基于分子對接的副溶血弧菌外膜蛋白OmpW天然抑制劑的篩選

劉雪飛，吳曉芳，祁 悅，張德福，謝 晶，牟偉麗，李學鵬*，勵建榮

（1 渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 上海海洋大學食品學院 上海201306 3 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺265600）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚貝類等海洋生物中，不僅引起水生動物的弧菌病，還是我國食源性疾病的首要致病菌之一[1-2]。在一些沿海城市，60%以上的細菌性食物中毒都是由該菌引起[3]。由于一些水產(chǎn)品經(jīng)高溫處理會失去其特有的風味，往往不經(jīng)熱處理直接生食，極大地增加引發(fā)食源性疾病的風險，因此研究以非加熱方式抑制副溶血弧菌是控制生食水產(chǎn)品引起食物中毒的關鍵[4]。目前，人們?yōu)榱藴p少和防止該菌在水產(chǎn)品中的污染，采取的主要措施是使用消毒劑與抗生素，這種做法存在明顯的弊端，例如：抗生素藥物殘留，細菌耐藥性的產(chǎn)生，破壞水生動物體內(nèi)微平衡以及免疫力[5]。研究發(fā)現(xiàn)，多種天然防腐劑具有顯著的抑菌活性，可代替化學合成的抑菌劑應用于食品工業(yè)中[6]。尋找并開發(fā)天然、綠色、高效的抑菌物質(zhì)越來越受到關注。

革蘭氏陰性細菌細胞結(jié)構(gòu)復雜，除了細胞質(zhì)膜，還有一層參與構(gòu)成細胞壁的外膜（Outer Membrane）。外膜蛋白（Outer Membrane Protein，OMP）是外膜的主要成分之一，由反向平行的β-折疊通過相鄰的氫鍵結(jié)合形成具有長而窄的疏水性通道的β-桶狀結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可促使外膜蛋白具有很強的穩(wěn)定性[7]?？缒さ摩?桶狀結(jié)構(gòu)蛋白通常作為轉(zhuǎn)運蛋白、通道蛋白，協(xié)助小分子物質(zhì)的進出[8]。有研究證實鮑曼不動桿菌外膜蛋白OmpW 是有效的藥物靶標[9]。副溶血弧菌外膜蛋白OmpC 是凡爾濱對蝦血藍蛋白LH75 產(chǎn)生抑菌作用的靶點之一[10]。張丹鳳[11]經(jīng)耐藥分析等試驗，證明大腸桿菌K-12 外膜蛋白TolC 不僅參與藥物的外排過程，還參與對外界抗生素的感應。

檸檬酸與咖啡酸均為天然小分子有機物，被廣泛應用在食品和醫(yī)藥工業(yè)上。檸檬酸對包括雷氏普羅維登菌[12]、嗜水氣單胞菌[13]和熒光假單胞菌[13]在內(nèi)的多種革蘭氏陰性菌有抑制作用?？Х人峒捌漉ヮ愌苌锍哂锌寡趸?、抗突變作用外，還可抑制大腸桿菌的生長[14]。國內(nèi)現(xiàn)有文獻多數(shù)是從抑制現(xiàn)象上篩選副溶血弧菌的抑菌劑，而很少從分子水平研究抑制作用發(fā)生的機理。開發(fā)作用于新靶點、具有抑菌新機制且綠色、安全的食源性致病菌抑菌劑迫在眉睫。

分子對接（Molecular Docking）是在Fisher 的受體學說的基礎上發(fā)展而來的一種利用計算機進行分子模擬的技術(shù)，對接時將小分子配體放入受體的活性位點，之后按照能量互補、幾何匹配及化學環(huán)境互補的原則，對配體與受體相互作用的好壞進行實時評價，找到配體與受體分子間最佳的結(jié)合模式（包括合理的位置與構(gòu)象），這在藥物設計上有非常重要的意義[15-16]。分子對接的基礎在于已知受體的三維結(jié)構(gòu)，然而，要獲得膜結(jié)合蛋白的晶體結(jié)構(gòu)十分困難，通過試驗方式獲得其三維結(jié)構(gòu)具有很大的局限性?，F(xiàn)階段科研領域廣泛使用的同源建模（Homology Modeling）是一種重要的預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的方法，該方法的基本原理即蛋白質(zhì)的序列同源性決定了蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源性，利用蛋白序列同源的已知結(jié)構(gòu)的蛋白作為模板可以構(gòu)建一個結(jié)構(gòu)未知的目標蛋白。

