宮頸癌中uc.189的表達及其臨床病理意義

鄧玉霞, 顏 云, 王成海, 於曉平, 盧 丹

(1. 揚州大學臨床醫(yī)學院 婦產科, 江蘇 揚州, 225009;2. 江蘇省寶應縣人民醫(yī)院 婦產科, 江蘇 寶應, 225800;3. 揚州大學醫(yī)學院 病理教研室, 江蘇 揚州, 225009;4. 揚州大學附屬醫(yī)院 健康體檢中心, 江蘇 揚州, 225009)

宮頸癌是最常見的婦科癌癥，該病主要由持續(xù)性宮頸癌人乳頭瘤病毒(HPV)感染導致，目前認為長期宮頸炎會增加HPV感染概率，進而發(fā)生癌變[1]。超保守RNA uc.189是一種非編碼RNA, 定位于人類染色體6p21上。研究[2-3]表明uc.189在女性惡性腫瘤中的表達水平升高，提示該病患者的預后較差。食管癌的uc.189與食管鱗狀細胞癌(ESCC)的浸潤深度、轉移及分期密切相關，但uc.189以外泌體形式對宮頸鱗狀細胞癌影響的研究較少。本研究采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR) 和電鏡檢測uc.189及其外泌體在子宮頸鱗癌細胞的表達情況，探討uc.189的臨床病理學意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

58例子宮頸癌組織及鄰近正常宮頸組織標本均來源于揚州大學附屬醫(yī)院及蘇北人民醫(yī)院婦科手術患者，標本來源時間為 2019年1月—2020年11月，年齡48～73 歲，中位年齡為 61歲。所有患者術前未經(jīng)過放射治療和藥物治療。子宮頸鱗狀細胞癌由揚州大學附屬醫(yī)院病理科醫(yī)師明確診斷。癌癥樣本的實驗運用及臨床參數(shù)的收集均經(jīng)揚州大學醫(yī)學院倫理委員會批準，且患者簽署知情同意書。新鮮子宮頸鱗狀細胞癌組織采集后立即放入液氮罐，于-80 ℃冰箱內長期保存。

1.2 qRT-PCR

首先，萃取子宮頸鱗癌組織總RNA, 通過逆轉錄酶將RNA逆轉錄成cDNA, 然后使用 Takara 生物公司qRT-PCR反應試劑盒。反應體系為50 μL, cDNA為1 μL, 12 × SYBR Premix ExTaqTMII 50 μL, 上下游引物各1 μL, 加水調整反應體系至50 μL, 每組樣本有3組復孔，內參為U6(uc.189和U6的引物序列見表1)。最后在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system儀器上進行qRT-PCR反應，讀取Ct 值，結果以 2-ΔΔCt計算。

表1 熒光定量引物信息表

1.3 外泌體的檢測和驗證

1.3.1 外泌體的電鏡檢測：采用電鏡技術對宮頸癌組織中外泌體進行檢測，將腫瘤組織研磨成粉末溶解于12 mL培養(yǎng)液中，然后與ExoQuickTM試劑盒中的外泌體沉淀液混合，并根據(jù)試劑盒說明書步驟分離外泌體。分離的外泌體用2%戊二醛固定，加載到碳涂層網(wǎng)格上，透射電鏡觀察(放大倍數(shù)250k×)。外泌體計數(shù)方法: 電鏡下對鱗狀細胞癌組和癌旁正常組織的每個組織片隨機取5個視野，統(tǒng)計并計數(shù)外泌體數(shù)量，并比較2組的差異。

1.3.2 外泌體的蛋白免疫印跡法(Western blot)驗證: Western blot實驗步驟參考已經(jīng)發(fā)表的文章中所述[4]。主要使用的驗證抗體有：抗CD9(#ab2215, Abcam公司)、抗CD81(#ab109201, Abcam公司)和內參抗體GAPDH(#2118, CST公司)。

1.4 uc.189外泌體含量與臨床病理參數(shù)相關性分析

對58例宮頸癌患者的臨床病理資料進行整理，包括患者年齡、性別、HPV感染、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期。統(tǒng)計uc.189外泌體的含量與臨床病理參數(shù)的相關性。根據(jù)宮頸鱗癌組織中uc.189外泌體的含量，將其分為高含量組和低含量組，分組依據(jù): 高含量組數(shù)值>對照組數(shù)值，低含量組數(shù)值<實驗對照組數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件對臨床病理數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Microsoft Office Excel 2007軟件數(shù)據(jù)進行繪制。計量資料2組間比較采用配對樣本t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 uc.189在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達情況

采用qRT-PCR對 uc.189 RNA在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達進行檢測。結果表明，相對于58例癌旁正常宮頸黏膜組織(對照組)的(1.12±0.66), uc.189 RNA在宮頸鱗狀細胞癌組織(n=58)中的表達水平為(4.47±1.10), 見圖1A。58例宮頸鱗癌中，有淋巴結轉移41例(轉移組)，無淋巴結轉移17例(非轉移組); 與非轉移組(3.36±0.82)相比, uc.189 RNA在轉移組中的表達水平顯著升高，為(4.92±0.85), 見圖1B。

