基于固相萃取-薄層色譜圖像分析法鑒別糖漿摻假蜂蜜

張路遙，陳瑞盈，張 萌，盧 新，彭 強(qiáng)

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100）

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)自身釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。因蜂蜜營(yíng)養(yǎng)豐富，具有美容養(yǎng)顏，幫助消化，促進(jìn)傷口愈合等作用而深受消費(fèi)者喜愛[2]。蜂蜜成分復(fù)雜，容易受到蜜源植物種類、蜜蜂種類、空氣的溫度和濕度以及蜂蜜釀造時(shí)間等多種因素的影響[3]。在利益的驅(qū)動(dòng)下，有些商戶及廠家向蜂蜜中摻入果葡糖漿、麥芽糖漿、玉米糖漿等廉價(jià)糖漿，以天然蜂蜜的形式投放市場(chǎng)，欺騙消費(fèi)者以獲取暴利[4]。蜂蜜摻假損害了消費(fèi)者權(quán)益，嚴(yán)重影響了蜂蜜市場(chǎng)秩序。

對(duì)摻假蜂蜜的鑒別研究，一直是科研人員關(guān)注的課題。國(guó)內(nèi)外已建立多種檢測(cè)分析方法，如高效液相色譜法、碳穩(wěn)定同位素分析法、近紅外光譜法、核磁共振法、氣相色譜法和差熱分析法等[5-10]，這些方法所需儀器昂貴，檢測(cè)成本較高，不適用于地方檢測(cè)機(jī)構(gòu)[11]。薄層色譜法（thin layer chromatographic，TLC）常用于物質(zhì)的定性鑒別和篩選，是一種低成本、快速的檢測(cè)方法[12]。在糖漿生產(chǎn)過程中，某些抗性糊精不能被完全酶解，其成品不可避免地存在少量聚合度較高的寡糖，而這種物質(zhì)在真蜂蜜中并不存在[13-14]。2015 版藥典采用薄層色譜法檢測(cè)蜂蜜中的寡糖[15]，然而該方法分離效果不理想，影響結(jié)果判斷，且需要通過肉眼觀察TLC 薄層板來判斷是否摻假，易造成較大的主觀偏差[16]。建立經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、有效的蜂蜜摻假檢測(cè)方法，對(duì)維護(hù)消費(fèi)者利益，保護(hù)消費(fèi)者健康，規(guī)范蜂蜜市場(chǎng)具有重要意義。

