基于TaqMan探針熒光PCR檢測(cè)致瀉性大腸埃希氏菌

袁慕云，許龍巖*，柯碧霞，陳 瑤

（1 廣州海關(guān)技術(shù)中心 廣州510623 2 廣東省疾病預(yù)防控制中心 廣州510440 3 南方醫(yī)科大學(xué) 廣州510515）

致瀉大腸埃希氏菌（diarrheagenic Escherichia coli，DEC），可通過(guò)污染食物引起人類(lèi)發(fā)病，主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌 （Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）、腸道集聚性大腸埃希氏菌 （enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）[1-4]。隨著對(duì)DEC 致病機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用普通PCR 或熒光PCR 方法檢測(cè)DEC 越來(lái)越受到認(rèn)可并廣泛應(yīng)用，而普通PCR 方法產(chǎn)物需要通過(guò)電泳進(jìn)行觀察，操作繁瑣，而且部分目的片段大小差異在20 bp 左右，用瓊脂糖電泳難以區(qū)分[5-9]。朱林英等[10]根據(jù)DEC 的8 種毒力基因設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)1 658 份糞便樣品。陳愛(ài)萍等[11]根據(jù)DEC 部分基因用熒光PCR 檢測(cè)DEC。胡安妥等[12]根據(jù)11 種毒力基因建立兩組多重?zé)晒釶CR 擴(kuò)增體系檢測(cè)DEC，然而，不能區(qū)分?jǐn)U增的志賀毒素基因是Stx1 和Stx2 中的哪一種，而且均未系統(tǒng)分析擴(kuò)增體系的擴(kuò)增效率、線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2等熒光PCR 關(guān)鍵參數(shù)。本研究根據(jù)bfpB（bundle-forming pilus B，束狀菌毛B基因）、eaeA （gene encoding intimin for Escherichia coli attaching and effacing，緊密素基因）、LT（heat-labile enterotoxin，熱不穩(wěn)定性腸毒素基因）、ST（heat-stable enterotoxin，熱穩(wěn)定性腸毒素基因）、Stx1（Shiga toxin one，志賀毒素Ⅰ基因）、Stx2（Shiga toxin two，志賀毒素Ⅱ基因）、ipaH（invasive plasmid antigen H-gene，侵襲性質(zhì)?？乖璈 基因）和aggR（aggregative adhesive fimbriae regulator 集聚黏附菌毛調(diào)節(jié)基因）設(shè)計(jì)引物和探針，建立基于TaqMan 探針熒光PCR 體系檢測(cè)EPEC、ETEC、EIEC、STEC 和EAEC，并評(píng)價(jià)熒光PCR 擴(kuò)增體系的特異性、擴(kuò)增效率，以期應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株96 株，DEC 共26 株，其中EPEC 12 株（標(biāo)準(zhǔn)菌株1 株，分離株11 株）、ETEC 5 株（標(biāo)準(zhǔn)菌株1 株，分離株4 株）、STEC 5 株（標(biāo)準(zhǔn)菌株3 株，CICC10670 有Stx1，Stx2、CICC10669 只有Stx2，CICC10668 只有Stx1，分離株2 株）、EIEC侵襲性大腸桿菌3 株 （標(biāo)準(zhǔn)菌株1 株，分離株2株）、EAEC 標(biāo)準(zhǔn)菌株1 株。沙門(mén)氏菌等非DEC 70株[13]。上述菌株分別來(lái)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、廣東省疾病預(yù)防控制中心、廣州海關(guān)技術(shù)中心。

1.2 主要儀器和試劑

實(shí)時(shí)熒光PCR 儀，ABI7900-美國(guó)ABI 公司；全自動(dòng)核酸提取儀12GC 核酸純化系統(tǒng)，日本Precision System Science 公司；熒光PCR（Probe qPCR Mix），寶生物工程（大連）有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯、腸道增菌液培養(yǎng)基，北京陸橋有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 公布的uidA （GenBank：JQ068101.1）、bfpB （Sequence：NG_034726.1）、eaeA （GenBank：AJ579305.1）、LT（GenBank：M17873.1）、ST（GenBank：M18346.1）、Stx1（GenBank：FR875155.1）、Stx2（GenBank：AB030484.1）、ipaH（GenBank：JQ638638.1）、aggR（GenBank：Z32523.1）設(shè)計(jì)引物和TaqMan 探針，委托寶生物工程（大連）有限公司合成。引物和探針序列見(jiàn)表1。

