轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者ctDNA基因突變檢測方法的比較及影響因素分析

陳馨寧，黃 斐，沈敏娜，楊軼慧，王蓓麗,2，郭 瑋,2

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032 2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361015

循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是腫瘤細胞體細胞DNA經(jīng)脫落或當(dāng)細胞凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，存在于血液、尿液、腦脊液等體液中。ctDNA分析能夠快速甄別細胞信號通路上的基因突變情況并且能夠定量ctDNA的突變豐度［1-3］。

常規(guī)基因測序技術(shù)如Sanger測序、焦磷酸測序只能檢測出高負荷腫瘤或ctDNA含量較高的患者體內(nèi)的腫瘤突變片段。隨著DNA測序技術(shù)的快速發(fā)展，已實現(xiàn)對痕量DNA分子進行定量分析。常見的ctDNA檢測技術(shù)有二代測序（next generation sequencing，NGS）、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、MALDI-TOF等。

本文建立了NGS和MALDI-TOF兩個分析平臺，檢測轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）患者血漿ctDNA中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因的常見突變；分析兩個平臺在檢測血漿ctDNA突變中的性能及血漿ctDNA在指導(dǎo)臨床診療方面的潛在價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2016年6月—2017年1月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的30例mCRC患者。

1.2 入選標準

患者均經(jīng)活組織病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸腺癌，臨床分期為Ⅳ期（即轉(zhuǎn)移性癌）且均有3處及以上轉(zhuǎn)移灶，所有患者的活檢組織都接受過分子診斷，明確了KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因的突變狀態(tài)。每例患者收集2管10 mL乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝全血，明確采血時間和采血時的患者狀態(tài)。

1.3 方法

1.3.1 標本預(yù)處理

抽取10 mL外周血全血（EDTA抗凝管）。采用兩步離心法，1 600×g，4 ℃離心10 min后吸取離心后的血漿，16 000×g，4 ℃再次離心10 min，吸取上清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。使用QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit（德國Qiagen公司）抽提ctDNA。ctDNA定量使用Qubit dsDNA HS Assay Kit核酸定量分析試劑盒（美國Invitrogen公司），由ctDNA-Qubit 3.0得到具體濃度后用高靈敏度DNA分析試劑盒（5067-4678）在Agilent 2100 Bioanaylzer上進行樣本質(zhì)量控制。剩余標本-20 ℃保存。

1.3.2 病史獲取

通過病史查詢的方式獲取由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科為患者組織標本進行的分子病理學(xué)檢查結(jié)果和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科為患者血液進行的癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）檢測結(jié)果。

1.3.3 ctDNA-NGS檢測

采用美國Illumina公司NGS平臺MiSeq，配合上海安可濟生物科技有限公司的Comet結(jié)直腸癌試劑盒（AccuraGen Accu-Kit）完成對上述標本的檢測。最終測序的結(jié)果中將包含所檢測的基因、外顯子、堿基和對應(yīng)氨基酸的改變方式，并附上每種基因突變的拷貝數(shù)及豐度作為定量結(jié)果，突變豐度的計算公式如下：突變豐度=（突變型拷貝數(shù)）/（突變型拷貝數(shù)+野生型拷貝數(shù)）×100%。

1.3.4 ctDNA-MALDI-TOF檢測

使用美國Agena公司UltraSEEKTM Colon Panel試劑盒進行MALDI-TOF檢測。出具的結(jié)果由軟件進行自動分析和處理，最后進行對靶目標序列的定性和半定量分析。

1.3.5 ctDNA-ddPCR檢測

使用QX100 ddPCR?系統(tǒng)完成對上述標本的檢測。QX100系統(tǒng)包括QX100微滴生成儀和QX100微滴分析儀，另配備美國Bio-Rad公司的96深孔反應(yīng)模塊PCR儀。檢測試劑盒選用美國Bio-Rad公司的商品化試劑盒（貨號：Lot1863110～1863115及Lot1863102），包括突變位點KRASG12A、KRASG12C、KRASG12D、KRASG12R、KRASG12S、KRASG12V、BRAFV600R。系統(tǒng)將計算陽性和陰性微滴的數(shù)量，從而以數(shù)字格式對靶DNA進行絕對定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用配對資料t檢驗進行分析。以總符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值作為評判兩個平臺的主要參數(shù)指標，計算公式：總符合率=［（真陽性+真陰性）/總樣本數(shù)］×100%；陽性預(yù)測值=［真陽性/（真陽性+假陽性）］×100%；陰性預(yù)測值=［真陰性/（真陰性+假陰性）］×100%。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者的基本信息