近年來，圖像分析法用于定量評(píng)價(jià)薄層色譜圖，TLC 圖像可由CCD 攝像機(jī)或平板掃描儀獲得，再用圖像分析軟件進(jìn)一步處理，應(yīng)用較廣泛的圖像分析軟件有Image J、Image-Pro Plus、Scion ColorDens、TLSee、JustTLC 等[17-19]。這些軟件有以下功能：（1）TLC 薄層板在展開顯色過程中可能會(huì)被污染，可通過去除背景噪音來校正圖像；（2）通過計(jì)算TLC 薄層板上特征斑點(diǎn)的峰面積或灰度值來進(jìn)行定量分析；（3）繪制TLC 色譜圖，每個(gè)特征斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)色譜峰。研究發(fā)現(xiàn)TLC 掃描法與TLC圖像分析法對(duì)物質(zhì)的定量分析無顯著差異，圖像分析法具有簡(jiǎn)便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)分析多個(gè)樣品[20-21]。陸光興等[22]用Image J 軟件定量熱凝膠β-1，3-葡寡糖，該方法靈敏度高，實(shí)現(xiàn)了對(duì)熱凝膠β-1，3-葡寡糖的定量分析，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為1%～5%，且具有較好的穩(wěn)定性；Fazakas 等[23]利用圖像分析軟件對(duì)熒光化合物進(jìn)行定量分析，比較4種圖像分析軟件（Sorbfil TLC、Biodit、JustTLC 和Melanie），結(jié)果發(fā)現(xiàn)Biodit 軟件對(duì)待測(cè)物質(zhì)的定量分析最準(zhǔn)確。Tang 等[24]采用薄層色譜圖像分析技術(shù)對(duì)紫錐菊中菊苣酸進(jìn)行定量研究，通過檢測(cè)限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性和回收率等對(duì)整個(gè)方法進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示：該圖像分析法適用于薄層色譜的定量分析。Sakunpak 等[25]建立并驗(yàn)證了定量冷榨米糠油中γ-谷維素的圖像分析方法，分別采用TLC圖像分析法和TLC 掃描法進(jìn)行定量分析，用配對(duì)t 檢驗(yàn)比較兩種定量方法所得結(jié)果。結(jié)果顯示：兩種方法對(duì)冷榨米糠油中γ-谷維素的定量測(cè)定具有相似的穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。在γ-谷維素定量測(cè)定試驗(yàn)中，TLC 掃描法和TLC 圖像分析法之間沒有任何統(tǒng)計(jì)上的顯著差異。本試驗(yàn)對(duì)固相萃取和薄層色譜的條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合Image J和Sorbfil 圖像分析軟件，對(duì)蜂蜜中摻假果葡糖漿進(jìn)行檢驗(yàn)和檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然蜂蜜，西北大學(xué)蜂產(chǎn)品研究所，蜂蜜品種為洋槐蜜；市售蜂蜜，陜西楊陵超市；葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97%），Solarbio 公司；F60 型果葡糖漿，浙江華康藥業(yè)股份有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯、乙酸、苯胺、二苯胺、磷酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

AR224CN 分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；XW-80A 旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Epson Perfection V19 掃描儀，P.T.印度尼西亞愛普生工業(yè)公司；RE52-86A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；5 μL 微量進(jìn)樣針，上海高鴿工貿(mào)有限公司；島津寡糖專用固相萃取柱（200 mg 硅藻土/500 mg 活性炭/200 mg 硅藻土，6 mL）；SupelcleanTM椰殼活性炭固相萃取柱（2 g，6 mL），美國(guó)Supelco 公司；Sillca gel UV254薄層板 （長(zhǎng)×寬：20 cm×20 cm），德國(guó)Macherey-Nagel 公司；薄層色譜展開缸 （長(zhǎng)×高：20 cm×20 cm），上海信誼儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取葡萄糖、麥芽二糖至七糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，分別加蒸餾水制成每1 mL 含10 mg 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別量取麥芽七糖貯備液100 μL，加水稀釋成0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（Ⅰ），1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（Ⅱ），使用前配制。

1.3.2 固相萃取前處理 稱取待測(cè)蜂蜜2 g，置25 mL 燒杯中，加入10 mL 蒸餾水溶解并混合均勻。將島津固相萃取柱用25 mL 水活化后，使上述溶液通過固相萃取柱。用25 mL 體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液清洗，棄清洗液，用20 mL 體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65 ℃減壓濃縮至干[26]。用200 μL 蒸餾水渦旋溶解殘?jiān)?，供TLC 測(cè)定用。將果葡糖漿與天然蜂蜜按質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～40%的摻假水平配制摻假樣品溶液，按上述方法進(jìn)行樣品前處理。取水（不加蜂蜜）10 mL，按上述方法制備空白樣品溶液。

1.3.3 薄層色譜法分析 用微量進(jìn)樣針取蜂蜜樣品溶液2 μL，點(diǎn)樣于Sillca gel UV 254 薄層板上。采用二次展開法，以乙酸-乙酸乙酯-蒸餾水（2∶2∶1.4）和乙酸-乙酸乙酯-蒸餾水（2∶2.6∶1.4）為展開劑，兩次展開的展距分別為5 cm 和11 cm。展開缸加入展開劑后預(yù)平衡15 min，再放入薄層板展開，展開過的薄層板自然晾干后，噴灑苯胺-二苯胺-磷酸溶液 （1 g 二苯胺、1 mL 苯胺、5 mL 磷酸溶解于50 mL 丙酮），105 ℃加熱5 min 顯色[27]。

