高吸附鉛乳酸菌的微膠囊化及特性

董 陽(yáng)，賀佳鑫，顧 悅，賀銀鳳

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特 010018）

重金屬污染對(duì)環(huán)境和人體健康會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重危害，其中鉛作為工業(yè)生產(chǎn)的重要原料和廢棄物，所造成的污染和危害更是長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)被廣泛關(guān)注[1-7]。鉛在體內(nèi)主要與含巰基（-SH）的蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制含巰基酶的活性，進(jìn)而引起貧血等疾病[4]。同時(shí)，鉛還可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮毒性作用，造成大腦不可逆的損傷[5-6]，也會(huì)引起氧化應(yīng)激對(duì)人體產(chǎn)生危害[7]。

生物修復(fù)是安全、高效解決重金屬損害的新興方法，是目前研究的熱點(diǎn)。Tian 等[8]用篩選出的具有高吸附鉛能力的植物乳桿菌CCFM8661 飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)該菌不僅通過(guò)對(duì)鉛的吸附作用減輕攝入體內(nèi)的鉛產(chǎn)生的危害，還緩解鉛暴露導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。Fatemeh[9]從伊朗東北部農(nóng)田土壤中分離到的原生細(xì)菌FM01 對(duì)鎳和鉛有很好的吸附效果。Ma 等[10]改造出具有合成生物源細(xì)胞內(nèi)碳酸鈣礦物支架的釀酒酵母，對(duì)鉛的吸附量可達(dá)116.69 mg/g。而乳酸菌也可通過(guò)離子交換、表面絡(luò)合、無(wú)機(jī)微沉淀等方式吸附重金屬。乳酸菌雖可高效去除重金屬鉛，但在貯藏、發(fā)酵過(guò)程中易受到各種環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致活菌數(shù)量下降，最終攝入腸道內(nèi)的活菌數(shù)過(guò)低，無(wú)法發(fā)揮其益生作用，而且吸附重金屬鉛的能力也無(wú)法保證。微膠囊化的乳酸菌能夠提高菌株的耐酸、耐高溫和耐貯藏性能等[11-12]。通過(guò)微膠囊技術(shù)，減少貯藏和胃腸道環(huán)境對(duì)具有重金屬吸附能力的乳酸菌產(chǎn)生的不良影響，提高乳酸菌在不良環(huán)境中的存活率，有效提高乳酸菌的活菌數(shù)[11-14]。

影響乳酸菌微膠囊化的因素較多，如制備方法、壁材等。常用的微膠囊化方法有：擠壓法、乳化法及噴霧干燥法，不同方法所得微膠囊的包埋率有差異。陽(yáng)暉[15]比較了內(nèi)源乳化法和外源乳化法對(duì)嗜酸乳桿菌的包埋效果，內(nèi)源乳化法的包埋率比外源乳化法高出11.2%，而且微膠囊的形態(tài)更好，粒徑分布范圍更窄。王偉潔等[16]采用內(nèi)源乳化法，以海藻酸鈉和果膠為復(fù)合壁材包埋保加利亞乳桿菌，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化包埋工藝條件，使微膠囊的包埋率達(dá)到91.8%。常用的包埋壁材有膠質(zhì)壁材、蛋白壁材和油脂壁材[17]。羅紅霞等[18]以乳清蛋白和明膠為壁材，利用噴霧干燥法制成植物乳桿菌微膠囊，通過(guò)對(duì)壁材配比、壁材添加量、進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料量4 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，微膠囊的包埋率達(dá)到62.15%。Wang 等[19]用植酸鈉和殼聚糖逐層包埋戊糖乳桿菌，兩種微膠囊經(jīng)模擬胃腸液消化120 min 和4%膽鹽消化3 h 后，雙層包埋的戊糖乳桿菌活菌數(shù)比僅用植酸鈉包埋的提高3.76 lg（CFU/mL），而且耐受熱處理的能力也更好。鄒強(qiáng)[20]分別以大豆蛋白、乳清蛋白、酪蛋白和明膠為壁材，包埋兩歧雙歧桿菌（B.Bifidum）F-35，并分別在不含胃蛋白酶以及含胃蛋白酶的模擬胃液中處理120 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 種壁材都能在不含胃蛋白酶的模擬胃液中顯著提高被包埋菌的存活率，然而，胃蛋白酶的水解作用會(huì)大大削減蛋白質(zhì)壁材的保護(hù)作用。探究不同包埋條件，對(duì)于提高菌株的包埋率具有重要的意義。

