尿酸鹽水解酶假基因在子癇前期胎盤組織的表達(dá)及其分子機(jī)制

李巍巍, 李彥姝

(1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 產(chǎn)科, 遼寧 沈陽, 110001;2. 中國醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽, 110013)

子癇前期是一種以高血壓、蛋白尿、水腫為特征的妊娠特異性疾病，嚴(yán)重威脅胎兒和孕婦的健康[1]。妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[2], 目前觀點(diǎn)認(rèn)為子癇前期患者滋養(yǎng)層細(xì)胞增生及侵襲能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致胎盤淺著床，胎兒生長(zhǎng)受限、胎盤早剝等不良妊娠結(jié)局[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (LncRNA)長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸[4], 參與細(xì)胞增殖、發(fā)育、運(yùn)動(dòng)和死亡等多種生物學(xué)過程，且在多種疾病中異常表達(dá)，與細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲密切相關(guān)[5-6]。尿酸鹽水解酶假基因(URAHP)是一種 LncRNA, 全長(zhǎng)1 379 bp, 能夠促進(jìn)增殖并調(diào)控子癇前期水解酶的表達(dá)。本研究探討URAHP在子癇前期胎盤組織中的異常表達(dá)及其對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增生、侵襲的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年12月—2019年9月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科住院患者6例為研究對(duì)象，其中PE組(實(shí)驗(yàn))納入子癇前期患者3例, Control組(對(duì)照)納入正常妊娠孕婦3例，年齡24～36歲。納入標(biāo)準(zhǔn): 既往無高血壓、糖尿病史患者。子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)全國高等學(xué)校教材第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》。選取3例子癇前期患者及3例正常妊娠孕婦的胎盤組織。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 樣本采集及試劑

待胎盤娩出后，于胎盤中央?yún)^(qū)域取胎盤組織，約1 cm×1 cm(避開鈣化區(qū)域)，置于EP管中，再于-80 ℃冰箱凍存。

胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Waltham; In-Fusion試劑盒購自美國TakaraBio; 逆轉(zhuǎn)錄試劑購自日本Shiga; 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)購買自美國Stratagene LaJolla, 特異性初級(jí)抗體(KISS1R和等負(fù)荷對(duì)照β-actin)、過氧化物酶結(jié)合的次級(jí)抗體購自美國Millipore, Billerica。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人絨毛膜癌JAR細(xì)胞系、JET-3細(xì)胞系、人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo系[購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)]分別接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 siRNA和質(zhì)粒構(gòu)建

在RNAi介導(dǎo)的敲除URAHP中, Invitrogen提供了3種不同的抗URAHP的小干擾RNA(siRNA)。其中, si-URA HP-1的轉(zhuǎn)染效率最高, URAHP的靶序列為5′-UUAGUGCCACCAAAG CUGU-3′。 用In-Fusion試劑盒(TakaraBioUSA, Inc)構(gòu)建了1個(gè)表達(dá)URAHP全長(zhǎng)(1 379 bp)的質(zhì)粒載體，命名為pCDNA-URAHP。 以1個(gè)空載體作為對(duì)照，構(gòu)建了pGM2196-3×URAHP過表達(dá)慢病毒載體和pLenti-GFP-si-URAHP已知的慢病毒載體。

1.5 慢病毒制備

分別用pLenti-GFP-si-URAHP慢病毒載體、陰性對(duì)照載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。待細(xì)胞密度達(dá)到80%濃度時(shí)，將質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中。 離心上清液, 48 h后濃縮病毒。 用病毒感染12孔板中的細(xì)胞，然后用普羅霉素(1.5 μg/mL)篩選，通過qRT-PCR分析鑒定感染細(xì)胞。

1.6 RNA提取與qRT-PCR分析

用TRIzol提取胎盤組織總RNA。根據(jù)說明，在6孔培養(yǎng)板中將人immortal line (HTR-8/SVneo)、人絨毛膜癌細(xì)胞系(JAR和JET-3)生長(zhǎng)到細(xì)胞濃度70%。采用總RNA(500 ng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKARa, Shiga, 日本)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄; 用SYBR綠色染料擴(kuò)增cDNA。在Mx3 000pTM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上，采用Agilent qRT-PCR法檢測(cè)URAHP和內(nèi)標(biāo)β-actinTM的miRNA水平。這些基因的特異性引物信息，見表1。

1.7 免疫印跡法(western blot)

胎盤組織用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，然后在含有蛋白酶抑制劑(PI)混合物的放射免疫沉淀分析(RIPA)溶解，通過SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用特異性初級(jí)抗體(KISS1R和等負(fù)荷對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白)和過氧化物酶結(jié)合的次級(jí)抗體檢測(cè)細(xì)胞膜。用化學(xué)發(fā)光法對(duì)條帶進(jìn)行可視化。用Image J軟件對(duì)western blot進(jìn)行了密度分析，并將定量結(jié)果與加載對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 3D群形成