本文在上述理論基礎上，利用同源建模與分子對接構(gòu)建副溶血弧菌外膜蛋白OmpW 的三維結(jié)構(gòu)，確定活性部位作為靶標，與檸檬酸和咖啡酸等小分子天然物質(zhì)對接獲得相應的分數(shù)，并通過試驗研究兩種小分子對正常、去外膜、去壁（即原生質(zhì)體）這3 種狀態(tài)的副溶血弧菌的抑制效果，分析外膜蛋白OmpW 是否為檸檬酸和咖啡酸的作用位點，為篩選無毒、高效、綠色的抑菌劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖或生食海鮮新型調(diào)味品的開發(fā)提供參考，同時為尋找新的藥物靶點提供一定的理論依據(jù)。

表1 耐藥株的耐藥譜Table 1 Resistant spectrum of drug-resistant strains

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與試劑

副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）ATCC17802、ATCC33847、分離株1（分離自白蛤）、分離株2（分離自鮑魚）、耐藥株1（耐藥譜見表1）均為本實驗室保存。

3% NaCl APW 培養(yǎng)基、TCBS 培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌20 min。

Tris、檸檬酸、咖啡酸、EDTA、甘油，購于生工生物工程（上海）股份有限公司；蔗糖、MgCl2、馬來酸鹽、NaOH，購于天津市風船化學試劑科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4），購于武漢普賽諾生命科技有限公司；溶菌酶，購于合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

PL303 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHBJ-206 pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；GI54DS 高壓蒸汽滅菌鍋，南京智德豐科學儀器有限公司；ZD-85A 氣浴恒溫振蕩器，金壇市科技儀器有限公司；SPX-250 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；5804R 高速離心分離機，Eppendorf 中國有限公司；VICTORTM X3 微孔板讀數(shù)儀，珀金埃爾默儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 構(gòu)建副溶血弧菌外膜蛋白OmpW 的同源模型 副溶血弧菌外膜蛋白OmpW 的晶體結(jié)構(gòu)尚未有報道，其氨基酸序列（214aa，GI：1050211542）可以通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得，利用該序列在PDB 數(shù)據(jù)庫（http.//www.crsb.org）高級檢索的BLAST 找到與之序列相似度最高的蛋白質(zhì)，以該蛋白為模板，用SWISS MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建模擬的三維模型，建模結(jié)果用ULCA（http：//servicesn.mbi.ucla.edu/）進行評估。

1.3.2 靶標的確定與分子對接 以模擬的外膜蛋白OmpW 模型作為靶標，用分子模擬軟件Discovery Studio 2017R2 處理該蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，包括去除水分子、加極性氫原子、能量最小化、構(gòu)象最優(yōu)化等。根據(jù)之前報道過的蛋白活性位點信息確定活性位點，為后續(xù)分子對接做準備。自Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載小分 子結(jié)構(gòu)，利用DS 軟件進行分子對接，得出相應的能量信息和打分函數(shù)。打分越高說明受體與配體的相互作用可能越強，可能產(chǎn)生的抑制作用也就越強。

1.3.3 菌種活化及處理 將試驗菌株分別接種于3% NaCl APW 中，振蕩培養(yǎng)12～18 h，重復傳代2次。

參考Xu 等[17]的方法進行菌種處理。將活化的菌液于4 ℃4 000 g 離心10 min 收獲菌體，棄上清液，沉淀用0.01 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液（pH 7.0）離心洗滌，重復2 次，棄上清液，加入高滲Tris-HCl 緩沖液（pH 7.0）30 mL 使細胞重懸，再加入EDTA 溶液（pH 8.0），使其終濃度為0.01 mol/L，注意滴加的速度，讓整個滴加時間控制在20 min 左右。將離心管放入恒溫振蕩器中于37 ℃100 r/min 振蕩20 min，除去副溶血弧菌的外膜層，將1 支離心管置于4 ℃冰箱中，待用。

另一支離心管置于4 ℃ 3 000 g 離心10 min，棄上清液，沉淀用SMM 緩沖液 （包含0.5 mol/L 蔗糖、20 mmol/L 馬來酸鹽、20 mmol/L Mg-Cl2，pH 6.5）離心洗滌2 次，棄上清液，將沉淀重懸于含1 mg/mL 溶菌酶的SMM 緩沖液中，混勻后置于37 ℃100 r/min 振蕩30 min，消化肽聚糖層，再加入3.33 mL EDTA 溶液，搖勻后置于37 ℃溫育15 min，制得已除去細胞壁的副溶血弧菌原生質(zhì)體，將該離心管置于4 ℃冰箱中，待用。