本試驗(yàn)中以前期從包鋼礦區(qū)的羊糞中分離篩選的1 株具有高耐受和吸附重金屬鉛能力的戊糖片球菌10-a-1 為對(duì)象，采用內(nèi)源乳化法，以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材，制得戊糖片球菌10-a-1 微膠囊，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件。通過(guò)微膠囊在連續(xù)模擬胃腸液中的存活試驗(yàn)，微膠囊在體外吸附鉛試驗(yàn)和微膠囊的貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)，探究微膠囊化對(duì)戊糖片球菌10-a-1的保護(hù)效果以及微膠囊技術(shù)對(duì)經(jīng)模擬胃腸液處理的戊糖片球菌10-a-1 吸附鉛的影響，旨在為提高具有生物活性菌株的環(huán)境耐受能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：戊糖片球菌 （Pediococcus pentosaceus）10-a-1 分離篩選自包鋼礦區(qū)羊糞，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供。

試劑：海藻酸鈉、殼聚糖、胃蛋白酶，Solarbio公司；胰蛋白酶，Sigma 公司；牛膽鹽，廣東環(huán)凱微生物有限公司；冰醋酸、碳酸鈣，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂、氯化鈉、MRS 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液。試驗(yàn)用試劑均為分析純級(jí)。

主要溶液的配制：

1）模擬胃液（Simulated gastric juice，SGJ）[21]：NaCl 0.2 g，胃蛋白酶3 g，蒸餾水100 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2.0，用0.22 μm 水系濾菌器過(guò)濾除菌。

2）模擬腸液（Simulated intestinal juice，SIJ）[22]：NaH2PO41.2 g，胰蛋白酶0.1 g，膽鹽0.45 g，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至7.4，0.22 μm 水系濾菌器過(guò)濾除菌。

3）殼聚糖溶液（0.4%）：將4.00 g 殼聚糖溶解于950 mL 0.1 mol/L 醋酸溶液中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至6.0，中速濾紙過(guò)濾后定容1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器，上海禾穎儀器有限公司；顯微圖像分析設(shè)備，德國(guó)LEICA 公司；火焰原子吸收光譜儀，北京普析通用儀器有限公司；酶標(biāo)儀，上海賽默飛世爾儀器有限公司；深孔板高速振搖培養(yǎng)箱，日本TAITEC 公司；真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Laconco 公司；高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液制備 將活化至3 代的菌液于4 000 r/min，-4 ℃條件下離心10 min，得到的菌泥用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次，重懸于無(wú)菌生理鹽水中。調(diào)整菌懸液濃度，將菌懸液中活菌數(shù)控制在109CFU/mL（OD595nm值約1.5）。

1.3.2 內(nèi)源乳化法制備海藻酸鈉乳酸菌10-a-1微膠囊 參照Poncelet 等[23]的方法，初始制備條件為：海藻酸鈉在菌膠混合物中含量為3.0%，碳酸鈣和海藻酸鈉質(zhì)量比1.5∶9，冰醋酸和碳酸鈣物質(zhì)的量之比6∶1，水相（菌膠混合物）與油相體積比30∶70。

1.3.3 乳酸菌微膠囊包埋率的計(jì)算 取1.0 g 微膠囊，于9 mL 不加膽鹽的人工腸液中，37 ℃，100 r/min 條件下溫育2 h，取出，測(cè)活菌數(shù)。