表1 熒光PCR 引物和探針序列Table 1 Primers and probes for real-time fluorescent quantitative PCR

1.3.2 模板DNA 制備 DEC 菌株用營(yíng)養(yǎng)肉湯37℃培養(yǎng)6 h，取10 μL 接種于30 mL 腸道增菌夜肉湯42 ℃培養(yǎng)18 h，取1 mL 菌懸液移入離心管，12 000 r/min 離心3 min 去上清，用1 mL 去離子水漂浮沉淀，12 000 r/min 離心2 min 去上清，重復(fù)2次，加200 μL 去離子水在全自動(dòng)核酸提取儀上提取DNA，用于熒光PCR 擴(kuò)增。非DEC 對(duì)照菌株用相應(yīng)的培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，取1 mL 菌懸液移入離心管，按上述步驟提取DNA 用于熒光PCR 擴(kuò)增。

1.3.3 熒光PCR 擴(kuò)增體系建立 uidA 基因單重?zé)晒釶CR 體系30 μL，模板DNA 1 μL、探針20 μmol/L 1 μL、引物20 μmol/L 各1 μL（共2 μL）、Probe qPCR Mix 14 μL、去離子水12 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)參數(shù)為95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)。

A、B 體系各4 個(gè)基因，A 體系為bfpB、eaeA、LT、ST，B 體系為ipaH、stx1、stx2、aggR，兩個(gè)熒光PCR 體系均為30 μL，模板DNA 2 μL（每種菌株各1 μL，A 組2 μL，B 組3 μL）、TaqMan 探針20 μmoL/L 各1 μL（共4 μL）、引物20 μmoL/L 各1 μL （共8 μL）、Probe qPCR Mix 12 μL （B 組11 μL）、去離子水4 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)參數(shù)為95 ℃30 s、95 ℃5 s、61 ℃34 s、40 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 多重?zé)晒釶CR 擴(kuò)增體系評(píng)價(jià) 經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)，原始濃度分別為107CFU/mL 數(shù)量級(jí)的DEC 標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液分別進(jìn)行10 倍梯度稀釋?zhuān)瑥拿總€(gè)稀釋度中取1 mL 培養(yǎng)液，按1.4 節(jié)方法提取DNA，進(jìn)行A 組、B 組四重?zé)晒釶CR 敏感性試驗(yàn)。在實(shí)時(shí)熒光PCR 儀上選擇標(biāo)準(zhǔn)品模式，儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。uidA 以標(biāo)準(zhǔn)菌株EPEC CICC24189 為模版，A 體系以標(biāo)準(zhǔn)菌株EPEC CICC24189、ETECCICC10667 為模版，B 體系以標(biāo)準(zhǔn)菌株STEC CICC10670、EIECCICC24188、EAECCICC24816 為模版。

1.3.5 特異性試驗(yàn) DEC 26 株，70 株沙門(mén)氏菌等非DEC 為模版，進(jìn)行引物和探針特異性試驗(yàn)。大腸埃希氏菌ATCC25922 作為陰性對(duì)照，以滅菌去離子水作為空白對(duì)照，控制PCR 體系污染。