1.3.4 圖像處理與分析 用Epson Perfection V19 掃描儀掃描顯色后的薄層板，掃描條件為：專業(yè)模式、24 位全彩、分辨率400 dpi，圖片以JPEG格式保存。使用Image J 軟件對(duì)掃描得到的圖片進(jìn)行圖像分析，將圖像轉(zhuǎn)換為8 位灰度圖，選擇400 pixels 消除背景影響，將圖片轉(zhuǎn)換為亮帶模式。選擇工具欄下矩形框，圈出七糖斑點(diǎn)后使用快捷鍵“Ctrl+M”，彈出窗口內(nèi)“IntDen”列表標(biāo)題下即該區(qū)域的灰度值。在工具欄中選擇矩形工具并框出寡糖條帶，點(diǎn)擊“Plot Lanes”后出現(xiàn)寡糖條帶的灰度曲線圖。

使用Sorbfil TLC Videodensitometer 軟件對(duì)掃描得到的圖片進(jìn)行圖像分析，設(shè)置每條軌道等寬，背景強(qiáng)度設(shè)置每條線寬度3，高度30，噪聲過濾設(shè)置為7，點(diǎn)擊軌道評(píng)估，對(duì)所選擇的寡糖軌道進(jìn)行分析，測(cè)得寡糖對(duì)應(yīng)的峰面積和比移值。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取條件的選擇

2.1.1 固相萃取柱比較 參照文獻(xiàn)[28]、[29]方法，選擇活性炭填料的固相萃取柱，比較島津萃取柱和SupelcleanTM萃取柱對(duì)寡糖的萃取效果，結(jié)果顯示，在島津萃取柱萃取后的摻假蜂蜜中觀察到五糖及以上寡糖條帶，而在SupelcleanTM萃取柱萃取后的摻假蜂蜜中觀察不到寡糖條帶，含有較多的單糖，大量存在的單糖會(huì)干擾寡糖的分析，見圖1。分析認(rèn)為由于SupelcleanTM萃取柱沒有島津萃取柱的填料緊實(shí)，因此洗脫速度較快，導(dǎo)致寡糖成分和洗脫劑不能達(dá)到洗脫平衡，不利于寡糖的解吸，不如島津萃取柱對(duì)寡糖的富集效果好。

2.1.2 清洗劑的選擇 分別稱取5 份天然蜂蜜樣品，每份2 g，各加入10 mL 水溶解后注入固相萃取柱，分別用25 mL 體積分?jǐn)?shù)10%，15%，20%，25%和30%的乙醇溶液清洗，棄清洗液。分別用20 mL 50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，65 ℃減壓濃縮至干，分別向殘?jiān)屑?00 μL 水復(fù)溶。按1.3.3 節(jié)方法進(jìn)行TLC 展開并顯色，按1.3.4 節(jié)方法掃描，用Image J 軟件灰度分析得到不同清洗條件下清洗液中單糖和寡糖的灰度值，見圖2。隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，單糖和寡糖的灰度值逐漸減小，即保留在萃取柱中的單糖和寡糖逐漸減少，說明乙醇濃度越高，對(duì)單糖和寡糖的清洗能力越強(qiáng)。因較高濃度的乙醇溶液可能清洗掉五糖以上寡糖，故需對(duì)不同濃度的清洗劑做進(jìn)一步驗(yàn)證。