1.3.4 單層海藻酸鈉微膠囊包埋工藝的優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

1）按照1.3.2 節(jié)方法，控制其它因素不變的條件下，調(diào)整海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%，2.0%，2.5%，3.0%和3.5%，制備微膠囊，考察不同海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊包埋率和粒徑的影響。

2）按照1.3.2 節(jié)方法，控制其它因素不變的條件下，調(diào)整冰醋酸和碳酸鈣物質(zhì)的量之比分別為2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，制備微膠囊，考察不同酸鈣比對(duì)微膠囊包埋率和粒徑的影響。

3）按照1.3.2 節(jié)方法，控制其它因素不變的條件下，調(diào)整乳化過(guò)程中攪拌速度分別為150，300，450，600，750 r/min，制備微膠囊，考察不同轉(zhuǎn)速對(duì)微膠囊包埋率和粒徑的影響。

4）按照1.3.2 節(jié)方法，控制其它因素不變的條件下，調(diào)整水相和油相體積之比分別為30∶45，30∶70，30∶95，30∶120，30∶145，制備微膠囊，考察不同水油比對(duì)微膠囊包埋率和粒徑的影響。

5）按照1.3.2 節(jié)方法，控制其它因素不變的條件下，調(diào)整碳酸鈣和海藻酸鈉質(zhì)量之比分別為1∶9，1.5∶9，2∶9，2.5∶9，3∶9，制備微膠囊，考察不同鈣膠比對(duì)微膠囊包埋率和粒徑的影響。

1.3.4.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酸鈣比、轉(zhuǎn)速、水油比和鈣膠比進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，以包埋率為主要指標(biāo)，確定海藻酸鈉乳酸菌微膠囊最佳工藝條件。

1.3.5 海藻酸鈉-殼聚糖雙層微膠囊的制備 參照Nualkaekul 等[24]的方法，按照每100 mL 0.4%殼聚糖溶液中加15 g 微膠囊的比例，將濕微膠囊加入殼聚糖溶液中，100 r/min 攪拌40 min，離心收集微膠囊，洗滌2 次。

1.3.6 海藻酸鈉微膠囊及海藻酸鈉-殼聚糖雙層微膠囊的特性比較

1.3.6.1 乳酸菌微膠囊形態(tài)觀察和粒徑測(cè)定 在載玻片上滴1 滴亞甲基藍(lán)溶液，將微膠囊分散于染液中，蓋上蓋玻片，用Leica-DM4000B 顯微照相設(shè)備觀察微膠囊形態(tài)并拍照。隨機(jī)選取50 個(gè)微膠囊測(cè)量粒徑。

1.3.6.2 微膠囊化乳酸菌10-a-1 在連續(xù)模擬胃腸液中的存活試驗(yàn) 參照Annan 等[21]的方法，稱取兩種微膠囊各1.0 g 或未微膠囊化菌懸液1 mL，加入9 mL 人工胃液中，37，100 r/min 條件下溫育2 h，分別取0，1 h 和2 h 的樣液，用不加膽鹽的人工腸液稀釋并裂解90 min，測(cè)活菌數(shù)，計(jì)算存活率。取人工胃液中溫育2 h 后的樣液，振蕩混勻，吸取1 mL 加入9 mL 人工腸液中，相同條件下溫育4 h，取0，2 h 和4 h 樣液，用不加膽鹽的人工腸液稀釋并裂解，測(cè)活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3.6.3 微膠囊化乳酸菌10-a-1 在模擬腸液中的釋放 參照Mi 等[25]的方法，考察乳酸菌10-a-1海藻酸鈉微膠囊和海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊在模擬腸液中的釋放情況。稱取1.00 g 微膠囊，加入9 mL 人工腸液中，37 ℃、100 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，分別取0，30，60，90 min 和120 min 的樣液測(cè)活菌數(shù)。

