TRIP6在乳腺癌中的作用及其機(jī)制研究

王春建，聶 剛，毛 艷

1.山東省腫瘤醫(yī)院乳腺科，山東 濟(jì)南 250000；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺病診療中心，山東 青島 266555

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，是女性癌癥死亡的常見原因，浸潤性乳腺癌是最常見的病理學(xué)類型。中國乳腺癌病例數(shù)約占全世界的11%，并且近年來患病率呈上升趨勢［1］。隨著乳腺癌診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，患者5年生存率明顯提高［2］。復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是影響乳腺癌患者預(yù)后的主要因素。闡明乳腺癌的發(fā)病機(jī)制并尋找潛在治療靶點(diǎn)對(duì)改善預(yù)后有重要意義。

乳腺是激素依賴性器官，甲狀腺激素可以調(diào)控乳腺細(xì)胞的生長、分化和發(fā)育。越來越多的研究表明，甲狀腺激素及其受體可以通過影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、分化和代謝等，參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，可能是因?yàn)榧谞钕偌に鼐哂蓄惔萍に貥幼饔茫?］。甲狀腺激素受體相互作用蛋白6（thyroid receptor-interacting protein 6，TRIP6）可以與甲狀腺受體相互作用，可作為細(xì)胞黏附分子參與細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞遷移等。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TRIP6可能參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，包括骨肉瘤［4］、子宮內(nèi)膜癌［5］和胰腺癌［6］等。TRIP6在乳腺癌中的作用及機(jī)制既往少有報(bào)道。

轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白C1（forkhead box C1，F(xiàn)OXC1）是叉頭框超家族的一個(gè)重要成員，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲有重要影響，可能作為癌基因在乳腺癌中發(fā)揮作用［7］。FOXC1基因是TRIP6的靶基因［8］。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測乳腺癌組織及其配對(duì)的癌旁組織、乳腺良性纖維腺瘤組織中TRIP6和FOXC1的表達(dá)，另外，通過下調(diào)TRIP6基因的表達(dá)觀察乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的變化，探討TRIP6在乳腺癌中的作用及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞（BT474、MCF7和MDA-MB-231）均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、SP免疫組織化學(xué)試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒和凝膠快速制備試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，TRIP6兔抗人多克隆抗體（規(guī)格：0.2 mL/200 μg，批號(hào)：YK0316）、山羊抗兔IgG二抗、β-actin內(nèi)參抗體均購自上海禾午生物科技有限公司，LipoFiterTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自上海恒圓生物科技有限公司，TRIP6 si-RNA（序列為5’-CGTACCTTCCACTCGCTTTCT-3’）及si-control（序列為5’-GGAAGUUAGACAAAGAUGAGA-3’）均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成并提供，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、transwell小室均購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)箱購自常州金壇良友儀器有限公司，IX71倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，164-5050電泳儀和iMark酶標(biāo)儀均購自美國Bio-Rad公司，UVCI-2300凝膠成像儀購自美國Major Science公司。

1.2 患者資料及組織樣本

選取2011年1月—2013年12月山東省腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的268例乳腺癌組織及其配對(duì)的癌旁組織（距癌組織≥5 cm）?；颊呔鶠榕?，年齡29～73歲，平均（49.36±9.80）歲。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。組織石蠟包埋切片由山東省腫瘤醫(yī)院病理科制作并儲(chǔ)存（切片厚度為4 μm）。術(shù)后對(duì)所有患者進(jìn)行門診和電話隨訪，隨訪截至2018年12月。另選取乳腺良性纖維腺瘤組織80例作為對(duì)照。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-10A、BT474、MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代，用胰蛋白酶消化，以1∶3傳代。取5～15代對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測組織中TRIP6和FOXC1的蛋白水平