取質(zhì)量濃度為3 mg/mL 的麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)品各40 μL，加水定容10 mL。平行配制5 份上述混合標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)固相萃取柱吸附，收集濾液，用25 mL 體積分?jǐn)?shù)10%，15%，20%，25%和30%的乙醇溶液清洗，各清洗液旋蒸至干后加200 μL 水。清洗液和濾液按1.3.3 節(jié)方法進(jìn)行薄層層析，按1.3.4 節(jié)方法進(jìn)行灰度分析，用Image J 軟件制作色譜圖[24-25]。圖3顯示：以10%，15%，20%乙醇溶液做清洗劑時(shí)，麥芽五糖至七糖不受清洗過程的影響，可保留在萃取柱中，25%和30%乙醇溶液在清洗過程中目標(biāo)寡糖被清洗掉，說明其不適合做清洗劑。由于20%乙醇溶液的洗脫能力較大并且不破壞目標(biāo)寡糖，因此試驗(yàn)選擇20%乙醇溶液作為清洗劑，清洗用量為25 mL，此條件可去除蜂蜜中大部分的單糖和二糖，見圖1。

圖1 萃取柱分離效果對(duì)比圖Fig.1 Comparison of separation efficiency of extraction column

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)清洗劑的清洗效果圖Fig.2 Cleaning effect chart of different concentrations of cleaning agent

圖3 麥芽五糖至七糖混合標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品清洗液和標(biāo)準(zhǔn)品萃取濾液色譜圖Fig.3 Chromatographic charts of maltopentose-heptasaccharide mixed standard，standard cleaning solution and standard extraction filter

2.1.3 洗脫用量 參考已有文獻(xiàn)[26]，本試驗(yàn)選擇50%乙醇溶液作為洗脫劑，考察不同體積（5，10，15，20，25，30 mL）乙醇對(duì)寡糖的洗脫情況。取1 g果葡糖漿，平行稱取5 份，分別加入10 mL 水溶解后注入固相萃取柱，用25 mL 體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液清洗，棄清洗液，分別用5，10，15，20 mL和25 mL 50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至干，分別向殘?jiān)屑?00 μL 水復(fù)溶，按1.3.3節(jié)方法進(jìn)行薄層層析，按1.3.4 節(jié)方法進(jìn)行灰度分析，結(jié)果見圖4。隨著洗脫劑體積增加，目標(biāo)寡糖的灰度值逐漸增大，在體積20 mL 時(shí)達(dá)到最大值，這說明隨著洗脫劑體積的增加，保留在萃取柱中的目標(biāo)物逐漸被洗脫下來，當(dāng)洗脫劑體積增至20 mL 時(shí)，目標(biāo)物被完全洗脫，因此選用20 mL 50%乙醇溶液洗脫。

2.2 薄層色譜展開劑

比較各種展開劑的展開效果，結(jié)果見表1。4種展開劑的展開效果均不理想，分析認(rèn)為果葡糖漿中含有多種聚合度寡糖，一次展層不能很好地將各種聚合度的寡糖有效分離，而采用多次展層的方法可解決這一問題。參照文獻(xiàn)[22]，采用二次展開法，以乙酸-乙酸乙酯-蒸餾水（體積比2∶2∶1.4）和乙酸-乙酸乙酯-蒸餾水 （體積比2∶2.6∶1.4）為展開劑，結(jié)果見圖5。寡糖斑點(diǎn)清晰，無拖尾現(xiàn)象，相鄰斑點(diǎn)之間分離度較好，摻假蜂蜜中不同聚合度的寡糖都得到較好分離，這便于摻假定性和定量檢測(cè)試驗(yàn)。