1.3.6 結(jié)果判斷 實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增曲線(xiàn)指數(shù)期明顯，Ct 值<37 為陽(yáng)性判定原則。其中以Ct 值<35 且擴(kuò)增曲線(xiàn)指數(shù)期明顯可直接判定為陽(yáng)性。Ct值在35～37 之間判斷為可疑，需要加大模板量進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，如出現(xiàn)指數(shù)期明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)方可判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3.7 模擬樣品檢測(cè) 分別秤取25 g 豬肉，分別添 加100，101，102CFU/mL，3個(gè)不同數(shù)量級(jí)濃度EPEC/CICC24189、ETEC/CICC10667、STEC/EHECCICC10670、EIEC/CICC24188、EAEC/CI CC24816 標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液各1 mL，共制成20 份模擬樣品（未添加菌懸液的樣品作為陰性對(duì)照）。每份樣品中加入225 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min，37 ℃培養(yǎng)6 h，取10 μL 接種于30 mL 腸道增菌夜肉湯，42 ℃培養(yǎng)18 h，按1.3.2 節(jié)方法制備模板DNA 進(jìn)行熒光PCR 擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光PCR 擴(kuò)增體系評(píng)價(jià)

熒光PCR 擴(kuò)增體系評(píng)價(jià)結(jié)果，A、B 兩個(gè)體系中擴(kuò)增曲線(xiàn)指數(shù)期均明顯，擴(kuò)增曲線(xiàn)之間互不干擾，而且模板濃度與Ct 值之間也出現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，A 體系中bfpB、eaeA、LT、ST 的擴(kuò)增效率分別為98.0%，92.3%，102.2%，90.6%，線(xiàn)性系數(shù)R2分別為0.976，0.995，0.990，0.984。B 體系中ipaH、Stx1、Stx2、aggR 擴(kuò)增效率分別為93.8%，97.2%，92.7%，89.6%，線(xiàn)性系數(shù)R2分別為0.999，0.998，0.991，0.965，兩個(gè)體系最低檢測(cè)濃度分別達(dá)到102 CFU/mL 數(shù)量級(jí)，與單重?zé)晒釶CR 擴(kuò)增體系相比毫無(wú)遜色[14-16]。uidA 擴(kuò)增效率為98.3%，線(xiàn)性系數(shù)R2為0.998（見(jiàn)圖1，表2）?；赥aqMan 探針的熒光PCR 擴(kuò)增體系，理想的擴(kuò)增效率是80%～120%，最佳擴(kuò)增效率達(dá)到90%～105%，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2要大于0.98[17-18]。本研究建立的擴(kuò)增體系A(chǔ)、B 擴(kuò)增體系和uidA 體系的擴(kuò)增效率和線(xiàn)性系數(shù)R2均在上述范圍，表明設(shè)計(jì)的DEC 引物探針序列匹配較佳，擴(kuò)增體系的優(yōu)化較理想，充分滿(mǎn)足熒光PCR 擴(kuò)增體系要求。

圖1 多重?zé)晒釶CR 擴(kuò)增圖（B 組）Fig.1 Amplifying curve for multiplex PCR amplification （Group B）

2.2 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

uidA 的引物和探針特異性試驗(yàn)結(jié)果，26 株DEC 和大腸埃希氏菌ATCC25922 均擴(kuò)增出uidA基因，其它69 株非DEC 擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

表2 熒光PCR 擴(kuò)增體系評(píng)價(jià)Table 2 Evaluation of fluorescence PCR amplification system

EPEC 是幼畜和嬰兒腹瀉的一類(lèi)病原菌，主要特征是能在感染家畜和嬰兒的腸上皮細(xì)胞表面形成黏附與脫落損傷（A/E 損傷），EPEC 不產(chǎn)生腸毒素及其它外毒素，無(wú)侵襲力，可產(chǎn)生緊密黏附素。eaeA 基因是編碼緊密黏附素基因，是引起A/E損傷的主要基因，在所有能引起A/E 損傷的EPEC、EHEC、弗氏枸櫞酸桿菌和蜂房哈夫尼菌等中都能檢測(cè)到eaeA 基因或其同源序列，而在不引起A/E 損傷的正常腸道大腸桿菌、ETEC 等菌中則沒(méi)有這種序列。bfpB 基因編碼束狀菌毛的黏附因子，EPEC 的局灶性黏附主要由bfp 基因介導(dǎo)，該基因在引起疾病暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查中具有研究?jī)r(jià)值，目前對(duì)EPEC 的分子生物學(xué)檢測(cè)重要依據(jù)是eaeA 基因陽(yáng)性[19-20]。本研究以UidA、eaeA、bfpB的擴(kuò)增檢測(cè)EPEC。按A 組擴(kuò)增體系試驗(yàn)結(jié)果，12株EPEC 試驗(yàn)菌株中8 株菌株擴(kuò)增出bfpB 和eaeA，分別為CMCC44155、O127a：K8、O86：K7、O111：K4、O119：K14、O26：K6、O114：K2：H32、O128：K12，3 株菌株O55：K5、O125ac：H6 和O128ab：H2擴(kuò)增出eaeA，1 株菌株O127a 只擴(kuò)增出bfpB，其它9 株DEC（5 株STEC 擴(kuò)增出eaeA 基因）和70 株非DEC 擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

