N-乙酰半胱氨酸對PM2.5致支氣管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用體外實驗

郭 淼，閆 鵬，韓國鑫，朱 明，金 珊，肖 坤，解立新

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)部，北京 100853；3 戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心 急診科，北京 100101；4 美中宜和婦兒醫(yī)院 內(nèi)科，北京 100101

可吸入顆粒物PM2.5對人體健康的影響受到全世界的廣泛關(guān)注。近年來的相關(guān)研究表明，PM2.5會加重慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等肺疾。PM2.5被吸入后沉積于呼吸道上皮，進(jìn)入細(xì)胞間空隙，促使生成白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子等多種促炎性細(xì)胞因子，這些分子在短時間內(nèi)釋放，促進(jìn)呼吸系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，從而加重患者的呼吸道癥狀，對呼吸系統(tǒng)造成不利影響[1-2]。因此有效控制炎癥反應(yīng)，可以減輕PM2.5引起的呼吸系統(tǒng)功能障礙。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-Lcysteine，NAC)是一種黏液溶解劑。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)NAC擁有較強(qiáng)的抗氧化作用，能夠有效減輕粉塵顆粒引起的氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[3]。自噬作為COPD的發(fā)病機(jī)制之一，可以影響氣道黏液的分泌和氣道重構(gòu)，但其是促進(jìn)COPD的發(fā)展還是作為一種防御機(jī)制國內(nèi)外仍然存在爭議[4-5]。在PM2.5誘導(dǎo)的氣道反應(yīng)中，自噬的作用，以及如何抑制自噬的作用以達(dá)到緩解氣道炎癥反應(yīng)，相關(guān)研究較少。近期的研究表明，NAC可以通過調(diào)節(jié)自噬，減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和衰老[6-7]。這為我們研究如何通過調(diào)控自噬，以達(dá)到抑制PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)提供了新思路。本研究擬通過探討NAC對PM2.5致人支氣管上皮細(xì)胞凋亡和自噬反應(yīng)的抑制作用，以期尋找新的方法來減弱PM2.5的肺毒性。

材料與方法

1 試劑和儀器 BEAS-2B細(xì)胞(上海斯信生物科技有限公司)，RPMI Medium 1 640培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，Penicillin-Streptomycin Solution(HyClone)，L-Glutamine、Sodium Pyruvate (Gibco)，N-乙酰半胱氨酸(Sigma)，LC3b抗體、P62抗體(CST)，4%多聚甲醛(碧云天)，Triton X-100(上海西唐生物科技有限公司)，牛血清白蛋白溶液(Sigma)，Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天)，GAPDH (14C10) Rabbit mAb(CST)，Immobilon Western HRP底物化學(xué)發(fā)光液(默克密理博)，CO2培養(yǎng)箱(Thermoscientific)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)，激光共聚焦顯微鏡 TCS-SP8(雙光子、FLIM；Leica徠卡)，Sage creation化學(xué)發(fā)光凝膠 成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

2 霧霾顆粒的收集 依據(jù)中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)(HJ 92-2013)所述要求，選擇距離地面約20 m的露天平臺，使用型號為2025i型環(huán)境空氣顆粒物(PM2.5)采樣器[質(zhì)(認(rèn))字No.2014-098，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，當(dāng)空氣質(zhì)量指數(shù)(AQI)＞200 m3/L時，采集PM2.5標(biāo)本。選擇200 mm×250 mm高純度玻璃纖維膜(無膠黏劑)作為濾膜，連續(xù)采集24 h。在采集結(jié)束后，使用鑷子小心取下濾膜，在確認(rèn)濾膜無破裂后，將濾膜的采樣面向里對折。在此過程中注意保持濾面平整，避免顆粒物脫落，以鋁箔包裹后放入密封袋中，然后放置于冰盒中帶入實驗室，在-20℃下 保存?zhèn)溆谩?/p>

3 PM2.5顆粒的洗脫和配制 使用無菌手術(shù)剪把采集好的PM2.5濾膜剪成約1 cm2大小，置于裝有適量滅菌超純水的潔凈燒杯里，以保鮮膜封口后超聲振蕩，選擇功率為500 W，工作頻率40 kHz，超聲時間為15 min×3次，超聲過程中加冰使水溫保持在25 ℃以下。收集洗脫液，用6 ～ 8層無菌紗布濾過，濾出液-80 ℃冷凍下過夜，真空冷干燥成干粉，置于密閉的玻璃容器中，-80℃冰箱保存。稱取適量的PM2.5干粉，經(jīng)紫外線照射30 min，在超凈臺中加入PBS溶液，配制成終濃度為100 mg/mL的PM2.5顆粒母液，充分混勻后置 于4℃冰箱保存。

