絲棉木組培脫菌技術(shù)的研究*

許丁帆，劉艷軍，焦思鵬，黃俊軒，武春霞，李建科

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384)

絲綿木(EuonymusmaackiiRupr.)屬衛(wèi)矛科(Celastraceae)衛(wèi)矛屬(Euonymus)植物，落葉灌木或小喬木，適應(yīng)性強(qiáng)分布范圍廣，耐貧瘠、耐鹽堿、抗惡劣環(huán)境，空氣凈化能力強(qiáng)，具有較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。絲棉木木材特性佳、實(shí)用性強(qiáng)，是中國(guó)西北地區(qū)園林綠化的主要樹(shù)種，秋季橙紅色的葉片和粉紅色的蒴果均有很高的觀賞價(jià)值，極具發(fā)展?jié)摿3]。目前，絲棉木種苗主要以播種、扦插和嫁接等常規(guī)手段進(jìn)行繁殖[4-6]。雖然操作簡(jiǎn)便，技術(shù)難度低，但播種繁殖不能較好地保存親本的優(yōu)良性狀，且周期長(zhǎng)；扦插繁殖植株根系較實(shí)生苗淺、弱；嫁接方式繁殖易受季節(jié)限制。此外，扦插與嫁接時(shí)，傷口易受微生物侵染，致使苗木微生物病菌逐漸積累，導(dǎo)致苗木生長(zhǎng)緩慢甚至死亡。利用植物組織培養(yǎng)進(jìn)行絲棉木快速繁殖[7-9]，雖然一定程度緩解了種苗的數(shù)量問(wèn)題，但由于絲棉木組培苗長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)，內(nèi)生菌會(huì)隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)增加而逐代積累，導(dǎo)致組培苗質(zhì)量下降，組培苗污染等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，阻礙絲棉木優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)。

關(guān)于絲棉木組培脫菌的研究未見(jiàn)報(bào)道，利用植物組培脫菌技術(shù)，并結(jié)合組培快繁技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)脫菌組培苗，以增強(qiáng)組培苗的抗逆性，滿足生產(chǎn)上對(duì)絲棉木優(yōu)質(zhì)種苗的需求，同時(shí)也可以大量減少農(nóng)藥的使用，對(duì)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。因此，本試驗(yàn)采用絲棉木莖段為外植體，利用制霉菌素、硫酸鏈霉素和羧芐青霉素鈉3種抗生素進(jìn)行絲棉木脫菌處理，尋找絲棉木外植體組培脫菌的最佳途徑，獲得絲棉木脫菌組培苗，建立絲棉木組培脫菌體系，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)絲棉木種苗提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用絲棉木1 a生休眠枝條取自天津農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓西南側(cè)成齡的絲棉木植株；制霉菌素(nystatin；USP,≥4 400 units/mg)和羧芐青霉素鈉(carbenicillin disodium salt；USP)購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate；>95%)購(gòu)于梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 絲棉木組培苗的獲得

將取回的絲棉木枝條置于自來(lái)水下沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)中，將枝條剪成2～3 cm的小段，每段帶1～2個(gè)腋芽。用70%乙醇處理30 s，然后置于30%(V/V)次氯酸鈉溶液中處理10 min，無(wú)菌水沖洗3次，每次沖洗5 min，并用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分，接種到1/2 MS+5.0 mg/L GA3固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 Lx，24 h光照。期間不定時(shí)出現(xiàn)細(xì)菌或真菌污染，每天觀察并剔除被污染的外植體。培養(yǎng)30 d后將生長(zhǎng)正常的腋芽切下，轉(zhuǎn)接至1/2 MS+0.25 mg/LNAA培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得大量組培苗備用。