STEC 能引起水樣腹瀉、出血性腸炎、血小板減少性紫癜、溶血性尿毒綜合征等。志賀毒素（Shiga toxin，Stx）Stx 基因是STEC 最重要的致病因子，分為Stx1 和Stx2 亞單位，兩個(gè)基因的核苷酸序列有50%～60%同源，同時(shí)或分別單獨(dú)存在于STEC 中。eaeA 基因位于染色體LEE 毒力島上編碼黏附素，該基因同時(shí)存在于STEC 和EPEC中，其同源性達(dá)到87.23%，EPEC 和STEC 的eaeA基因在靠5′端2/3 部分高度同源，在3′端變異較大[21-22]。本研究設(shè)計(jì)的eaeA 基因擴(kuò)增片段在EPEC和STEC 的同源區(qū)域，設(shè)計(jì)的引物探針可以擴(kuò)增STEC 和EPEC 的eaeA 基因。本研究根據(jù)UidA、eaeA、Stx1、Stx2 擴(kuò)增檢測(cè)STEC，擴(kuò)增出Stx1，Stx2基因中1 種或2 種則判斷為STEC。試驗(yàn)結(jié)果，5株STEC 攜帶毒力基因情況不同，CICC10670 擴(kuò)增3 個(gè)毒力基因eaeA、Stx1、Stx2，CICC10669 擴(kuò)增出eaeA、Stx2，CICC10668 擴(kuò)增出eaeA、Stx1，O121：K：H10 只擴(kuò)增出Stx1，O145 K-：H 只擴(kuò)增出Stx2，其它20 株DEC 和70 株非DEC 的Stx1、Stx2 基因擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

ETEC 的致病過(guò)程是在腸道內(nèi)定居、繁殖，然后釋放毒素引起細(xì)胞壞死和腸道紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致急性腹瀉，其毒素按照抗原和生物學(xué)特性不同分為不耐熱腸毒素（Heat labile enterotoxin，LT）和耐熱腸毒素 （Heatstable enterotoxin，ST）。LT 是由ETEC 分泌的外毒素，ST 有很強(qiáng)的毒素活性，而免疫原性極差，通過(guò)激活腸黏膜上皮細(xì)胞的鳥(niǎo)苷活化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP 升高而導(dǎo)致腹瀉，LT 和ST單獨(dú)或共同存在于ETEC 中[23-25]。本研究擴(kuò)增UidA、LT 和ST 檢測(cè)ETEC，擴(kuò)增ST 和LT 中1 種或2 種確認(rèn)為ETEC。試驗(yàn)結(jié)果，5 株ETEC 中CICC10667、O11：K10 （4）：H10、O25：K29（L）：H12、O126：B16：H2，4 株菌株擴(kuò)增出LT、ST，1 株菌株O20：B83 只擴(kuò)增出LT，其它21 株DEC 和70 株非DEC 未擴(kuò)增出擴(kuò)增曲線(xiàn)。