圖4 不同用量洗脫劑的洗脫效果圖Fig.4 Elution effect diagram of eluent with different dosage

表1 不同展開劑的展開效果Table 1 Separation effectiveness of different developing solvents

2.3 摻假定性分析

天然蜂蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜經(jīng)固相萃取凈化后，與標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣于同一薄層板上，經(jīng)展開、顯色、掃描，用Image J 和Sorbfil 兩種軟件分析TLC圖像，結(jié)果分別見圖6和圖7。在摻假蜂蜜色譜圖中可清晰地觀察到五糖以上的寡糖色譜峰，而經(jīng)凈化的天然蜂蜜色譜圖中只有麥芽三糖和麥芽四糖色譜峰，這與王瑞忠等[26]的研究結(jié)果相似。兩種軟件均可用于蜂蜜的摻假分析。Sorbfil 是用于TLC 圖像分析的專用軟件，該軟件可根據(jù)薄層板中的寡糖條帶繪制出相應(yīng)的色譜圖，每個(gè)寡糖條帶對(duì)應(yīng)一個(gè)色譜峰。色譜圖的縱坐標(biāo)為不同寡糖條帶的Rf值，橫坐標(biāo)為峰面積。與Image J 相比，Sorbfil 軟件可直接獲得不同寡糖的Rf值，并且蜂蜜樣品與標(biāo)準(zhǔn)品可通過軟件自動(dòng)繪制在同一張圖中，這有利于與標(biāo)準(zhǔn)品直接對(duì)比來鑒別蜂蜜真假。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取1.3.1 節(jié)中質(zhì)量濃度1.0～5.0 mg/mL 范圍的麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3 節(jié)方法展開并顯色，按1.3.4 節(jié)條件掃描，分別用Image J 和Sorbfil 兩種軟件分析。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度x（mg/mL）為橫坐標(biāo)，分別以灰度值y 和峰面積y 為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由兩種軟件所得相關(guān)系數(shù)分別為0.9946和0.9948，表明麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0～5.0 mg/mL 范圍，兩種方法都有良好的線性關(guān)系。

2.5 檢測(cè)限和定量限

圖5 寡糖分離的薄層色譜圖Fig.5 TLC of oligosaccharide separation

圖6 真假蜂蜜寡糖檢測(cè)的色譜圖（Image J）Fig.6 Chromatogram for detection of oligosaccharides in true and false honey （Image J）

圖7 真假蜂蜜寡糖檢測(cè)的色譜圖（Sorbfil）Fig.7 Chromatogram for detection of oligosaccharides in true and false honey （Sorbfil）

取1.3.1 節(jié)質(zhì)量濃度0.1～0.9 mg/mL 范圍的麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3 節(jié)條件展開顯色，按1.3.4 節(jié)條件掃描，分別用Image J 和Sorbfil 兩種軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)分別為0.9988和0.9968。根據(jù)3 SD/S 和10 SD/S 計(jì)算LOD 和LOQ，其中SD 是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S 是斜率[30]。用Image J 和Sorbfil 兩種軟件所得麥芽七糖的檢出限分別為0.037 mg/mL 和0.061 mg/mL，定量限分別為0.11 mg/mL 和0.19 mg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)包括同板精密度和異板精密度，分別取2，3，4 mg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度水平的麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同板精密度為同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.3 節(jié)條件在同一板上點(diǎn)5 個(gè)樣，展開。異板精密度為同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在5 塊板上點(diǎn)樣，展開，顯色后掃描，用兩種軟件分析，計(jì)算精密度，結(jié)果見表2。Image J 軟件同板、異板精密度試驗(yàn)的灰度值RSD 范圍（n=5）分別為1.44%～1.62%和2.89%～3.01%，Sorbfil 軟件同板、異板精密度試驗(yàn)的峰面積RSD 范圍（n=5）分別為2.39%～3.31%和3.65%～4.71%，說明兩種方法均有良好的精密度，同板比異板精密度更好。