1.2.2 絲棉木脫菌處理

取株高、長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗，剪取長(zhǎng)度約1.0 cm的莖尖，分別接種到含有不同濃度與種類抗生素的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基分別單獨(dú)添加不同濃度的制霉菌素(25、50、75、100 mg/L)、硫酸鏈霉素(25、50、75、100 mg/L)、羧芐青霉素鈉(125、250、500、750 mg/L)；不同抗生素組合(50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素、50 mg/L制霉菌素+250 mg/L羧芐青霉素鈉、50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉、50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉)。所有培養(yǎng)基均添加20 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，高壓滅菌前調(diào)節(jié)pH=5.8，分裝在500 mL廣口三角瓶中，培養(yǎng)基于121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min，滅菌后冷卻備用。將凝固備用的培養(yǎng)基用微波爐加熱融化，待其溫度降至60～70 ℃時(shí)在超凈臺(tái)中加入所需抗生素?？股刂兄泼咕貫榉撬苄?，以二甲基亞砜為溶劑，配成50 mg/L的母液；硫酸鏈霉素與羧芐青霉素鈉為水溶性，以蒸餾水為溶劑，分別配成50、250 mg/L母液。為防止抗生素高溫分解，抗生素溶解后采用 0.22 μm的無(wú)菌微孔過(guò)濾器進(jìn)行抽濾滅菌，滅菌后加入未凝固的培養(yǎng)基中。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)5次。培養(yǎng)條件同1.2.1，每天觀察不同處理對(duì)絲棉木莖尖外植體的生長(zhǎng)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)絲棉木莖尖的存活率、真菌污染率、細(xì)菌污染率和平均生長(zhǎng)量。

1.2.3 絲棉木組培苗的增殖培養(yǎng)及脫菌效果檢測(cè)

將長(zhǎng)約1.0 cm的絲棉木莖尖在1/2 MS+50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，每20 d繼代培養(yǎng)一次，每次繼代培養(yǎng)時(shí)剪取外植體上端約1.0 cm的莖尖，分別繼代培養(yǎng)1、2、3、4次。選取脫菌處理后成活且長(zhǎng)勢(shì)良好的絲棉木外植體，將其轉(zhuǎn)移到1/2 MS+1.0 mg/LBA+0.5 mg/LNAA的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以長(zhǎng)勢(shì)一致的未經(jīng)脫菌處理組培苗為對(duì)照，20 d后統(tǒng)計(jì)外植體的增殖系數(shù)、真菌污染率、細(xì)菌污染率及增殖芽生長(zhǎng)勢(shì)情況。處理重復(fù)3次，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，培養(yǎng)條件同上。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

成活率=(成活外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

真菌污染率=(真菌污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

細(xì)菌污染率=(細(xì)菌污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

平均生長(zhǎng)量=∑(脫菌處理30 d后莖尖外植體高-處理前莖尖外植體高)/存活外植體數(shù)；

增殖系數(shù)=(增殖后總芽數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2013和SPSS Statistic 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 制霉菌素對(duì)絲棉木莖尖外植體抑菌效果的影響

由表1可知，在未添加制霉菌素的培養(yǎng)基中，絲棉木莖尖外植體出現(xiàn)不同程度的真菌與細(xì)菌污染；但隨著培養(yǎng)基中制霉菌素濃度的增大，絲棉木莖尖外植體真菌污染率顯著降低，細(xì)菌污染率無(wú)顯著變化，說(shuō)明制霉菌素能夠有效抑制絲棉木外植體真菌污染，但對(duì)細(xì)菌污染無(wú)明顯作用。絲棉木莖尖外植體成活率、平均生長(zhǎng)量隨制霉菌素濃度的增加而降低；當(dāng)培養(yǎng)基中制霉菌素濃度≥50 mg/L時(shí)，絲棉木外植體成活率與平均生長(zhǎng)量均顯著降低且外植體基部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，葉片黃化，說(shuō)明制霉菌素對(duì)絲棉木具有一定的毒害作用，濃度越高，毒害作用越明顯。當(dāng)培養(yǎng)基中制霉菌素濃度為50 mg/L時(shí)，絲棉木莖尖外植體真菌污染率較CK顯著降低，真菌污染率由CK的14.00%降至1.33%，此時(shí)對(duì)絲棉木莖尖外植體成活率無(wú)顯著影響，莖尖可以生長(zhǎng)正常。因此，在培養(yǎng)基中添加50 mg/L制霉菌素可有效抑制絲棉木莖尖外植體真菌污染。

表1 不同濃度制霉菌素對(duì)絲棉木莖尖外植體的影響

2.2 硫酸鏈霉素對(duì)絲棉木莖尖外植體抑菌效果的影響

從表2可以看出，與對(duì)照相比，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的硫酸鏈霉素，絲棉木莖尖外植體真菌污染率無(wú)顯著變化，說(shuō)明硫酸鏈霉素對(duì)抑制絲棉木莖尖外植體真菌污染無(wú)明顯作用。隨著培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素濃度的增大，絲棉木外植體細(xì)菌染菌率隨之降低，但當(dāng)培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素濃度≥50 mg/L，細(xì)菌污染率不再顯著下降，增加硫酸鏈霉素濃度后絲棉木莖尖不能正常生長(zhǎng)，新葉白化，基部出現(xiàn)不同程度的褐化現(xiàn)象。同時(shí)，從莖尖外植體的平均生長(zhǎng)量看，平均生長(zhǎng)量隨著培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素濃度的升高而降低，說(shuō)明硫酸鏈霉素在一定程度上抑制絲棉木莖尖生長(zhǎng)，采用增加硫酸鏈霉素濃度來(lái)提高其抑制細(xì)菌的效果的方法不可行。因此，單獨(dú)使用硫酸鏈霉素雖能在一定程度上降低莖尖外植體的細(xì)菌污染率，但不能完全抑制莖尖外植體的細(xì)菌污染。