1.3.4 最小抑菌濃度測定 采用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC），每支試管依次加入藥物溶液500 μL（0.008～32.000 mg/mL），新鮮APW 培養(yǎng)基490 μL 和10 μL 菌液 （包括正常菌：normal bacteria，NB；去外膜菌：Outer membrane deficient bacteria，OMDB；去壁菌：Cell wall deficient bacteria，CWDB）混勻，同時做不含藥物的陰性對照以及不含藥物和菌液的空白對照。將上述試管在37℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌體生長情況，不出現(xiàn)渾濁的最小藥物濃度即為MIC。

1.3.5 殺菌曲線的測定 采用96 孔板法，每孔加入250 μL 含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基和2.5 μL菌液（NB/OMDB/CWDB），混勻。同時做不含藥物的空白對照，將所有96 孔板于37 ℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h 測定其在600 nm 處的OD 值。每塊96 孔板只測定1 次，以減少雜菌污染的可能。

1.3.6 抑菌作用有效性驗證 為了驗證藥物對副溶血弧菌不同菌株的有效性，測定藥物對副溶血弧菌ATCC33847、2 株食品分離株和1 株抗藥株的抑制效果。具體操作方法同1.3.4 節(jié)。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Excel 2007 處理數(shù)據(jù)并繪制圖表，采用SPSS 19.0 進行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)表示方式為平均數(shù)±標準差，每個測定項目做3 個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源建模

目標蛋白在PDB 中的序列對比結(jié)果如圖1所示，此圖只截取同源性大于50%的蛋白，其中2MHL、2F1T 的序列一致性較高。通常情況下，當目標蛋白的氨基酸序列與模板蛋白的氨基酸序列同源性達到30%及以上時，就可以利用此模板來構(gòu)建目標蛋白的三維結(jié)構(gòu)，且結(jié)果具有較高的可信性[18]。圖1結(jié)果顯示，來自于大腸桿菌（Escherichia coli）的外膜蛋白OmpW（PDB ID：2MHL）與目標蛋白序列的一致性達58%以上，這表明二者的同源性很高。另外，其全局模型質(zhì)量評估（GMQE）分數(shù)最高，且蛋白質(zhì)氨基酸殘基的完整性也較高，因此選擇2MHL 作為目標蛋白同源建模的模板。以PDB 中2MHL 的三維結(jié)構(gòu)為模板，通過SWISS MODEL 模擬出目標蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示目標蛋白同樣具有β-桶狀結(jié)構(gòu)，用于控制物質(zhì)的進出。許多抗生素及抑菌分子與孔道蛋白特異性結(jié)合，或通過孔道進入膜內(nèi)發(fā)揮抑菌作用[19-20]。

OmpW 的建模結(jié)果中有78.0%的殘基落入最佳區(qū)域（Favoured region），16.8%的殘基落入許可區(qū)域（Allowed region），這說明該模型是較為合理的。殘基中GLN24、ASN39、LYS44、LEU46、GLU50、THR58、PRO115、PHE137 落入異常區(qū)域（Outlier region），但這些殘基多位于蛋白的外表面，距活性中心較遠，對后續(xù)的分子對接無直接影響。

圖1 副溶血弧菌OmpW 同源模板的搜尋結(jié)果Fig.1 Search of homologous sequences of OmpW of V.parahaemolyticus

2.2 分子對接

根據(jù)文獻報道選擇5 種具有抑菌作用的小分子作為篩選對象，從Pubchem 下載這些小分子的結(jié)構(gòu)，并作為配體進行對接，最佳構(gòu)象的打分結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，在這5 種天然植物源小分子中，咖啡酸和檸檬酸的打分較高，這說明咖啡酸和檸檬酸與副溶血弧菌OmpW 的相互作用較強，可能產(chǎn)生的抑制作用也更強。

DS 軟件搜尋的潛在活性位點共有6 個，如圖2所示。據(jù)Soojhawon 等[9]的研究結(jié)果，靠近周質(zhì)空間且位于桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)的位點（Site2）是最有可能的活性位點。在該位點與咖啡酸對接時，咖啡酸的O 和受體蛋白中ASP26 的O 產(chǎn)生了一個不利的相互作用（Unfavorable interaction），因此選用同樣位于桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)的Site1 作為與咖啡酸對接位點，Site2 作為與檸檬酸對接的位點，且結(jié)果較為理想。