取組織石蠟包埋切片，脫蠟至水。將切片放置于檸檬酸鹽緩沖液中微波煮沸5 min，冷卻至室溫。用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2次，每次5 min，再用蒸餾水洗滌2次，每次3 min。滴加3%過氧化氫除去內(nèi)源性過氧化物酶，室溫溫育10 min。隨后用山羊血清室溫下封閉10 min，滴加TRIP6兔抗人多克隆抗體，4 ℃溫育過夜。用PBS洗滌3次，每次3 min，再用蒸餾水洗滌3次，每次3 min。滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃下溫育1 h，用PBS洗滌3次，每次3 min。滴加DAB顯色液，蘇木紫復(fù)染。經(jīng)過脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。

每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞。參考Ebili等［9］的研究，根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例判斷TRIP6表達(dá)情況：①陰性染色記0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；②0%≤陽性細(xì)胞數(shù)≤10%記1分，10%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤50%記2分，50%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤80%記3分，80%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤100%記4分。將上述2個(gè)評(píng)分相乘得出最終結(jié)果：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～8分為中等陽性，9～12分為強(qiáng)陽性；0～3分為TRIP6低表達(dá)，4～12分為TRIP6高表達(dá)。

FOXC1的檢測方法同上。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞中TRIP6和FOXC1的蛋白水平

取MCF-10A、BT474、MCF7和MDA-M B-231 細(xì)胞，用RAPI 裂解液提取總蛋白，用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗TRIP6（1∶500）4 ℃溫育過夜，第2天除去一抗，用洗膜緩沖液（tris buffered saline Tween，TBST）緩沖液洗滌3次后加入羊抗兔二抗（1∶500），封閉1 h。以β-actin作為內(nèi)參，電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）儀進(jìn)行蛋白成像，Image J軟件分析灰度值。

FOXC1的檢測方法同上。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中。轉(zhuǎn)染前用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1.8 mL無血清培養(yǎng)基。分別用100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋10 μL LipoFiterTM和10 mL TRIP6 si-RNA（或si-control），靜置5 min后將兩者混勻，隨后將混合物加入6孔培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后用胰蛋白酶消化MDA-MB-231細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板中（密度為1 000個(gè)細(xì)胞/孔），37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)3周，每2 d換液1次。當(dāng)出現(xiàn)菌落時(shí)停止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基。4%多聚甲醛溶液固定30 min后用結(jié)晶紫染色，計(jì)算每孔細(xì)胞克隆數(shù)目。

將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中（密度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔），用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性，在培養(yǎng)24、48、72和96 h時(shí)，向每個(gè)培養(yǎng)孔中添加10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處讀取吸光度（D）值，以反映細(xì)胞增殖活力。

1.8 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

在transwell遷移板上室鋪基質(zhì)膠，隨后將MDA-MB-231細(xì)胞接種于transwell小室（24孔，孔徑5.0 μm）中，以2×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度將細(xì)胞加入上室中；下室中加入培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后取出小室，用棉簽拭去微孔膜上室的細(xì)胞。用PBS沖洗小室3遍。用4%多聚甲醛溶液固定黏附于下室微孔膜下面的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色15 min，干燥后在顯微鏡下觀察，計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

轉(zhuǎn)染后以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將MDAMB-231細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)用無菌槍頭進(jìn)行劃痕處理。首先吸去原培養(yǎng)基，然后用PBS洗滌3次，隨后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)0、24 h時(shí)用顯微鏡拍照，劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%［10］。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次。應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。等級(jí)資料比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法，組間生存率比較采用log-rank檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析或Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIP6和FOXC1在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測268例乳腺癌組織及其配對(duì)的癌旁組織、80例乳腺良性纖維腺瘤組織中TRIP6和FOXC1的表達(dá)，結(jié)果顯示，TRIP6和FOXC1均主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖1）。乳腺癌組織中TRIP6及FOXC1的陽性表達(dá)率分別為85.08%和88.06%，均高于良性纖維腺瘤組織（25.00%和15.00%）和乳腺癌癌旁組織（55.97%和62.31%）（P均＜0.01，表1）。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中TRIP6與FOXC1的陽性表達(dá)率呈正相關(guān)（r=0.771，P＜0.001）。