表2 不同濃度硫酸鏈霉素對(duì)絲棉木莖尖外植體的影響

2.3 羧芐青霉素鈉對(duì)絲棉木莖尖外植體抑菌效果的影響

由表3可知，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的羧芐青霉素鈉對(duì)絲棉木莖尖存活率無(wú)顯著影響，在含不同濃度羧芐青霉素鈉的培養(yǎng)基上絲棉木莖尖均能夠正常生長(zhǎng)，但絲棉木莖尖生長(zhǎng)量受到影響，絲棉木的平均生長(zhǎng)量隨著培養(yǎng)基中羧芐青霉素鈉濃度的升高而顯著降低。與CK相比，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的羧芐青霉素鈉絲棉木莖尖的真菌污染率并沒(méi)有顯著降低，說(shuō)明羧芐青霉素鈉對(duì)真菌污染沒(méi)有抑制作用；在一定濃度范圍內(nèi)，絲棉木莖尖的細(xì)菌污染率隨羧芐青霉素鈉濃度的升高而降低，但當(dāng)培養(yǎng)基中羧芐青霉素鈉濃度≥250 mg/L，細(xì)菌污染率無(wú)顯著變化，此時(shí)培養(yǎng)基中均為同種白色細(xì)菌污染，分析原因可能是羧芐青霉素鈉對(duì)該種細(xì)菌無(wú)明顯抑制作用。

表3 不同濃度羧芐青霉素鈉對(duì)絲棉木莖尖外植體的影響

2.4 抗生素組合處理對(duì)絲棉木莖尖外植體抑菌效果的影響

由于單獨(dú)使用一種抗生素抑菌效果不佳，試驗(yàn)在3種不同抗生素最適濃度的基礎(chǔ)上，以3種抗生素的不同組合對(duì)絲棉木莖尖外植體進(jìn)行抑菌處理。由表4知，絲棉木莖尖在所有含不同抗生素組合處理的培養(yǎng)基中，均能正常生長(zhǎng)，但平均生長(zhǎng)量較3個(gè)對(duì)照明顯減小。從內(nèi)生菌污染情況看，當(dāng)培養(yǎng)基中加入50 mg/L制霉菌素與50 mg/L硫酸鏈霉素或250 mg/L羧芐青霉素鈉時(shí)，均能有效抑制絲棉木真菌污染，而細(xì)菌污染率與對(duì)照相比，未發(fā)生明顯變化；當(dāng)培養(yǎng)基中50 mg/L硫酸鏈霉素與250 mg/L羧芐青霉素鈉配合使用時(shí)，對(duì)抑制絲棉木細(xì)菌污染效果顯著，但對(duì)真菌污染無(wú)顯著抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)基中加入制霉菌素、硫酸鏈霉素和羧芐青霉素鈉3種抗生素時(shí)，雖然絲棉木莖尖外植體成活率低于其他處理，但能夠有效地抑制絲棉木組培苗真菌與細(xì)菌污染。因此，在1/2 MS+50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉培養(yǎng)基上進(jìn)行絲棉木組培苗脫菌處理效果較佳。

表4 不同抗生素組合處理對(duì)絲棉莖尖外植體的影響

2.5 繼代培養(yǎng)次數(shù)對(duì)絲棉木脫菌效果的影響

將在1/2 MS+50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)不同次數(shù)的絲棉木莖尖，分別接種到不含抗生素的絲棉木增殖培養(yǎng)基上，20 d后絲棉木增殖培養(yǎng)結(jié)果差異顯著。增殖培養(yǎng)結(jié)果顯示(表5)，隨著脫菌處理繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，絲棉木真菌與細(xì)菌污染率逐漸降低，增殖系數(shù)不斷提高，增殖芽生長(zhǎng)勢(shì)逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明絲棉木脫菌效果隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而不斷增強(qiáng)，同時(shí)與增殖系數(shù)呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，在短時(shí)間內(nèi)絲棉木外植體很難脫除內(nèi)生菌的影響，內(nèi)生菌需要隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加逐漸脫除。在含50 mg/L制霉菌素、50 mg/L硫酸鏈霉素和250 mg/L羧芐青霉素鈉的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3～4次以后，絲棉木增殖系數(shù)顯著提高，增殖芽生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，均明顯優(yōu)于其它處理，且增殖培養(yǎng)時(shí)基本無(wú)內(nèi)生真菌與細(xì)菌污染出現(xiàn)，處理4的細(xì)菌污染為人工接種導(dǎo)致的外源污染。