圖3顯示的是檸檬酸與外膜蛋白OmpW 模型的對接結(jié)果及產(chǎn)生的相互作用。圖3a 顯示了檸檬酸在與受體蛋白結(jié)合時的狀態(tài)與位置，顯然兩個小分子處在相對疏水的桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)。如圖3b所示，檸檬酸與外膜蛋白OmpW 中的氨基酸殘基TYR111、ASN174、ARG30、VAL28 形成了5條經(jīng)典氫鍵（Conventional hydrogen bond），這些氫鍵的氫供體和受體之間的距離均小于或接近于3?，且DHA 和HAY 角均落在90°～180°之間，表明很可能形成了強氫鍵[21-22]。而檸檬酸與GLY65、SER73 形成2 條非經(jīng)典的CH...O 氫鍵（Carbon hydrogen bond），盡管比經(jīng)典氫鍵作用弱，但在蛋白質(zhì)-配體的結(jié)合中也起到一定作用[23]。除了氫鍵，ARG30 側(cè)鏈的NH2還與檸檬酸的O 產(chǎn)生靜電相互作用（Attractive charges）。此外，圖3b 顯示出配體與TYR122、ASP164 等8 個氨基酸殘基產(chǎn)生了范德華相互作用。

表2 分子對接打分結(jié)果Table 2 Results of molecular docking scoring

圖2 DS 軟件定義的OmpW 潛在活性位點Fig.2 Potential OmpW active sites defined by DS software

咖啡酸與受體蛋白產(chǎn)生的相互作用主要有氫鍵、疏水相互作用和范德華相互作用，見圖4?？Х人嶂蟹恿u基的H 與THR105 側(cè)鏈上-OH 的O、羧基的O 與MET207 形成強氫鍵，同時羧基上的另2 個O 分別與蛋白的ALA177 和TRP178 形成弱氫鍵。咖啡酸的苯環(huán)與TRP178 的兩個π 環(huán)（包括但不僅僅包括芳香環(huán)）均有相互作用，π 軌道產(chǎn)生堆疊效應（Pi-Pi T-shaped）。此外咖啡酸還與兩個非極性的氨基酸殘基ALA34 和VAL205 產(chǎn)生另一種類型的疏水相互作用（Pi-Alkyl）。疏水相互作用以及疏水與親水的平衡是維持蛋白質(zhì)-配體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力之一[24]。此外，咖啡酸還與SER35、PHE82 等8 個氨基酸殘基之間存在范德華力。

上述提及的均為非鍵相互作用，與共價鍵相比，非鍵相互作用非常弱，但是它們的累積和堆疊效應是巨大的，對配體與蛋白的結(jié)合以及蛋白質(zhì)-配體的構(gòu)象穩(wěn)定起到至關重要的作用[24]。

圖3 檸檬酸與OmpW 模型對接結(jié)果Fig.3 Docking results of citric acid with OmpW model

圖4 咖啡酸與OmpW 模型對接結(jié)果Fig.4 Docking results of caffeic acid with OmpW model

2.3 最小抑菌濃度

由表3結(jié)果可知，檸檬酸與咖啡酸對副溶血弧菌ATCC17802 均有抑制作用。去外膜和去壁處理增加了副溶血弧菌ATCC17802 對檸檬酸與咖啡酸的敏感性，其MIC 分別減小為原來的1/16 和1/64，這說明抑制劑確實與外膜蛋白OmpW 產(chǎn)生了相互作用，并可能使之失去原有的生理功能（控制物質(zhì)進出等）。另外，有研究表明外膜蛋白與周質(zhì)空間和內(nèi)膜的蛋白形成復合物體系，這一體系可能對藥物進行外排，而失去了外膜甚至細胞壁后，沒有體系的外排作用，敏感性明顯增強[25]。

表3 檸檬酸與咖啡酸對副溶血弧菌ATCC17802 的MIC（mg/mL）Table 3 MIC of citric acid and caffeic acid on V.parahaemolyticus ATCC17802 （mg/mL）