1.3.6.4 微膠囊化乳酸菌10-a-1 在模擬腸道環(huán)境作用下對(duì)鉛的吸附 參考李暢[26]的方法，將海藻酸鈉微膠囊和海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊分別按照1 g∶9 mL 的比例加入人工胃液中，37 ℃、100 r/min 條件下溫育2 h。在12 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，棄上清后稱重，按照1 g∶9 mL 的比例加入人工腸液，在37 ℃、100 r/min 條件下溫育4 h，12 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，收集菌體。收集的菌泥用超純水洗滌3 次、稱重，加入超純水重懸，制成菌質(zhì)量濃度為50 g/L 的濃縮菌懸液。取48 孔方形深孔板，每孔加入1.4 mL 50 mg/L鉛溶液（pH 6.0），加入濃縮菌懸液，使菌體質(zhì)量濃度達(dá)到5 g/L。將深孔板放入深孔搖床培養(yǎng)器中，37 ℃、800 r/min 振蕩培養(yǎng)2 h 取出，14 000 r/min離心10 min，取上清液，用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)鉛含量，計(jì)算吸附率和單位菌體鉛吸附量。同時(shí)以未微膠囊化的乳酸菌10-a-1 作對(duì)照。吸附率和吸附量計(jì)算公式如下：

式中：m0——吸附前鉛溶液中鉛離子含量，mg；m1——吸附后溶液中鉛離子含量，mg；m——菌體含量，g。

1.3.6.5 乳酸菌10-a-1 微膠囊的貯藏穩(wěn)定性 將兩種微膠囊和未微膠囊化菌懸液分別貯藏于4 ℃和20 ℃條件下，分別于7，14，21 d 和28 d 取出，在不加膽鹽的人工腸液中裂解后測(cè)活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0 軟件，做平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、One-way ANOVA 顯著性分析（P<0.05）和正交試驗(yàn)結(jié)果分析，采用Origin 8.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊包埋工藝條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 包埋率和粒徑分布是評(píng)價(jià)乳酸菌微膠囊包埋效果的重要參數(shù)。不同工藝條件對(duì)海藻酸鈉微膠囊包埋率和粒徑的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同工藝條件對(duì)海藻酸鈉微膠囊包埋率和粒徑的影響Fig.1 Effect of different technological conditions on the embedding rate and particle size of sodium alginate microcapsules

由圖1a 可知，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于2.5%時(shí)，微膠囊包埋率隨海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加；海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，3.0%和3.5%時(shí)，微膠囊的包埋率顯著高于1.5%和2.0%時(shí)的。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在一個(gè)比較低的范圍時(shí)，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，交聯(lián)形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越緊密，因而能夠?qū)⒏嗟娜樗峋谖⒛z囊中。然而，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)2.5%后，繼續(xù)增加海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，微膠囊的包埋率并沒(méi)有明顯變化，反而給包埋的操作造成困難。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)3.5%時(shí)，菌膠混合物的黏稠度非常高，磁力攪拌器轉(zhuǎn)子難以將菌膠混合物均勻分散開(kāi)，導(dǎo)致乳化過(guò)程非常困難，微膠囊包埋率有所降低。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)3.5%時(shí)，微膠囊粒徑顯著增加，平均達(dá)（207.84±9.33）μm，同時(shí)粒徑分布更加不均勻。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%時(shí)，包埋的效果最好，此時(shí)微膠囊的包埋率為（61.30±1.92）%，平均粒徑為（150.16±3.18）μm。