本研究共入組30例CRC患者（表1），其中21例男性，9例女性，平均年齡為59.63歲。30例患者根據(jù)TNM分期均處于結(jié)直腸癌Ⅳ期，即mCRC且所有患者均進行過腫瘤組織（原發(fā)灶/轉(zhuǎn)移灶）KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因突變檢測并獲得了檢測結(jié)果。血清中位CEA水平為46.65 ng/mL（2.90～710.60 ng/mL），血清中位CA19-9水平為37.50 ng/mL（8.40～7 506.00 ng/mL），血清中位CA125水平為17.05 ng/mL（4.80～1 141.00 ng/mL）。

2.2 患者組織和血漿中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因突變的情況

本研究比較了30 例患者組織和血漿中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因突變的情況（圖1）。ADx-ARMS中獲得的組織結(jié)果同通過NGS獲得的血漿ctDNA結(jié)果比較，22例患者組織和血漿結(jié)果完全匹配；但由于組織和血漿采樣時間不同以及期間接受治療，有8例患者出現(xiàn)了組織和血漿結(jié)果不匹配的情況。ADx-ARMS中獲得的組織結(jié)果同通過MALDI-TOF獲得的血漿ctDNA結(jié)果比較，18例患者組織和血漿結(jié)果完全匹配；同理，有12例患者出現(xiàn)了組織和血漿結(jié)果不匹配的情況。

根據(jù)以上結(jié)果可見，NGS與組織結(jié)果匹配度較高（73.3%），但由于患者組織標本和患者血漿標本獲取的最長時間間隔達3年6個月，最短時間間隔為6 d，盡管組織ARMS結(jié)果存在一定參考價值，但該匹配度可能與臨床實際情況不符。因此，本研究查閱病史，結(jié)合患者的治療、手術(shù)情況，并且引入ddPCR對突變位點進行復(fù)核（表2）。

表1 患者基本信息Tab.1 Patient characteristics［n (%)］

圖1 組織結(jié)果與血漿ctDNA結(jié)果匹配情況Fig.1 Correlation between ctDNA results and tumor ARMS results

2.3 MALDI-TOF和NGS的符合率、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值

MALDI-TOF和NGS的符合率分別為76.67%和86.67%，陽性預(yù)測值為86.67%和83.33%，陰性預(yù)測值為66.67%和91.67%（表3）。

2.4 提取的ctDNA的量與原發(fā)灶切除與否的關(guān)系

從患者血漿中提取的ctDNA的量與原發(fā)灶切除與否無相關(guān)性（P=0.724 7）；突變位點豐度與原發(fā)灶切除與否顯著相關(guān)（P=0.001，圖2）。

表2 采用ddPCR復(fù)核數(shù)據(jù)Tab.2 Data of re-detection using ddPCR

表3 MALDI-TOF和NGS的符合率、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值Tab.3 The coincidence rate,positive predictive value and negative predictive value of MALDI-TOF and NGS

圖2 原發(fā)灶切除與否與患者突變位點豐度及ctDNA的量的關(guān)系Fig.2 Correlation between primary tumor resection and the abundance of mutation sites/the amount of ctDNA

2.5 提取的ctDNA的量與患者接受治療與否的關(guān)系

從患者血漿中提取的ctDNA的量與患者接受治療（化療、放療、靶向治療）與否無相關(guān)性（P=0.871 9）；突變位點豐度與患者接受治療（化療、放療、靶向治療）與否顯著相關(guān)（P=0.000 6，圖3）。

組織活檢后血漿采集前使用愛必妥治療的患者6例，其中組織結(jié)果為野生型，血漿結(jié)果為突變型有4例，占66.7%。2例為BRAFV600E突變，1例為KRASQ61L突變，1例為NRASQ61K突變。

本實驗還統(tǒng)計了不同突變位點及其突變位點豐度分布（圖4），剔除突變發(fā)生較少的PIK3CA和BRAF位點。

圖3 是否接受治療與患者突變位點豐度及ctDNA的量的關(guān)系Fig.3 Correlation between treatment and the abundance of mutation sites/the amount of ctDNA