2.4 殺菌曲線

不同濃度的檸檬酸與咖啡酸對副溶血弧菌ATCC17802 3 種狀態(tài)菌體的抑制情況通過殺菌曲線的形式加以分析。圖5結(jié)果表明，當檸檬酸濃度為副溶血弧菌ATCC17802 正常菌體MIC 的1/64和1/32 時，對于正常菌體幾乎沒有抑制作用，而對于去外膜和去壁的菌體卻能夠完全抑制其生長，24 h 內(nèi)OD600nm的上下波動均不超過0.2，這與檸檬酸對不同菌體MIC 測定結(jié)果相一致。當檸檬酸濃度達到MIC 和2 MIC 時，3 種狀態(tài)的菌體均受到很大程度的抑制，只有未加檸檬酸的空白組呈現(xiàn)出正常的生長曲線。Ye 等[26]發(fā)現(xiàn)，在濃度為1/2 MIC 的硫酸新霉素的作用下，阪崎腸桿菌ΔOmpW 缺失株的存活率明顯低于野生型菌株，且缺失株生物膜形成率的下降幅度大于野生型菌株。彭志鋒等[27]通過微量稀釋法測定多種抗菌藥物對鴨源雞桿菌親本菌株RU 和突變株ΔOmpW的MIC，結(jié)果顯示，相對于RU，土霉素和四環(huán)素對ΔOmpW 的MIC 值分別降低到1/8 和1/32，這些結(jié)果說明，外膜β-桶狀蛋白很可能就是抑菌劑作用的位點。

圖5 不同濃度的檸檬酸對副溶血弧菌ATCC17802 的殺菌曲線Fig.5 Killing curves of V.parahaemolyticus ATCC17802 under different concentrations of citric acid

圖6結(jié)果表明，當咖啡酸濃度為副溶血弧菌ATCC17802 正常菌體MIC 的1/16 或1/8 時，正常菌體幾乎沒有受到任何抑制作用，與空白對照相比OD600nm相差不大（P>0.05），曲線呈S 型。而去外膜和去壁的菌體卻幾乎完全被抑制，這同樣與咖啡酸對不同菌體MIC 測定結(jié)果相一致。當咖啡酸濃度增加到MIC 或2MIC 時，3 種狀態(tài)的菌體均受到抑制，只有未加咖啡酸的空白組呈現(xiàn)出正常的生長曲線。有研究表明對茶多酚具抑菌活性起重要作用的是茶多酚分子內(nèi)的多個酚羥基。酚羥基可與蛋白質(zhì)分子中的氨基或羧基發(fā)生結(jié)合反應，其疏水性的苯環(huán)也可以與蛋白質(zhì)發(fā)生疏水結(jié)合反應，而茶多酚與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用阻斷了細菌的侵染路徑，故而能夠抑菌[28]。而咖啡酸有2 個相鄰的酚羥基，這2 個酚羥基可能是咖啡酸的2個活性基團，與副溶血弧菌外膜β-桶狀蛋白通道中的疏水基團相互作用，起到抑菌作用，這在分子對接時已經(jīng)體現(xiàn)。

圖6 不同濃度的咖啡酸對副溶血弧菌ATCC17802 的殺菌曲線Fig.6 Killing curves of V.parahaemolyticus ATCC17802 under different concentrations of caffeic acid

2.5 有效性驗證

表4結(jié)果顯示，檸檬酸和咖啡酸對副溶血弧菌ATCC33847、分離株1（白蛤）、分離株2（鮑魚）以及耐藥株均有抑制作用。且去外膜和去壁之后，MIC 均顯著減小，該結(jié)果與測定的副溶血弧菌ATCC17802 的MIC 規(guī)律一致。Lin 等[29]的研究結(jié)果也表明，從大腸桿菌中刪除OmpW 引起幾種抗生素的MIC 降低，OmpW 可能是革蘭氏陰性細菌的潛在藥物靶標[30]，檸檬酸和咖啡酸的作用位點極可能是副溶血弧菌OmpW。

表4 檸檬酸和咖啡酸對4 種菌株類型的副溶血弧菌的MIC（mg/mL）Table 4 MIC of citric acid and caffeic acid against four kinds of strains of V.parahaemolyticus （mg/mL）

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，以分子對接技術(shù)為基礎篩選副溶血弧菌抑菌劑的方法可行。檸檬酸和咖啡酸對副溶血弧菌的抑菌效果較理想，MIC 均為2 mg/mL。此外，檸檬酸和咖啡酸的作用靶點位于副溶血弧菌外膜上β-桶狀蛋白OmpW 的可能性很高，去外膜和去壁菌體的MIC 和殺菌曲線測定結(jié)果均證實了外膜對于菌體對抗小分子抑菌劑的重要作用。但還需要更深入地對抑菌劑與外膜蛋白OmpW 的相互作用進行生物物理表征，以證實其作為潛在藥物靶標的作用。