探針對(duì)NO的傳感機(jī)制

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)報(bào)道的用于在生物系統(tǒng)中對(duì)NO成像的各種熒光探針。大部分還是基于有機(jī)物的NO熒光探針，基于金屬絡(luò)合物的NO熒光探針很少，這些探針顯示出高選擇性和靈敏度，低細(xì)胞毒性和深層的組織穿透能力，非常適合在體外和體內(nèi)對(duì)NO成像。但是，同樣也存在濃度低，半衰期短和擴(kuò)散特性快等缺點(diǎn)，因此開發(fā)出能夠準(zhǔn)確分析生物系統(tǒng)中NO的熒光探針仍然是科學(xué)家面臨的巨大挑戰(zhàn)。