圖4 各突變位點豐度情況Fig.4 The abundance of each mutation site

3 討 論

本研究納入了30例mCRC患者，利用NGS和MALDI-TOF檢測入組患者血漿ctDNA中常見突變的性能比對。NGS使用邊合成邊測序的方法對ctDNA進行檢測［4-5］。MALDI-TOF利用質(zhì)譜分析對PCR衍生的擴增子進行分析［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)NGS的符合率和陰性預(yù)測值較好，而MALDI-TOF的陽性預(yù)測值較好。在一項利用NGS檢測108例mCRC患者ctDNA中KRAS、BRAF、BRAS突變狀態(tài)代替組織檢測的可行性實驗［7］中發(fā)現(xiàn)，血液、組織KRAS突變檢測整體一致性為65.26%，BRAF突變檢測整體一致性為93.68%，NRAS突變檢測整體一致性為96.84%。本研究或需納入更多的病例來判斷NGS在結(jié)直腸癌ctDNA突變檢測中的可行性及其他性能。血液樣本檢測結(jié)果在肺癌中可以指導(dǎo)臨床用藥已經(jīng)獲得證實。在一項利用MALDI-TOF檢測結(jié)直腸癌腫瘤組織的石蠟包埋標本中KRAS基因突變情況的實驗［8］中，MALDI-TOF較常規(guī)測序檢測的檢出率和陽性預(yù)測值更高，具有一定臨床價值。仍未見以上兩種方法的陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值等在結(jié)直腸癌ctDNA突變檢測表現(xiàn)方面的大樣本量數(shù)據(jù)。

組織ARMS雖然是ctDNA-NGS臨床驗證的有效參考方法，但仍有相當(dāng)比例樣品存在兩種方法結(jié)果不一致的情況。本研究引入了ddPCR，作為有效的補充檢測手段，協(xié)助分析組織和血檢結(jié)果不一致的情況。同時，樣品臨床信息也有助于分析組織和血檢結(jié)果不一致的原因。在應(yīng)用西妥昔單抗之前，臨床上需要進行常規(guī)的腫瘤組織RAS基因狀態(tài)檢測。本實驗中，6例獲得組織標本前未使用西妥昔單抗，而采血前使用西妥昔單抗的患者中，有4例患者出現(xiàn)了基因突變。2例為BRAFV600E突變，1例為KRASQ61L突變，1例為NRASQ61K突變。其中發(fā)生RAS基因突變是患者對西妥昔單抗的耐藥標志［9］。而產(chǎn)生BRAF基因突變一般被認作是不良預(yù)后的因素之一［10-13］。鑒于本實驗樣本量較少且研究時間較短，無法確定由野生型轉(zhuǎn)為突變型的患者的預(yù)后情況，以及突變位點是否會對患者后續(xù)治療產(chǎn)生影響。

本實驗中ctDNA的量與患者是否接受腫瘤原發(fā)灶的切除以及是否接受治療（包括化療、放療、靶向治療）無關(guān)。但Tie等［14］報道，化療過程中mCRC患者的ctDNA發(fā)生了變化，在治療第2個周期之前就觀察到的48例ctDNA和組織伴有突變的樣本中有41例ctDNA水平顯著降低。推測本研究的樣本量或?qū)嶒炘O(shè)計可能產(chǎn)生一定影響，本研究樣本量較少，并且在實驗設(shè)計時增加了對同一患者治療前后的血漿ctDNA含量的比較。

在12例KRAS突變和2例NRAS突變患者中，發(fā)現(xiàn)RASctDNA突變位點豐度低于1%的患者的腫瘤原發(fā)灶均發(fā)生在左半結(jié)腸；與此同時RASctDNA突變位點豐度高于25%的患者的腫瘤原發(fā)灶均發(fā)生在右半結(jié)腸，結(jié)直腸癌中，腫瘤原發(fā)灶位于左半結(jié)腸通常認為比位于右半結(jié)腸預(yù)后更好，但仍需對患者進行隨訪，了解其腫瘤進展情況和生存期來驗證以上假設(shè)。另外，Morelli等［15］研究發(fā)現(xiàn)，基線高的RASctDNA突變位點豐度與生存率低相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA突變位點豐度水平與患者是否接受腫瘤原發(fā)灶的切除以及是否接受治療（包括化療、放療、靶向治療）有關(guān)。接受手術(shù)干預(yù)和治療的患者的突變位點豐度普遍較低。ctDNA水平和ctDNA突變位點豐度可以在治療開始前為RAS基因突變的患者提供評估信息。

本研究存在部分缺陷，目前來看急需更大樣本量及更長隨訪周期來觀察來自不同平臺ctDNA的數(shù)據(jù)對于臨床應(yīng)用的價值。此外，應(yīng)用ARMS方法獲得的組織分子分型結(jié)果的說服力較低，在有條件的情況下使用大基因檢測組合的NGS進行組織分型，將有利于平臺比對以及后續(xù)研究的開展。

綜上所述，兩個平臺均可用于檢測mCRC患者ctDNA中的常見突變，但NGS的陰性預(yù)測值要優(yōu)于MALDI-TOF?；颊咄蛔兾稽c豐度與患者的原發(fā)灶是否手術(shù)切除以及患者是否接受過治療（包括化療、放療、靶向治療）有關(guān)。