不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞老化的實(shí)驗(yàn)觀察

李炳旻，唐浩文，馬 奎，楊宇光，張翠萍

1 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部 創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生研究中心，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 肝膽胰外科醫(yī)學(xué)部，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心 皮膚科，北京 100084

衰老是發(fā)生于生物有機(jī)體的一個(gè)普遍特征[1]。在多細(xì)胞生物中，衰老表現(xiàn)為分子水平、細(xì)胞水平和組織水平的功能逐漸喪失。衰老是一項(xiàng)不可逆轉(zhuǎn)的自然進(jìn)程，越來越多的研究證據(jù)表明一些不良因素可加速細(xì)胞、組織、甚至機(jī)體的衰老，如感染、缺氧、光老化等[2]。近年來，高糖引起的細(xì)胞衰老在各個(gè)器官得到了普遍的證實(shí)[3]。在慢性高糖環(huán)境的作用下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，ROS可加速端?？s短、引起DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)并導(dǎo)致衰老相關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯[4-6]。成纖維細(xì)胞在慢性糖基化過程中，其細(xì)胞骨架的Vimentin蛋白是糖基化終產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)之一，長(zhǎng)期刺激可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械性能及其與細(xì)胞的相互作用均被改變，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能[7-9]。本文旨在比較不同濃度和不同作用時(shí)間高糖DMEM培養(yǎng)液對(duì)成纖維細(xì)胞的老化作用，為高糖誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞老化的體外模型建立提供一定 的參考。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，賽默飛公司；熒光顯微鏡，萊卡公司；Realtime qPCR，賽默飛公司；中性蛋白酶Ⅱ，北京索萊寶科技有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)液，Gibco；DMEM高糖培養(yǎng)液，Gibco；200 g/L葡萄糖溶液，Gibco；Cell Counting Kit-8試劑盒，Dojindo東仁化學(xué)科技有限公司；β-半乳糖苷酶染色試劑盒，Sigma；TRIZOL，Invitrogen；FastKingcDNA第一鏈合成預(yù)混試劑，天根生化科技有限公司；Super-RealPreMix Plus (SYBR Green)，天根生化科技有限 公司。

2 原代成纖維細(xì)胞分離及培養(yǎng) 皮膚來源于一名20歲健康男性包皮環(huán)切術(shù)所切除的包皮組織。碘伏浸泡10 min后，用PBS漂洗3 ～ 5次，直至漂洗液清亮透明；去除脂肪組織和結(jié)締組織后，將標(biāo)本剪成1 mm3的組織塊，置于含0.5%中性蛋白酶Ⅱ的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，4℃消化過夜。收集可覆蓋3.5 cm培養(yǎng)皿底部的真皮組織塊，加入1 mL血清，然后將組織均勻地貼附于T25培養(yǎng)瓶下表面，垂直置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中1 h，之后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)平放，緩慢加入少許DMEM培養(yǎng)液，以剛剛浸沒組織塊為宜。第2天再向瓶中加入少許培養(yǎng)液。之后每3 d換液1次，并在倒置顯微鏡下觀察。約4 d后組織塊周圍可見少量梭形的細(xì)胞爬出，7 d后組織塊周圍可見大量呈編織狀排列的細(xì)胞。PBS沖洗，消化，傳代，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基傳代培 養(yǎng)至第5代(P5)。

3 細(xì)胞增殖能力的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行評(píng)估。首先，將成纖維細(xì)胞接種于4個(gè)96孔板中，接種細(xì)胞密度約為2×103/孔，在培養(yǎng)箱中過夜，使細(xì)胞充分貼壁。次日，在96孔板中，根據(jù)分組情況，分別給予含5.5 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L、35 mmol/L和45 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。并于1 d、3 d和5 d時(shí)，隨機(jī)抽取一個(gè)96孔板進(jìn)行光密度值(optical density，OD)測(cè)定。首先，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，將CCK-8溶液與DMEM培養(yǎng)基按1∶10的比例混勻后，每孔加入110 μL混合液，同時(shí)在無細(xì)胞的孔中加入等量PBS作為空白對(duì)照。37℃避光孵育2 h后用酶標(biāo)儀(Biotek，VT，USA)分別測(cè)量每個(gè)孔在450 nm波 長(zhǎng)處的吸光度，即OD值。