從培養(yǎng)皿中取出完整的培養(yǎng)基，用1×PBS沖洗細(xì)胞。 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶1～2 min, 細(xì)胞移行良好，得到單細(xì)胞懸液; 200×g震蕩5 min, 在完全培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整到30個(gè)細(xì)胞/mL。 將100 μL(30個(gè)細(xì)胞/mL)細(xì)胞全培養(yǎng)基置于96孔，圓底培養(yǎng)板均勻混合。培養(yǎng)1、3、7 d后，用相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 19.0軟件、GraphPad Prism V6.0軟件。應(yīng)用Studentt檢驗(yàn)(雙尾)評(píng)估細(xì)胞株中URAHP表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 URAHP在子癇前期胎盤中的上調(diào)作用

采用Arraystar人類LncRNA V4.0分析了Control組3例正常妊娠孕婦和PE組3例子癇前期患者胎盤中Lnc RNA和mRNA的表達(dá)(圖1A、B)。 將Control組和PE組胎盤組織樣品進(jìn)行LncRNA分析，共檢測(cè)到585個(gè)lncRNA在胎盤組織中表達(dá)(差異倍數(shù)≥1.5倍)，其中有184個(gè)lncRNA高表達(dá)和491個(gè)lncRNA低表達(dá)。其中l(wèi)ncRNA URAHP高表達(dá)，通過qRT-PCR分析檢測(cè)了URAHP(圖1C), URAHP在PE胎盤中的水平約為正常Control組的4倍(P<0.01), 在滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo和兩個(gè)絨毛膜癌細(xì)胞系JAR和JET-3也檢測(cè)到URAHP的表達(dá)。假基因URAHP在JAR、JET-3細(xì)胞系中的表達(dá)高于HTR-8/SVneo細(xì)胞系(圖1D)。

2.2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析鑒定與URAHP相關(guān)基因

利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中鑒定了78個(gè)基因，并與URAHP的表達(dá)高度相關(guān)。繪制78個(gè)差異表達(dá)的基因熱圖(圖2A), 其中上調(diào)基因25個(gè)，下調(diào)基因53個(gè)。7個(gè)基因(KISS1R、ALPP、DUSP1、RUNX2、TBX15、HBB、ACADVL)與子癇前期進(jìn)展相關(guān)，并繪制基因熱圖(圖2B)GO富集分析分析生物過程、細(xì)胞成分結(jié)果見圖3。

A: 子癇前期胎盤組織差異表達(dá)的lncRNA聚類分析圖;B: 子癇前期胎盤組織差異表達(dá)的mRNA聚類分析圖;C: URAHP在子癇前期、正常妊娠胎盤組織中的表達(dá)；與Control組比較, **P<0.01。D: URAHP在細(xì)胞系HTR-8/SVneo、JAR、JET-3的表達(dá)。與HTR-8/SVneo比較, *P<0.05, **P<0.01。

A: 78個(gè)差異表達(dá)的基因熱圖; B: 7個(gè)PE相關(guān)基因熱圖。

圖3 Web基因本體注釋圖和GO富集分析圖

2.3 URAHP促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖

以URAHP(SHRNA-URAHP)和URAHP過表達(dá)載體(OE-URAHP)為靶點(diǎn)，對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了調(diào)控。用OE-URAHP或空載體(Con)轉(zhuǎn)染HT R-8/SVneo細(xì)胞，并用qRT-PCR測(cè)定URAHP mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，與Control組相比，轉(zhuǎn)染OE-URAHP的細(xì)胞中URAHP表達(dá)顯著升高(圖4A)。 CCK-8試驗(yàn)表明與Control組比較, URAHP過表達(dá)促進(jìn)了OE-URAHP組的細(xì)胞生長(zhǎng) (圖4B)。

A: 轉(zhuǎn)染OE-URAHP的HT R-8/SVneo細(xì)胞中URAHP的表達(dá)；與Control比較, **P<0.01。B: URAHP過表達(dá)對(duì)OE-URAHP組的細(xì)胞生長(zhǎng)影響。與Control比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.4 抑制絨毛膜癌細(xì)胞增殖

采用RNA干擾技術(shù)降低URAHP的表達(dá)水平。將shRNA-URAHP轉(zhuǎn)染到人絨毛癌JAR和JET-3細(xì)胞系中。 結(jié)果表明，與NC組(陰性對(duì)照)相比, shRNA-URAHP對(duì)URAHP的表達(dá)有顯著抑制作用(圖5A、B)。 CCK-8檢測(cè)表明，敲除URAHP顯著抑制人絨毛癌JAR和JET-3細(xì)胞的增殖能力(圖5C、D)。 同時(shí)，轉(zhuǎn)染shRNA-URAHP的JAR和JET-3細(xì)胞的三維菌落大小顯著小于NC組 (圖5E、F)。

A: shRNA-URAHP轉(zhuǎn)染至JAR細(xì)胞系對(duì)URAHP的表達(dá)的影響；與NC比較, **P<0.01。B: shRNA-URAHP轉(zhuǎn)染至JET-3細(xì)胞系中對(duì)URAHP的表達(dá)的影響；與NC比較, *P<0.05。C: 敲低URAHP對(duì)JAR細(xì)胞增殖能力的影響; D: 敲低URAHP對(duì)JET-3細(xì)胞增殖能力的影響;E: 轉(zhuǎn)染shRNA-URAHP對(duì)JAR細(xì)胞的影響; F: 轉(zhuǎn)染shRNA-URAHP對(duì)JET-3細(xì)胞的影響。