表5 不同繼代培養(yǎng)次數(shù)對(duì)絲棉木增殖培養(yǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，污染主要可分為內(nèi)源污染和外源污染兩大類。初次接種的外植體在2～3 d內(nèi)就能在外植體周圍或培養(yǎng)基表面長(zhǎng)菌，屬于外源污染，主要由外植體表面攜帶或操作不當(dāng)?shù)仍蛟斐?；?nèi)源污染主要指由外植體本身所攜帶的內(nèi)生菌造成的污染，內(nèi)生菌一般較難采用表面消毒方法清除，一般在接種一段時(shí)間后才出現(xiàn)菌落[10]。外源污染只要選擇適合的外植體消毒方法、操作嚴(yán)格要求，環(huán)境條件嚴(yán)格控制，一般可控制在理想范圍內(nèi)；而內(nèi)源性污染，因其具有隱蔽性，是最難控制的污染源[11-12]。隨著對(duì)抗生素作用機(jī)理的不斷深入研究, 抗生素越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于組培脫菌研究中, 而且控制抗生素使用濃度在一定范圍內(nèi)不對(duì)外植體造成傷害[13]。同時(shí)，生產(chǎn)上可以選用獸用抗生素來(lái)降低生產(chǎn)成本，且獲取容易[14]。

本試驗(yàn)中50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉混合使用的抑菌效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用一種抗生素，能夠有效抑制絲棉木組培苗細(xì)菌污染。這與簡(jiǎn)興[15]在抑制紅掌(Anthuriumandraeanum)細(xì)菌污染中發(fā)現(xiàn)使用300 mg/L的青霉素+180 mg/L鏈霉素，效果好于1 000 mg/L鏈霉素單獨(dú)使用的結(jié)果基本一致。究其原因，是因?yàn)榍嗝顾嘏c鏈霉素合用具有一定的增強(qiáng)與協(xié)同作用，對(duì)多數(shù)細(xì)菌起到抑制作用。因此，在使用不同抗生素種類時(shí)，還需考慮抗生素之間的協(xié)同或拮抗作用。黃俊軒等[16]在利用抗生素進(jìn)行北美海棠(North American Crabapple)組培苗脫菌培養(yǎng)時(shí)，僅用抗生素的標(biāo)準(zhǔn)抗菌濃度進(jìn)行試驗(yàn)，未采用不同抗生素濃度處理，不能準(zhǔn)確獲得不同抗生素對(duì)北美海棠的最佳抑菌濃度。本試驗(yàn)具體研究了3種抗生素不同濃度對(duì)絲棉木組培苗抑菌效果及生長(zhǎng)的影響，可準(zhǔn)確獲得制霉菌素、硫酸鏈霉素與羧芐青霉素鈉對(duì)絲棉木的最佳使用濃度，分別為50、50、250 mg/L。并在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高濃度的制霉菌素與硫酸鏈霉素均對(duì)絲棉木組培苗產(chǎn)生不利影響，這與田永亮等[17]抗生素在較高的濃度下會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響,過(guò)高濃度的抗生素同樣會(huì)殺死植物的結(jié)論一致。但本試驗(yàn)中較高濃度的羧芐青霉素鈉未對(duì)絲棉木組培苗生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用, 這可能與植物的種類不同有關(guān),不同植物對(duì)不同抗生素種類的忍耐程度不同。

絲棉木脫菌具體步驟總結(jié)如下：以絲棉木帶1～2個(gè)腋芽的莖段為外植體，經(jīng)外植體消毒后，獲得表面無(wú)污染的組培苗；剪取組培苗上端長(zhǎng)約1.0 cm莖尖，接種至1/2 MS+50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉培養(yǎng)基上，每隔20 d繼代培養(yǎng)一次，3～4次繼代培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)移至1/2 MS+0.25 mg/L NAA上進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)，即可獲得優(yōu)質(zhì)的絲棉木脫菌組培苗。本結(jié)果可直接應(yīng)用于絲棉木組培快繁研究中，為絲棉木優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。