4 細(xì)胞遷移能力的測(cè)定 通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成纖維細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的遷移能力。首先，將成纖維細(xì)胞接種在6孔板中，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞完全貼壁后更換為分別含5.5 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L、35 mmol/L和45 mmol/L葡 萄 糖的DMEM培養(yǎng)基。待細(xì)胞達(dá)到90% ～ 100%單層融合時(shí)，用200 μL移液槍頭劃一條直線，PBS洗滌3次后加入不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于0 h和24 h時(shí)拍攝照片，比較不同組間細(xì)胞的遷移情況，并通過細(xì)胞重新覆蓋的面積評(píng)估細(xì)胞的遷移能力，其計(jì)算公式：(初始空白面積－實(shí)時(shí)空 白面積)/初始空白面積×100%。

5 細(xì) 胞 衰 老 判 定 β-半 乳 糖 苷 酶(senescenceassociated β-galactosidase，SA-β-Gal)活性水平上調(diào)是細(xì)胞衰老的重要特征之一。因此，我們采用細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(Sigma)檢測(cè)各組細(xì)胞SA-β-gal的表達(dá)，從而判斷細(xì)胞是否發(fā)生衰老。通過β-半乳糖苷酶染色，衰老細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)出藍(lán)色。首先，將細(xì)胞接種至6孔板中，分別用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)。第3天和第5天時(shí)觀察SA-β-gal著色情況。吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，每孔加入1 mL固定液室溫下固定10 min；配制SA-β-gal染色溶液，每孔加入1 mL，封包后37℃水浴過夜。次日于光學(xué)顯微鏡下觀察。分別計(jì)數(shù)藍(lán)色細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，確定SA-β-gal陽性細(xì)胞 的比例。

6 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞p16、p21和p53的基因表達(dá) 將細(xì)胞接種在6孔板中，并在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d；每孔依次加入1 mL Trizol(Invitrogen)，200 μL氯仿，500 μL異丙醇，提取細(xì)胞中的RNA；75%乙醇洗滌純化RNA后風(fēng)干；加入DEPC水溶解沉淀后，用分光光度計(jì)測(cè)量各組RNA濃度；使用 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒(FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix)合成cDNA，再分別加入GAPDH、p 53、p21和p16引物進(jìn)行基因擴(kuò)增。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics(IBM，Armonk，NY)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t法及SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高 糖 環(huán) 境 導(dǎo) 致 成 纖 維 細(xì) 胞 增 殖 能 力 下 降 CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與5.5 mmol/L組相比，隨著葡萄糖濃度的升高，成纖維細(xì)胞的增殖能力逐漸增高，并于25 mmol/L時(shí)達(dá)到頂峰；當(dāng)給予更高濃度的葡萄糖環(huán)境(≥ 35 mmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，成纖維細(xì)胞的增殖能力逐漸下降。該結(jié)果說明適當(dāng)?shù)母咛黔h(huán)境(25 mmol/L)可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，而過高的葡萄糖濃度(≥ 35 mmol/L)則會(huì)對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。第1天、第3天時(shí)，35 mmol/L和45 mmol/L組的OD值與5.5 mmol/L組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而第5天時(shí)35 mmol/L和45 mmol/L組OD值低于5.5 mmol/L組(P＜0.05)(圖1)。說明隨著高糖環(huán)境作用時(shí)間的延長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞的增殖能力受損更加 顯著。

2 高糖環(huán)境損害成纖維細(xì)胞的遷移能力 劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡萄糖濃度為15 mmol/L和25 mmol/L時(shí)，成纖維細(xì)胞的遷移能力較5.5 mmol/L時(shí)提高；而當(dāng)葡萄糖濃度 ≥ 35 mmol/L時(shí)，成纖維細(xì)胞 的遷移能力明顯下降(P＜0.01)(圖2)。