由圖1b 可知，隨著酸鈣比的增加，微膠囊的包埋率先增大后減小，酸鈣比在3∶1，4∶1 和5∶1時(shí)的包埋率顯著高于酸鈣比2∶1 和6∶1 的。微膠囊的粒徑逐漸減小。由CaCO3+2CH3COOH=Ca2++2CH3COO-+H2O+CO2↑反應(yīng)可知，每2 mol 冰醋酸，理論上可與1 mol 碳酸鈣反應(yīng)。而在實(shí)際的內(nèi)源乳化法操作中，冰醋酸在從油相擴(kuò)散，進(jìn)入微膠囊的過(guò)程中會(huì)有部分損失，因此實(shí)際上合適的酸鈣比應(yīng)大于2∶1。酸鈣比過(guò)小時(shí)，碳酸鈣不能被充分解離，形成的膠體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)薄弱，包埋數(shù)量減少，微膠囊質(zhì)地不均勻，粒徑偏大。酸鈣比過(guò)高時(shí)，酸也會(huì)對(duì)乳酸菌造成脅迫，降低包埋率。當(dāng)酸鈣比為3∶1 時(shí)包埋效果最好，包埋率達(dá)到（88.43±3.99）%，平均粒徑為（201.92±16.53）μm。屈方寧[27]通過(guò)內(nèi)源乳化法制備海藻酸鈉植物乳桿菌微膠囊，研究了酸鈣比和酸化時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)微膠囊的保護(hù)效果和質(zhì)構(gòu)特性的影響，發(fā)現(xiàn)酸化環(huán)節(jié)對(duì)微膠囊的包埋率、粒徑大小和物理特性有顯著影響，并且酸鈣比的增加和酸化時(shí)間的延長(zhǎng)都可使微膠囊機(jī)械強(qiáng)度增加，粒徑減小，在模擬胃液和膽鹽中的收縮比、溶脹比減小。

由圖1c 可知，隨著轉(zhuǎn)速增加，微膠囊的包埋率先增大后減小，轉(zhuǎn)速300，450，600 r/min 時(shí)的包埋率顯著高于150 r/min 和750 r/min 時(shí)的。粒徑在逐漸減小。乳化過(guò)程中的攪拌速度影響菌膠混合物小液滴的形成。如果速度過(guò)小，導(dǎo)致乳化不充分，形成的微膠囊形狀不均勻，而且粒徑大、包埋率低。隨著轉(zhuǎn)速增大，微膠囊的粒徑減小，外觀質(zhì)地越來(lái)越緊密。然而，過(guò)大的轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力也會(huì)造成菌體死亡，降低包埋率。當(dāng)轉(zhuǎn)速為600 r/min時(shí)包埋效果最好，包埋率為（64.57±5.51）%，此時(shí)平均粒徑為（135.21±4.76）μm。

由圖1d 可知，隨著水油比的減小，微膠囊的包埋率先上升后下降，粒徑在水油比達(dá)30∶95 后明顯減小。水油比較大時(shí)，單位體積油相中需乳化的菌膠混合物多，不利于充分乳化，形成的微膠囊粒徑偏大，包埋率較低。水油比減小后，菌膠混合物在油相中有更大的空間進(jìn)行乳化，形成更小的液滴，液滴固化后形成的微膠囊粒徑也小。水油比30∶120 時(shí)的包埋率（85.33±1.92）%顯著高于其它比例的，且粒徑分布比較均一。

由圖1e 可知，隨著鈣膠比增加，微膠囊的包埋率先增后減，在鈣膠比3∶9 時(shí)顯著下降，粒徑先減小后上升。碳酸鈣和海藻酸鈉的比例對(duì)海藻酸鈣的交聯(lián)產(chǎn)生很大影響，進(jìn)而影響微膠囊的性質(zhì)。在一定范圍增加碳酸鈣的用量可使海藻酸鈉和鈣離子得到充分的交聯(lián)，從而形成結(jié)構(gòu)和質(zhì)地更加緊密的微膠囊，且微膠囊的包埋率更大、粒徑更小。如繼續(xù)增加碳酸鈣的用量，則過(guò)量的碳酸鈣不能被解離和交聯(lián)而滯留在微膠囊內(nèi)部，導(dǎo)致微膠囊粒徑增加，分布不均勻。鈣膠比1.5∶9 時(shí)，微膠囊包埋率達(dá)到最大值（60.83±3.30）%，同時(shí)粒徑分布較均一。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，將海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為3.0%，選擇水油比（V/V）、酸鈣比（n/n）、轉(zhuǎn)速（r/min）和鈣膠比（m/m）4 個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3 個(gè)合適的水平，以微膠囊包埋率為指標(biāo)，做四因素三水平的正交試驗(yàn)，并從中選出最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平和結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