4 細(xì)胞培養(yǎng) 將BEAS-2B細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1% L-Glutamine、1% Sodium Pyruvate、1%Penicillin-Streptomycin Solution、87% RPMI Medium 1640培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每 天換培養(yǎng)基，隔天按 1∶2的比例傳代。

5 實驗分組 選取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。將實驗細(xì)胞按照不同暴露因素設(shè)為控制對照組、PM2.5組、PM2.5+NAC組。對照組為普通培養(yǎng)基處理16 h；PM2.5組用普通培養(yǎng)基預(yù)處理4 h后再用含有PM2.5的培養(yǎng)基處理12 h；PM2.5+NAC組用含有NAC的培養(yǎng)基預(yù)處理4 h再用含有PM2.5的培養(yǎng)基處理12 h。處理濃度為PM2.5：100 μg/mL，NAC：1 mmol/L，每組設(shè)2個復(fù)孔。處理濃度及時 間綜合國內(nèi)外相關(guān)研究后設(shè)定[8-10]。

6 細(xì)胞凋亡檢測 收集細(xì)胞后，取ANNEXIN VFITC/PI凋亡檢測試劑盒包裝中的Binding Buffer稀釋至1×后重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC輕柔混勻后，在室溫、避光環(huán)境下放置10 min，再加入PI，在室溫、避光環(huán)境下孵育5 min。加入磷酸鹽緩沖液(PBS)輕柔混勻，在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀 進(jìn)行檢測。

7 共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞自噬 收集、接種細(xì)胞，洗滌培養(yǎng)基，4%多聚甲醛孵育10 min，然后用0.5% Triton X-100孵育5 min，加入1%牛血清白蛋白處理1 h，再予LC3b抗體在4℃孵育16 h。然后用Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG在室溫下避光標(biāo)記0.5 h，染色，使用抗淬滅的封片劑進(jìn)行封片，使用共聚焦顯微鏡捕捉熒光圖像，并進(jìn)行 圖像分析。

8 免疫印跡雜交(Western blot) 細(xì)胞總蛋白樣品制備，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，使用硝酸纖維素膜(NC膜)轉(zhuǎn)膜，放置在LC3b抗體、P62抗體和GAPDH (14C10) Rabbit mAb等一抗稀釋液4℃環(huán)境下孵育過夜。然后在Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG的二抗稀釋液中，常溫環(huán)境下孵育1 h。在Immobilon Western HRP底物化學(xué)發(fā)光液中，室溫下孵育3 min。使用Sage creation化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行曝光，處理圖像后 ，進(jìn)行分析。

9 統(tǒng)計學(xué)分析 所有資料采用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以 xˉ±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng) 計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三組支氣管上皮細(xì)胞凋亡率比較 與對照組和PM2.5+NAC組比較，PM2.5組細(xì)胞凋亡明顯增加(P均＜0.05)，而PM2.5+NAC組可明顯抑制PM2.5(100 μg/mL)引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞凋亡(P=0.001)。見 圖1。

2 三組支氣管上皮細(xì)胞自噬比較 與對照組比較，PM2.5組LC3熒光量明顯增加；與PM2.5組比較，PM2.5 + NAC組LC3熒光量明顯減少。結(jié)果說明，PM2.5可以引起支氣管上皮自噬的明顯增加，而NAC可以明顯抑制PM2.5引起的支氣管上 皮細(xì)胞自噬 。見圖2A，圖2B。

3 Western Blot結(jié) 果 比 較 與 對 照 組 比 較，PM2.5組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯增加，P62明顯減少；與PM2.5組比較，PM2.5+NAC組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯減少，P62明顯增加。結(jié)果表明，NAC可以明顯抑制PM2.5引起的支氣管上皮細(xì)胞自噬。見 圖3。

圖 1 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡及定量分析 (aP＜0.05，vs PM2.5+NAC；bP＜0.05，vs PM2.5F ig.1 Flow cytometry. Results of apoptosis and quantification analysis (aP＜0.05, vs PM2.5+NAC; bP＜0.05, vs PM2.5