EIEC 多數(shù)菌株無(wú)動(dòng)力，不產(chǎn)生腸毒素，但可引起痢疾樣的臨床癥狀。多序列和全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果均表明EIEC 和志賀菌致病機(jī)制基本相同、引起腹瀉的臨床癥狀也極其相似，最佳鑒別EIEC 與其它DEC 的基因即為ipaH 基因，ipaH基因多拷貝存在于EIEC 和志賀氏菌染色體和侵襲性大質(zhì)粒上，不隨傳代而丟失，序列差異不明顯[26-28]。本研究根據(jù)UidA、ipaH 檢測(cè)EIEC。試驗(yàn)結(jié)果CICC24188、O124：K72（B17）：H32、O112 B11，3 株EIEC 均擴(kuò)增出ipaH 基因。其它23 株DEC和70 株非DEC 檢測(cè)結(jié)果，3 株志賀氏菌即鮑氏志賀菌、宋內(nèi)氏志賀菌和痢疾志賀菌擴(kuò)增出ipaH 基因，其它菌株未擴(kuò)增出該基因。3 株志賀氏菌擴(kuò)增出ipaH 基因，但uidA 的擴(kuò)增結(jié)果為陰性，擴(kuò)增UidA 基因可以區(qū)分志賀氏菌和DEC。腸道集聚性大腸桿菌（EAEC）不侵襲細(xì)胞，可產(chǎn)生毒素和黏附素，檢測(cè)EAEC 可以通過(guò)其高度保守的特異性基因aggR[29-30]。本研究根據(jù)UidA、aggR 檢測(cè)EAEC。試驗(yàn)結(jié)果顯示，EAEC CICC248163 擴(kuò)增出aggR，其它25 株DEC 和70 株非DEC 擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

表3 致瀉性大腸埃希氏菌檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of diarrheagenic Escherichia coli

2.3 模擬樣品檢測(cè)結(jié)果

為了檢驗(yàn)建立的熒光PCR 擴(kuò)增體系的實(shí)用性，豬肉為基質(zhì)添加不同數(shù)量級(jí)濃度DEC 制成實(shí)際模擬樣品進(jìn)行檢測(cè)。GB4789.6 致瀉性大腸桿菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品前處理是[31]，待測(cè)樣品用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)6 h，腸道菌增菌液培養(yǎng)18 h，劃線(xiàn)分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)確認(rèn)為大腸桿菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板或斜面純化培養(yǎng)，刮取菌落用煮沸法提取DNA。本研究模擬樣品檢測(cè)是營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)6 h，腸道菌增菌液培養(yǎng)18 h 后從腸道菌增菌液中直接取肉湯提取DNA 用于熒光PCR 試驗(yàn)，檢測(cè)周期提前2～3 d。腸道菌增菌液培養(yǎng)基呈透明綠色，培養(yǎng)DEC時(shí)產(chǎn)酸變黃培養(yǎng)基變渾濁，取樣時(shí)先輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，待靜止1～2 min 從液面取培養(yǎng)液離心，去離子水漂浮沉淀多次后再提取DNA，避免吸入樣品并稀釋對(duì)熒光PCR 干擾的成分。試驗(yàn)結(jié)果表明，按不同濃度分別添加EPEC、ETEC、STEC、EIEC、EAEC 的15 份模擬樣品均擴(kuò)增出與預(yù)期相符的擴(kuò)增曲線(xiàn)，雖然Ct 值與添加濃度之間沒(méi)有出現(xiàn)較好的線(xiàn)性關(guān)系，但與添加菌株的基因型別完全一致（表4）。

表4 豬肉污染樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of contaminated pork samples