Western blot檢測結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞中TRIP6和FOXC1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.38±0.16和1.20±0.20，MCF-7細(xì)胞分別為0.59±0.08和0.41±0.09，BT474細(xì)胞分別為1.26±0.21和0.92±0.25，均高于MCF10A細(xì)胞的0.32±0.05和0.38±0.05（P均＜0.05，圖2A）。MDA-MB-231細(xì)胞中TRIP6與FOXC1蛋白相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.908，P=0.033，圖2B）。

2.2 TRIP6和FOXC1與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

單因素和COX多因素分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、TRIP6高表達(dá)和FOXC1高表達(dá)是乳腺癌患者總生存時(shí)間（overall survival，OS）和無進(jìn)展生存時(shí)間（progression-free survival，PFS）的獨(dú)立影響因素（P均＜0.05，表2）。生存曲線分析顯示，TRIP6高表達(dá)乳腺癌患者的OS率和PFS率均低于TRIP6低表達(dá)患者（χ2=31.112，P＜0.001；χ2=30.073，P＜0.001）；FOXC1高表達(dá)乳腺癌患者的OS率和PFS率均低于FOXC1低表達(dá)患者（χ2=45.897，P＜0.001；χ2=57.324，P＜0.001，圖3）。

2.3 沉默TRIP6基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，TRIP6 si-RNA組TRIP6蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.42±0.09，明顯低于si-control組的1.21±0.08（P＜0.001，圖4）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖的結(jié)果顯示，TRIP6 si-RNA組克隆細(xì)胞數(shù)為（49.70±10.34）個(gè)，明顯低于si-control組的（149.56±63.78）個(gè)（P＜0.001，圖5A）。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活力的結(jié)果顯示，TRIP6 si-RNA組細(xì)胞培養(yǎng)第72和96 h時(shí)D值分別為0.39±0.05和0.53±0.07，均低于si-control組的0.58±0.03和0.76±0.07（P均＜0.01，圖5B）。Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲的結(jié)果顯示，TRIP6 si-RNA組細(xì)胞侵襲數(shù)為（31.67±10.17）個(gè)，明顯低于si-control組的（103.56±31.74）個(gè)（P＜0.001，圖5C）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移的結(jié)果顯示，TRIP6 si-RNA組細(xì)胞遷移率為（19.12±3.87）%，明顯低于sicontrol組的（38.82±8.51）%（P＜0.01，圖5D）。

圖1 免疫組織化學(xué)染色法檢測良性纖維腺瘤組織、乳腺癌癌旁組織和乳腺癌組織中TRIP6和FOXC1的表達(dá)Fig.1 Immunohistochemical staining to detect the expressions of TRIP6 and FOXC1 in benign fibroadenoma tissue,breast cancer adjacent tissue and breast cancer tissue

表1 TRIP6和FOXC1在良性纖維腺瘤組織、乳腺癌癌旁組織和乳腺癌組織中的表達(dá)情況Table.1 Expression of TRIP6 and FOXC1 in benign fibroadenoma tissue,breast cancer adjacent tissue and breast cancer tissue［n (%)］

圖2 Western blot檢測細(xì)胞中TRIP6和FOXC1的表達(dá)Fig.2 Western blot was uesd to detect the expressions of TRIP6 and FOXC1 in cells

表2 單因素和多因素分析乳腺癌患者的總體生存預(yù)后Tab.2 Univariate and multivariate analyses of the total survival of breast cancer patients

圖3 乳腺癌患者的生存曲線分析Fig.3 Analysis of survival curve of patients with breast cancer

2.4 沉默TRIP6基因?qū)OXC1蛋白水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，TRIP6 si-RNA組TRIP6蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.18±0.06，明顯低于si-control組的1.01±0.08（P＜0.001，圖6）。

圖4 沉默TRIP6基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞TRIP6蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of TRIP6 gene silencing on TRIP6 protein expression in MDA-MB-231 cells