討 論

慢性呼吸系統(tǒng)炎癥是由于呼吸道持續(xù)暴露于空氣中的微粒(包括PM2.5、香煙煙霧等污染物以及病原體)引起。作為對這些刺激的反應(yīng)，肺采取許多防御機(jī)制，包括上皮屏障、先天及后天免疫。肺上皮是阻止顆粒物進(jìn)入的主要屏障，因此氣道上皮細(xì)胞也是吸入有害顆粒物的主要目標(biāo)。在體外實驗中培養(yǎng)支氣管上皮細(xì)胞，并以各種類型的環(huán)境和實驗室粒子處理細(xì)胞，已成為普遍接受的毒理學(xué)研究方法。研究表明，細(xì)顆粒物中的碳元素、過渡金屬及有機(jī)成分等，可通過氧化損傷等機(jī)制誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞的毒性損傷[11]。香煙煙霧顆?？赏ㄟ^氧化反應(yīng)誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞凋亡，而NAC可抑制香煙煙霧顆粒誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡[12]。相關(guān)研究支持氧化應(yīng)激是PM2.5誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞毒性和癌變的重要機(jī)制這一觀點[13]。PM2.5刺激肺上皮A549細(xì)胞后，導(dǎo)致其發(fā)生氧化應(yīng)激損傷和自噬激活，從而損害肺功能。

本研究中，以PM2.5刺激支氣管上皮細(xì)胞模擬患者的慢性炎癥和上皮功能受損。結(jié)果顯示，NAC可顯著減少炎癥刺激條件下支氣管上皮細(xì)胞的凋亡，并起到保護(hù)作用。NAC的抗氧化應(yīng)激作用已經(jīng)非常明確，其進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生半胱氨酸，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的產(chǎn)生。谷胱甘肽是半胱氨酸殘基形式的活性巰基的載體，通過與活性氧/活性氮和親電試劑相互作用，作為各種酶的輔助因子發(fā)揮抗氧化作用，清除體內(nèi)氧自由基和細(xì)胞毒性物質(zhì)，從而減少有害物質(zhì)對親核生物大分子的損傷[14]。而相關(guān)的臨床實驗和Meta分析也表明，NAC能夠預(yù)防COPD的加重[15]。

圖 2 細(xì)胞自噬熒光圖A：細(xì)胞核的DAPI染色(藍(lán)色)、細(xì)胞骨架的鬼筆環(huán)肽染色(紅色)作為背景染色，LC3熒光呈綠色；B：熒光定量分析(aP＜0.05，vs PM2.5；bP＜0.05，vs PM2.5+NAC)Fig.2 Measurement of autophagy by fluorescent microscopy A: DAPI staining of nuclei (blue) and Phalloidin staining of cytoskeleton (red) were set as the background stain, and LC3 fluorescence was green; B: Quantification analysis (aP＜0.05, vs PM2.5; bP＜0.05, vs PM2.5+NAC)

圖 3 LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、GAPDH定量分析(A。aP＜0.05，vs PM2.5；bP＜0.05，vs PM2.5+NAC)及化學(xué)發(fā)光結(jié)果(B)F ig.3 Quantification analysis (A. aP＜0.05, vs PM2.5; bP＜0.05, vs PM2.5+NAC) and chemiluminescence. Results of LC3Ⅰ, LC3Ⅱ, P62 (B)

有研究表明，自噬在肺的炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，對慢性肺部疾病的感染有較大影響[5,16-18]。自噬包括兩種主要類型：1)典型的自噬，是對細(xì)胞應(yīng)力和(或)營養(yǎng)剝奪的一種穩(wěn)態(tài)反應(yīng)；2)非典型自噬(也被稱為特定自噬，包括線粒體自噬/異體自噬等)，可以控制和抑制慢性炎癥[19]。在COPD發(fā)生發(fā)展過程中，有長期的炎癥和刺激，自噬作用更復(fù)雜。PM2.5暴露介導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞自噬，可以促進(jìn)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，從而引起細(xì)胞的死亡。LC3是自噬標(biāo)志物。在自噬過程中，LC3前體裂解形成胞質(zhì)形式LC3Ⅰ，然后轉(zhuǎn)化生成脂質(zhì)化形式的LC3，即LC3Ⅱ。LC3Ⅱ可以附著于自噬體的膜上，是自噬體的結(jié)構(gòu)蛋白。P62是自噬蛋白。在自噬過程中，P62與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合，再與定位于自噬小體內(nèi)膜上的LC3Ⅱ形成復(fù)合物，然后在自噬溶酶體內(nèi)降解。在自噬增強(qiáng)時，細(xì)胞質(zhì)中的P62不斷被降解；自噬減弱時，P62會在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積。因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加，P62減少，提示自噬增強(qiáng)；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ減少，P62增加，提示自噬減弱。本研究表明，PM2.5暴露可以引起人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B自噬的增強(qiáng)，而NAC可以抑制PM2.5介導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的自噬。

本研究證明，可吸入顆粒物PM2.5可通過誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的凋亡和自噬，致細(xì)胞損傷；NAC可通過調(diào)控人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的凋亡和自噬，減輕細(xì)胞損傷。對自噬途徑的選擇性操控，是調(diào)節(jié)免疫和抑制慢性阻塞性肺病慢性炎癥的一種新思路[20]。