由表2可知，根據(jù)極差R 的大小，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響排序?yàn)椋核捅龋ˋ）>酸鈣比（B）>轉(zhuǎn)速（C）>鈣膠比（D），4 個(gè)因素中對(duì)包埋率影響最大的是水油比，其次分別是酸鈣比、轉(zhuǎn)速，影響最小的是鈣膠比。在9 組試驗(yàn)中包埋率最高的是第2組A2B1C2D2，具體條件是水油比30∶120、酸鈣比2∶1、轉(zhuǎn)速600 r/min、鈣膠比1.5∶9，此時(shí)包埋率為82.10%。

上述結(jié)果還需要驗(yàn)證。選取條件水油比30∶120、酸鈣比3∶1、攪拌速度600 r/min、鈣膠比1.5∶9，即A2B2C2D2組合進(jìn)行驗(yàn)證。在A2B2C2D2組合條件下，包埋率為 （87.20±1.60）%，高于組合A2B1C2D2。最終最優(yōu)工藝條件中酸鈣比選擇3∶1，然后采用最優(yōu)工藝條件制備微膠囊。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

2.2 海藻酸鈉微膠囊及海藻酸鈉-殼聚糖雙層微膠囊的特性比較

2.2.1 乳酸菌微膠囊形態(tài)觀察 從圖2a 可看出，在光學(xué)顯微鏡下，海藻酸鈉微膠囊形態(tài)均勻、邊界清晰，沒(méi)有相互黏結(jié)的現(xiàn)象，經(jīng)亞甲藍(lán)染色后呈現(xiàn)藍(lán)紫色。僅用海藻酸鈉作壁材的微膠囊存在孔徑大、耐酸性不好的缺點(diǎn)。采用殼聚糖給海藻酸鈉微膠囊進(jìn)行二次包埋，利用殼聚糖的耐酸性提高微膠囊在胃腸液中對(duì)被包埋菌的保護(hù)能力。海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)如圖2b 所示。雙層微膠囊形態(tài)比較規(guī)則，邊界清晰、互不粘連，而粒徑分布比單層微膠囊更寬。

2.2.2 乳酸菌微膠囊的粒徑分布及包埋率 按最優(yōu)工藝條件制備的海藻酸鈉微膠囊與海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊的包埋率和粒徑如表3所示。

圖2 乳酸菌微膠囊形態(tài)Fig.2 Morphology of lactic acid bacteria microcapsules

表3 海藻酸鈉微膠囊和海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊的包埋率和粒徑Table 3 Microencapsulation rate and particle size of sodium alginate microcapsules and sodium alginatechitosan microcapsules

與海藻酸鈉微膠囊相比，海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊的包埋率有所下降，可能是因?yàn)槎伟襁^(guò)程中損失部分的微膠囊，造成菌體的泄露。同時(shí)，雙層包埋使微膠囊的平均粒徑增加了46.63 μm。王慶衛(wèi)[12]在采用內(nèi)源乳化法包埋的海藻酸鈉兩歧雙歧桿菌微膠囊的基礎(chǔ)上，分別用殼聚糖、乳清蛋白和海藻酸鈉3 種材料進(jìn)行2 次包埋。得到3 種雙層微膠囊，包埋率均從單層時(shí)的90%左右降至50%左右，粒徑也增加了10～56 μm，其中海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊的粒徑從平均116.0 μm 增到155.5 μm。

2.2.3 微膠囊化乳酸菌10-a-1 在連續(xù)模擬胃腸液中的存活試驗(yàn) 兩種微膠囊化和未微膠囊化的戊糖片球菌10-a-1 在連續(xù)模擬胃腸液中隨時(shí)間變化的存活率如圖3所示。