2.5 KISS1R是URAHP在子癇前期胎盤中的共表達(dá)基因

Arraystar人類LncRNA V4.0鑒定出205個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs), 其中56個(gè)上調(diào), 149個(gè)下調(diào)。在共表達(dá)基因中, KISS1R、RUNX2、ALPP和PPP5C上調(diào)(折疊變化>3,P<0.05)。qRT-PCR和Western blot 檢測(cè)顯示, KISS1R在子癇前期胎盤中高表達(dá)(圖6A、B)。URAHP過表達(dá)顯著增加了JAR和JET-3細(xì)胞系中KISS1R mRNA和蛋白表達(dá)(圖6C、D、E、F)。

A: KISS1R在子癇前期胎盤的mRNA表達(dá); B: KISS1R在子癇前期胎盤的蛋白表達(dá);C: URAHP過表達(dá)對(duì)JAR細(xì)胞系中KISS1R mRNA表達(dá)的影響;D: URAHP過表達(dá)對(duì)JET-3細(xì)胞系中KISS1R mRNA表達(dá)的影響;E: URAHP過表達(dá)對(duì)JAR細(xì)胞系中KISS1R蛋白表達(dá)的影響;F: URAHP過表達(dá)對(duì)JET-3細(xì)胞系中KISS1R蛋白表達(dá)的影響。與Control比較, *P<0.05, **P<0.01。

3 討 論

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，假基因不斷被發(fā)現(xiàn)[7]。目前研究[8]發(fā)現(xiàn)，許多假基因在基因表達(dá)、基因調(diào)控以及產(chǎn)生基因多樣性等方面可能起到重要作用。假基因可調(diào)控基因表達(dá)，并且在心血管疾病、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4 (OCT4) 作為POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，可維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新[9]。PTEN基因?yàn)榈谝粋€(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、信號(hào)傳導(dǎo)通路，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，假基因在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用，如磷酸甘油激酶1、假基因2(PGK1P2)表達(dá)與蛻膜異常相關(guān)，可能導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。然而假基因的異常表達(dá)和致病機(jī)制在子癇前期中的作用尚未闡明。 因此，發(fā)現(xiàn)與子癇前期相關(guān)的關(guān)鍵假基因可有助于闡明子癇前期的發(fā)病機(jī)制。子癇前期、子癇發(fā)病源于胎盤。正常妊娠時(shí)，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞分化為絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞，子癇前期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力受損，造成“胎盤淺著床”、子宮螺旋動(dòng)脈重鑄極其不足，因蛻膜層血管重鑄，子宮螺旋動(dòng)脈的管徑僅為正常妊娠的1/2, 血管阻力增大，胎盤灌注減少，進(jìn)而引發(fā)子癇前期、子癇。一些因子可通過調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞層生理功能參與子癇前期、子癇的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究通過微陣列發(fā)現(xiàn)，正常妊娠胎盤組織和子癇前期胎盤組織存在差異表達(dá)的LncRNA。假基因URAHP在子癇前期婦女胎盤組織中的表達(dá)顯著增加。 通過qRT-PCR分析驗(yàn)證差異表達(dá)基因URAHP在體外的功能，發(fā)現(xiàn)了LncRNA URAHP在子癇前期胎盤和人絨毛膜癌細(xì)胞系(JAR和JET-3)中異常高表達(dá)。這些結(jié)果預(yù)測(cè)了URAHP的生物學(xué)作用，并表明URAHP與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。URAHP可能在子癇前期發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可調(diào)控人絨毛膜細(xì)胞系的功能，進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力以及影響胎盤著床。功能分析表明, URAHP下調(diào)改變了人絨毛膜癌JAR/JET-3細(xì)胞的增殖能力, URAHP的過表達(dá)促進(jìn)人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖。HTR-8/Svneo是科學(xué)研究中最常使用的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞, URAHP對(duì)其增殖能力具有影響，可推測(cè)URAHP在子癇發(fā)病(胎盤淺著床)過程中可能起到一定作用。但URAHP如何調(diào)控下游靶基因在子癇前期的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

假基因可以與親本基因或其他基因位點(diǎn)相互作用，導(dǎo)致其序列和/或轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的改變[12]。KAPUSTIN R V等[13]研究認(rèn)為KISS1R在子癇前期胎盤組織表達(dá)下調(diào)，與子癇前期的發(fā)病存在相關(guān)性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，URAHP基因與KISS1R共表達(dá)一致，基因表達(dá)下調(diào)與子癇前期的發(fā)生有關(guān)，與KAPUSTIN R V等研究結(jié)果一致。作者將進(jìn)一步研究URAHP調(diào)控GAS8的機(jī)制及URAHP的下游靶基因。

綜上所述，本研究首次證明假基因URAHP可能與子癇前期發(fā)病有關(guān)，且其上調(diào)表達(dá)可能是導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能異常的關(guān)鍵啟動(dòng)子，這可為子癇前期的治療提供理論依據(jù)。