A: uc.189 RNA在宮頸組織中的表達。與對照組相比, **P<0.01。B: uc.189 RNA在宮頸鱗癌轉移組中的表達。與非轉移組相比, *P<0.05。

2.2 uc.189外泌體電鏡檢測結果

uc.189外泌體是一個圓形或橢圓形囊泡，染色為灰黑色或黑色，直徑為40～100 nm。在宮頸鱗癌組中, uc.189外泌體的數(shù)量為(11.16±5.66)多于對照組的(2.21±1.39), 差異有統(tǒng)計學意義(t=12.51,P<0.01), 見圖2。

A: 外泌體形態(tài)圖(放大倍數(shù)250萬倍); B: 外泌體數(shù)量圖。與對照組比較, ??P<0.01。圖2 宮頸癌中uc.189外泌體形態(tài)和數(shù)量電鏡圖

2.3 uc.189外泌體的驗證

運用qRT-PCR明確外泌體中包含uc.189, 同時運用Western blot驗證灰黑色圓形或橢圓形囊泡是外泌體，主要是檢測外泌體的標志物CD9和CD81。實驗結果顯示，宮頸鱗癌組織的外泌體含有豐富的uc.189 RNA, 與對照組相比，宮頸鱗癌組的外泌體中uc.189 RNA的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖3A。Western blot 實驗檢測出外泌體的標志物CD9和CD81, 內參為GAPDH, 見圖3B, 外泌體中CD9和CD81的蛋白量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述結果說明，宮頸癌細胞能產生豐富的uc.189外泌體，參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。

2.4 uc.189外泌體含量與臨床病理參數(shù)的相關性

分析結果顯示, uc.189外泌體的高含量組與分化程度(P=0.004)、淋巴結轉移(P=0.001)、TNM分期(P=0.003)密切相關，而uc.189外泌體的高含量組與患者的年齡(P=0.781)、HPV感染(P=0.397)和腫瘤大小(P=0.252)均無關聯(lián)，見表2。

表2 宮頸鱗癌組織中uc.189外泌體的含量及其意義

3 討 論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一[1], 是由子宮頸慢性炎逐漸癌變轉化而來。研究[4]表明該病與HPV感染有關。轉移和復發(fā)往往是宮頸癌患者預后不良的主要原因，具體的癌變機制目前還未徹底闡明。因此，研究宮頸癌的發(fā)生機理、尋找診斷指標和治療靶點變得尤為重要。外泌體是由細胞分泌到細胞外的內源性盤狀囊泡[5], 內容含有各種RNA 和蛋白質，直徑40～100nm[6-9]。在正常及病理狀態(tài)下，正常細胞和惡性腫瘤細胞均可分泌外泌體[10-11]。這種細胞外囊泡可在細胞之間傳遞通訊信息，并能作為膜和細胞溶質蛋白、脂質和RNA細胞之間的載體[12]。目前，已知外泌體的功能包括參與機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等方面[13-14]。

A: 對照組和宮頸癌組uc.189 RNA表達水平圖; B: Western blot 檢測外泌體標志物圖。與對照組比較, ?P<0.05。圖3 uc.189外泌體的驗證

本研究通過qRT-PCR實驗得出, 58例宮頸鱗癌組織中uc.189表達水平顯著上調，轉移組中uc.189表達水平顯著更高，說明uc.189可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，是一種新的促癌基因。電鏡觀察結果顯示，在宮頸鱗癌組織中有大量圓形或橢圓形囊泡，染色為灰黑色或黑色，直徑為30～100 nm, 符合外泌體的形態(tài)特點。qRT-PCR實驗得出宮頸癌外泌體中的uc.189含量豐富，同時Western blot結果表明外泌體標志物CD9和CD81的存在，驗證了圓形或橢圓形囊泡即為uc.189外泌體。此外，電鏡觀察外泌體計數(shù)顯示，在宮頸鱗癌組織中外泌體的數(shù)量顯著多于癌旁正常組織，說明宮頸癌能產生豐富的uc.189外泌體，可能參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展。本研究統(tǒng)計分析了uc.189外泌體的含量與患者臨床病理參數(shù)的相關性。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明uc.189外泌體高含量組與宮頸鱗癌的分化程度、淋巴結轉移和TNM分期密切相關，即uc.189外泌體的含量越多，宮頸鱗癌的分化程度越低，癌細胞惡性程度越高; uc.189外泌體的含量越多，癌細胞越容易從宮頸旁淋巴結轉移，更易出現(xiàn)遠處轉移，且患者的預后越差，死亡率越高。這一結果提示uc.189外泌體可能作為宮頸鱗癌檢測和預后判斷的一種新指標。

綜上所述，本實驗探討uc.189外泌體在宮頸癌中的檢測情況及與患者的臨床病理意義，為下一步研究其功能性變化提供理論基礎，也為宮頸癌的診斷和治療提供新的研究策略。