由圖3可知，兩種微膠囊和菌懸液在模擬胃液中處理60 min 時(shí)，存活率下降最快，而在模擬腸液中存活率的下降相對(duì)緩慢。海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊在模擬胃液和模擬腸液中存活率的下降都是三者中最平緩的，最終存活率達(dá)（76.91±1.94）%。未微膠囊化的菌懸液下降得最快，最終存活率僅（10.83±0.99）%。說(shuō)明兩種微膠囊均能有效降低被包埋菌受胃腸道極端環(huán)境的影響，其中，海藻酸鈉-殼聚糖的保護(hù)效果比單層的海藻酸鈉微膠囊更顯著。常柳依等[28]在海藻酸鈉微膠囊的基礎(chǔ)上用殼聚糖進(jìn)行二次包埋，雙層包埋的微膠囊在模擬胃液中處理120 min 后，被包埋的長(zhǎng)雙歧桿菌減少量比單層微膠囊低1 個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明海藻酸鈉雖然能幫助戊糖片球菌10-a-1 抵抗胃腸道中低pH 值和含有膽鹽的不良環(huán)境，但是海藻酸鈉微膠囊的耐酸性還不夠理想。通過(guò)殼聚糖的二次包埋，雙層微膠囊的耐酸性有了明顯提高，胃液處理120 min 后，雙層微膠囊存活率是（83.40±1.38）%，而海藻酸鈉微膠囊的存活率是（59.13±1.89）%，說(shuō)明殼聚糖雙層微膠囊對(duì)耐酸性的提高有顯著效果。

2.2.4 乳酸菌微膠囊在模擬腸液中的釋放 微膠囊在模擬腸液中的釋放性是評(píng)估微膠囊能否在腸道內(nèi)定點(diǎn)釋放的指標(biāo)。海藻酸鈉微膠囊和海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊在模擬腸液中的釋放情況如圖4所示。

圖3 微膠囊化和未微膠囊化的戊糖片球菌10-a-1在連續(xù)模擬胃腸液中的存活率Fig.3 Livability of free and microencapsulated Pediococcus pentosaceus 10-a-1 during sequential exposure to simulated gastric juice （SGJ）and simulated intestinal juice （SIJ）

圖4 海藻酸鈉微膠囊和海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊在模擬腸液中的釋放情況Fig.4 Release of sodium alginate microcapsules and sodium alginate-chitosan microcapsules in simulated intestinal juice （SIJ）

海藻酸鈉微膠囊在模擬腸液中釋放快，30 min 就釋放了（90.05±8.88）%，活菌數(shù)達(dá)到（8.57±0.04）lg（CFU/g）；而海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊在30 min 時(shí)釋放了（47.79±1.97）%，活菌數(shù)達(dá)到（8.23±0.01）lg（CFU/g）。兩種微膠囊在90 min 時(shí)活菌數(shù)都達(dá)到穩(wěn)定，基本釋放完全。海藻酸鈉微膠囊釋放率達(dá)到（98.86±6.00）%，海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊釋放率達(dá)（98.10±3.30）%。海藻酸鈉微膠囊最終釋放的活菌數(shù)是（8.62±0.05）lg（CFU/g），海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊最終釋放的活菌數(shù)是（8.55±0.01）lg（CFU/g）。

海藻酸鈣凝膠是可逆的。當(dāng)環(huán)境中存在磷酸根時(shí)，海藻酸鈣中的鈣離子會(huì)被磷酸根剝奪，造成海藻酸鈣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)裂解。殼聚糖和海藻酸鈣間通過(guò)靜電作用相互結(jié)合，因此雙層微膠囊的結(jié)構(gòu)更加緊密，導(dǎo)致裂解時(shí)間延長(zhǎng)也可以更有效地保護(hù)被包埋的乳酸菌。

2.2.5 經(jīng)模擬胃腸液處理的戊糖片球菌10-a-1微膠囊體外吸附鉛的能力 乳酸菌的菌體活性和菌體的預(yù)處理會(huì)影響其吸附重金屬的能力。連續(xù)模擬胃腸液處理對(duì)戊糖片球菌10-a-1 及其微膠囊吸附鉛能力的影響如表5所示。