表2 同板和異板精密度Table 2 Precision of same plate and different plate

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取3 份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的摻假蜂蜜樣品和1 g 果葡糖漿樣品，經(jīng)SPE 凈化、薄層色譜分離、掃描儀掃描（圖8），分別用Image J 和Sorbfil 兩種軟件分析。采用2.4 節(jié)麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算摻假蜂蜜和果葡糖漿中的麥芽七糖含量，計(jì)算果葡糖漿回收率，結(jié)果見表3。Image J 和Sorbfil 所得回收率的RSD 范圍分別為6.13%和3.08%，表明兩種方法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1 份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的摻假樣品溶液，經(jīng)SPE 凈化、薄層色譜分離、掃描儀每隔10 min（0～50 min）掃描一次得到圖像，用Image J 和Sorbfil兩種軟件分析，考察穩(wěn)定性。由Image J 軟件所得七糖灰度值的RSD（n=5）為0.73%，由Sorbfil 軟件所得七糖峰面積的RSD（n=5）為2.80%，表明兩種方法穩(wěn)定性良好。

2.9 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取2 g 質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～40%范圍的摻假樣品，溶于10 mL 水，經(jīng)SPE 凈化、薄層色譜分離、掃描儀掃描，分別用Image J 和Sorbfil 兩種軟件分析。每個(gè)樣品重復(fù)分析3 次，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。兩種圖像分析軟件所得樣品的平均回收率分別為98.56%和101.20%。

圖8 重復(fù)性試驗(yàn)薄層色譜圖Fig.8 TLC of repeated experimental

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（%）Table 3 Repeated experimental results （%）

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）Table 4 The experimental results of recovery rate of standard addition （%）

2.10 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

采集多個(gè)市售蜂蜜樣品，按1.3.2 節(jié)條件富集寡糖，按1.3.3 節(jié)層析條件分離后顯色，薄層層析結(jié)果見圖9。按1.3.4 節(jié)條件掃描薄層板，分別用Image J 和Sorbfil 兩種軟件對(duì)市售蜂蜜樣品進(jìn)行定性和定量分析，見圖10和圖11。部分樣品存在聚合度五以上的寡糖，表明這些樣品中摻有糖漿類物質(zhì)。4 種市售蜂蜜中的七糖含量見表5。

圖9 市售蜂蜜樣品薄層色譜圖Fig.9 TLC of honey samples on sale

3 結(jié)論

蜂蜜被摻入果葡糖漿后，利用固相萃取法富集較高聚合度的寡糖，薄層色譜法分離寡糖，并結(jié)合Image J 和Sorbfil 圖像分析軟件檢測(cè)。對(duì)比蜂蜜樣品與麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖發(fā)現(xiàn)，天然蜂蜜中沒有聚合度五以上的寡糖色譜峰，而摻入果葡糖漿的蜂蜜中可檢出五糖以上的寡糖色譜峰。用麥芽七糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，由兩種軟件所得相關(guān)系數(shù)分別為0.9946 和0.9948，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～40%的摻假范圍，平均回收率為98.56%和101.20%，說明兩種軟件均可對(duì)摻假蜂蜜準(zhǔn)確定量。Image J 和Sorbfil 兩種軟件所得麥芽七糖的檢出限分別為0.037 mg/mL 和0.061 mg/mL，定量限分別為0.11 mg/mL 和0.19 mg/mL。兩種方法均具有良好的精密度和穩(wěn)定性。

圖10 市售蜂蜜樣品色譜圖（Image J）Fig.10 Chromatogram of honey samples on the market （Image J）

圖11 市售蜂蜜樣品色譜圖（Sorbfil）Fig.11 Chromatogram of honey samples on the market（Sorbfil）

表5 市售蜂蜜中七糖的含量Table 5 Contents of heptasaccharide in honey on the market

本研究以聚合度五以上寡糖為標(biāo)記物來鑒別蜂蜜真?zhèn)?，通過優(yōu)化試驗(yàn)條件提高了薄層色譜法檢測(cè)蜂蜜的靈敏度，結(jié)合圖像分析軟件實(shí)現(xiàn)了對(duì)果葡糖漿的定量分析。該方法檢測(cè)成本低，無需昂貴儀器，適用于小型工廠和地方檢測(cè)機(jī)構(gòu)。