3 高糖環(huán)境使成纖維細(xì)胞SA-β-gal表達(dá)水平升高 當(dāng)不同葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)液作用第3天時(shí)，各組β-半乳糖苷酶染色陽性的成纖維細(xì)胞均較少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而第5天時(shí)，采用35 mmol/L和45 mmol/L葡萄糖濃度DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中β-半乳糖苷酶染色陽性的比 例顯著增加(P＜0.01)(圖3)。

4 高 糖 環(huán) 境 導(dǎo) 致 成 纖 維 細(xì) 胞p53、p21和p16表達(dá)上調(diào) 與5.5 mmol/L組相比，35 mmol/L組和45 mmol/L組成纖維細(xì)胞p53、p21和p16的表達(dá)均上調(diào)(P＜ 0.05)。說明當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度 ≥35 mmol/L時(shí)，成纖維細(xì)胞出現(xiàn)衰老相關(guān)表型(p16表達(dá)上調(diào))(圖4)。由此推測(cè)，高糖誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞老化的分子機(jī)制可能是通過上調(diào)p53/p21通路 ，進(jìn)而引起p16表達(dá)水平的升高。

圖 1 CCK-8實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞在1 d、3 d、5 d時(shí)OD值的變化(aP＜0.05)Fig.1 OD value of each group at day 1, day 3 and day 5 by CCK-8 assay (aP＜0.05)

討 論

細(xì)胞衰老是一種自然發(fā)生的、不可避免的過程[10]。然而，當(dāng)細(xì)胞受到持續(xù)性促增殖信號(hào)刺激，或端粒和線粒體功能損害時(shí)[11-12]，亦會(huì)出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，這是細(xì)胞對(duì)損傷的反應(yīng)。損傷為一過性時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)短暫的細(xì)胞周期阻滯，伴p53及其下游信號(hào)分子p21表達(dá)上調(diào)。應(yīng)激解除后細(xì)胞即可恢復(fù)增殖，而不會(huì)發(fā)生細(xì)胞衰老。當(dāng)損傷持續(xù)存在時(shí)，p53/p21下游的CDKN2A位點(diǎn)激活，產(chǎn)生大量p16，進(jìn)而導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。在這一階段，DNA發(fā)生持續(xù)性損傷，此時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)特征性的衰老細(xì)胞相關(guān)表型[13]，包括：1)衰老相關(guān)異染色質(zhì)位點(diǎn)激活；2)DNA損傷；3)β半乳糖苷酶上調(diào)；4)p16表達(dá)上調(diào)；5)端?？s短；6)細(xì)胞增殖能力下降。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖濃度 ≥35 mmol/L時(shí)，成纖維細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著下降。β-半乳糖苷酶在3 d時(shí)差異不顯著，而5 d時(shí)可見顯著組間差異，說明該指標(biāo)特異性強(qiáng)，可作為監(jiān)測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生衰老的特征性指標(biāo)。Chen等[14]報(bào)道，4 d以上的持續(xù)性刺激方可導(dǎo)致細(xì)胞分裂進(jìn)程停滯及不可逆性衰老進(jìn)程的發(fā)生[15]。PCR結(jié)果表明，在高糖環(huán)境的作用下，成纖維細(xì)胞p53、p21和p16的表達(dá)上調(diào)，說明p53/p21通路可能是高糖環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞老化的作用靶點(diǎn)?？傊?，適當(dāng)?shù)钠咸烟菨舛?25 mmol/L)可提高成纖維細(xì)胞的增殖和遷移功能，而過高濃度(≥35 mmol/L)會(huì)抑制成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生老化，且該作用呈時(shí)間和濃度依賴性。本研究為高糖誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老體外模型的建立提供了一定的理論依據(jù)，該模型可用于拮抗高糖引發(fā)的細(xì)胞衰老的藥物研究體外實(shí)驗(yàn)，或高糖引發(fā)細(xì)胞衰老機(jī)制的進(jìn)一步探索。

圖 4 不同濃度葡萄糖作用下(A) p53、(B) p21和 (C) p16的PCR結(jié)果(aP＜0.05，bP＜0.01)F ig.4 PCR result of (A) p53, (B) p21 and (C) p16 with different concentrations of glucose (aP＜0.05，bP＜0.01)