連續(xù)模擬胃腸液處理對(duì)戊糖片球菌10-a-1及其微膠囊的鉛吸附效果有極顯著的影響。經(jīng)處理的戊糖片球菌10-a-1 在50 mg/L 鉛離子溶液中對(duì)鉛的吸附率和單位質(zhì)量濕菌泥的鉛吸附量明顯下降，說(shuō)明模擬胃腸液對(duì)戊糖片球菌10-a-1 的損傷會(huì)降低其吸附鉛的效果。這可能是因?yàn)榈蚿H值和含有膽鹽的模擬胃腸液對(duì)菌體表面的吸附位點(diǎn)和細(xì)胞壁肽聚糖層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響所致。經(jīng)胃腸液處理后，兩種微膠囊化的戊糖片球菌10-a-1 吸附能力雖然低于未經(jīng)模擬胃腸液處理的菌體，但是極顯著地高于未微膠囊化的菌體。這說(shuō)明通過(guò)微膠囊的保護(hù)，尤其是海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊在模擬胃液中更好的保護(hù)，可顯著降低戊糖片球菌10-a-1 吸附鉛能力的下降。

2.2.6 乳酸菌微膠囊貯藏穩(wěn)定性 兩種微膠囊化和未微膠囊化的戊糖片球菌10-a-1，在4 ℃和20℃下貯藏28 d，其存活率的變化情況如圖5所示。

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，菌懸液和微膠囊中的活菌數(shù)都顯著下降。由于包埋壁材對(duì)菌體有一定的保護(hù)作用，因此兩種微膠囊的活菌數(shù)降幅低于菌懸液。第28 天時(shí)，海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊的活菌數(shù)分別為4 ℃下的（7.88±0.88）lg（CFU/g）和20℃下的（7.59±0.05）lg（CFU/g）。明顯超過(guò)海藻酸鈉微膠囊在4 ℃下的（7.88±0.88）lg （CFU/g）和20 ℃下的（7.59±0.05）lg（CFU/g）。此時(shí)未微膠囊化的戊糖片球菌10-a-1 的活菌數(shù)在4 ℃下是（6.20±0.03）lg （CFU/g）、20 ℃下是（5.56±0.03）lg（CFU/g）。說(shuō)明雙層微膠囊在貯藏過(guò)程中對(duì)乳酸菌10-a-1 的保護(hù)效果要好于單層海藻酸鈉微膠囊。兩種微膠囊在經(jīng)過(guò)28 d 貯藏后，活菌數(shù)均保持在107CFU/g，只下降1 個(gè)數(shù)量級(jí)，而未微膠囊化的菌懸液下降3～4 個(gè)數(shù)量級(jí)。溫度在微膠囊保藏過(guò)程中對(duì)活菌數(shù)的影響也非常顯著，4 ℃下貯藏的兩種微膠囊28 d 時(shí)的存活率都顯著高于20 ℃下貯藏的微膠囊。

表4 微膠囊化戊糖片球菌10-a-1在模擬腸道環(huán)境作用下對(duì)鉛的吸附Table 4 The adsorption capacity of microencapsulated Pediococcus pentosaceus 10-a-1 to lead in simulated intestinal environment

圖5 戊糖片球菌10-a-1 微膠囊貯藏期間存活率變化Fig.5 Survival rate of Pediococcus pentosaceus 10-a-1 microcapsules during storage

3 結(jié)論

在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、水油比30∶120、酸鈣比3∶1、轉(zhuǎn)速600 r/min、鈣膠比1.5∶9 條件下制備海藻酸鈉微膠囊，包埋率達(dá)86.33%，平均粒徑139.03 μm。在此基礎(chǔ)上，用殼聚糖進(jìn)行二次包埋，得到的海藻酸鈉-殼聚糖雙層微膠囊包埋率為65.65%，粒徑185.66 μm。內(nèi)源乳化法制備的海藻酸鈉微膠囊和海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊，能有效提高戊糖片球菌10-a-1 抵御不良環(huán)境條件的影響，其中海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊對(duì)戊糖片球菌10-a-1 的保護(hù)效果更好。