3 討論

致瀉性大腸埃希氏菌的致病性取決于所攜帶的毒力基因、侵襲性基因等致病因子，相應(yīng)致病因子的檢測(cè)是對(duì)DEC 分類(lèi)鑒別的重要依據(jù)。多重?zé)晒釶CR 技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，一次可以檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)基因，適合于DEC 的檢測(cè)。目前常用的ABI7900 等熒光PCR 儀上基于TaqMan 探針的擴(kuò)增體系，理論上能同時(shí)檢測(cè)5 個(gè)目標(biāo)基因即可以做5 重?zé)晒釶CR，廠家建議熒光染料組合是FAM、VIC、NED、ROX、TET，但試驗(yàn)結(jié)果基于Taq-Man 探針的5 重PCR 目標(biāo)擴(kuò)增曲線(xiàn)之間相互干擾，擴(kuò)增效率低于50%，線(xiàn)性關(guān)系R2小于0.90，不能滿(mǎn)足熒光PCR 擴(kuò)增體系要求。本研究從幾十種DEC 的致病因子選擇9 種DEC 特征基因做為目標(biāo)基因，建立了基于TaqMan 探針熒光PCR 擴(kuò)增體系，根據(jù)DEC 通用基因uidA 先篩查，陽(yáng)性結(jié)果根據(jù)8 種DEC 的毒力基因和侵襲力特征基因建立2 個(gè)多重?zé)晒釶CR 擴(kuò)增體系鑒別5 種DEC，A體 系bfpB、eaeA、LT、ST 基因，檢測(cè)EPEC 和ETEC，B 體系ipaH、Stx1，Stx2、aggR，檢測(cè)EIEC、STEC 和EAEC。

多重?zé)晒釶CR 技術(shù)是在一個(gè)擴(kuò)增體系中加入多對(duì)引物和探針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，因此對(duì)引物和探針的要求非常嚴(yán)格。本研究反復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)和確認(rèn)，熒光PCR 擴(kuò)增體系引物對(duì)內(nèi)部、多對(duì)引物之間、探針與引物、探針之間避免形成發(fā)夾環(huán)、二聚體結(jié)構(gòu)，多對(duì)TaqMan 探針大小在20～25 bp，TaqMan 探針的Tm 值盡量接近，A 組中4個(gè)探針Tm 值在67.1～67.9，B 組4 個(gè)探針Tm 值在67.9～68，同時(shí)引物和探針位置都在目標(biāo)基因保守序列內(nèi)[32]。本研究遵循上述原則設(shè)計(jì)引物和探針擴(kuò)增效率和線(xiàn)性系數(shù)均在最佳范圍內(nèi)，特異性也得到較好的保證。擴(kuò)增體系評(píng)價(jià)結(jié)果，A、B 擴(kuò)增體系中每個(gè)目標(biāo)基因擴(kuò)增曲線(xiàn)互不干擾，擴(kuò)增效率在89.6%←102.2%，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2除B 體系中ROX 標(biāo)記的aggR 基因0.965 外，其它目標(biāo)基因均大于0.98，本研究的2 個(gè)熒光PCR 體系中使用的熒光染料組合均是FAM、VIC、TET、ROX （表3），多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5' 端用ROX 熒光燃料標(biāo)記的目標(biāo)片段在單重?zé)晒釶CR 體系中擴(kuò)增效率和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2在理想的范圍內(nèi)，但多重?zé)晒釶CR 體系中的兩項(xiàng)指標(biāo)均低于FAM、VIC、TET 標(biāo)記的擴(kuò)增片段，這可能與ROX 和FAM 等其它熒光燃料在同一個(gè)反應(yīng)體系時(shí)其發(fā)射光受干擾較強(qiáng)有關(guān)[33]。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，26 株DEC 中25 株DEC 可準(zhǔn)確鑒別 出EPEC、ETEC、EIEC、STEC、EAEC，只有1 株EPEC 分離株O127a：H-，只擴(kuò)增出bfpB 基因未擴(kuò)增出eaeA 基因，按照EPEC 判斷規(guī)則，該菌株不能確定為EPEC，該菌株的eaeA基因是否在多次傳代過(guò)程中丟失而導(dǎo)致檢測(cè)不出有待進(jìn)一步確認(rèn)。

本研究根據(jù)DEC 的UidA、bfpB、eaeA、LT、ST、ipaH、Stx1、Stx2、aggR 基因序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan 探針，建立熒光PCR 檢測(cè)EPEC、ETEC、EIEC、STEC 和EAEC 方法，建立的方法特異性較強(qiáng)，引物和探針設(shè)計(jì)較佳，擴(kuò)增體系優(yōu)化理想，操作簡(jiǎn)便，但只試驗(yàn)了豬肉一種樣品，今后將在膨化食品、植物源性食品、臨床標(biāo)本等樣品檢測(cè)中不斷優(yōu)化和完善。