圖5 沉默TRIP6基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響Fig.5 Effects of silencing TRIP6 gene on proliferation,invasion and migration of MDA-MB-231 cells

圖6 沉默TRIP6基因?qū)OXC1蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of silencing TRIP6 gene on FOXC1 protein expression

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響患者的健康與生命［11］。尋找乳腺癌潛在的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)改善患者的生存預(yù)后有重要意義。TRIP6又被稱為Zyxin相關(guān)蛋白，屬于LIM蛋白Zyxin家族的一種調(diào)節(jié)蛋白［6］。TRIP6最早被發(fā)現(xiàn)可以與甲狀腺素受體相互作用，之后越來越多的研究［6，12］證實(shí)，TRIP6可以作為黏附分子而發(fā)揮作用，參與細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞間黏附、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲、遷移和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。既往研究發(fā)現(xiàn)，TRIP6在骨肉瘤［4］、子宮內(nèi)膜癌［5］、胰腺癌［6，13］、肝細(xì)胞癌［8］和胃癌［14-15］等腫瘤中高表達(dá)，可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能涉及：①TRIP6與α-生育酚轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互結(jié)合，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路［16］，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，TRIP6通過抑制FOXO3a來抑制癌細(xì)胞增殖［17］；②TRIP6與TRAF6協(xié)同調(diào)節(jié)LPA2受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致慢性炎癥、抗凋亡和細(xì)胞侵襲［18］；③TRIP6通過PI3K/AKT、Nothch和MMP信號(hào)通路等促進(jìn)癌細(xì)胞遷移［6］。

本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測了組織中TRIP6的表達(dá)，采用Western blot檢測了細(xì)胞中TRIP6的表達(dá)，結(jié)果顯示，乳腺癌組織中TRIP6的陽性表達(dá)率均高于乳腺良性纖維腺瘤組織和乳腺癌癌旁組織，乳腺癌細(xì)胞中TRIP6的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞，提示TRIP6可能參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。甲狀腺激素及其受體可以通過影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和分化，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展。TRIP6可以與甲狀腺激素受體相互作用，進(jìn)而可能調(diào)控乳腺癌的發(fā)展，然而既往鮮有相關(guān)報(bào)道。Zhao等［19］研究發(fā)現(xiàn)，TRIP6可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)乳腺癌的干細(xì)胞特性，進(jìn)而可能促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中、MDAMB-231細(xì)胞中TRIP6與FOXC1的表達(dá)呈正相關(guān)，提示TRIP6可能通過FOXC1來發(fā)揮作用。既往在肝細(xì)胞癌的研究中，Wang等［8］已經(jīng)證實(shí)FOXC1是TRIP6的靶基因。既往研究證實(shí)，F(xiàn)OXC1可能是乳腺癌的生物標(biāo)志物，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、化療敏感性、預(yù)后密切相關(guān)［20-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默TRIP6基因后，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)TRIP6可能通過FOXC1在乳腺癌中發(fā)揮作用。

本研究的COX多因素分析和生存曲線分析顯示，TRIP6和FOXC1均與乳腺癌患者的生存預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)水平越高，患者生存預(yù)后越差，提示對(duì)TRIP6/FOXC1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶向干預(yù)可能有助于改善乳腺癌患者的預(yù)后。

綜上所述，TRIP6在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，沉默TRIP6基因可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并抑制FOXC1的蛋白表達(dá)。TRIP6和FOXC1均是乳腺癌患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素，提示對(duì)TRIP6/FOXC1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶向干預(yù)可能有助于改善預(yù)后。本研究也存在一些局限性，例如，未檢測乳腺癌患者血清中TRIP6的表達(dá)水平，其對(duì)乳腺癌早期診斷及鑒別診斷的價(jià)值需要未來進(jìn)一步分析，也沒有直接分析TRIP6與乳腺癌患者甲狀腺受體的相互關(guān)系，未分析TRIP6與凋亡、細(xì)胞周期和化療敏感性等的關(guān)系，而這些對(duì)深入理解乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程具有重要的意義。