LINC00909靶向miR-365a-5p/FGFBP1分子軸調(diào)控結(jié)腸癌細胞增殖、遷移及侵襲的實驗研究

倪志強，王永恒，彭書旺，段珊珊，袁正泰

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是我國主要癌癥負擔之一，隨著人們生活水平的提高以及飲食、生活方式的改變，CRC發(fā)病率及死亡率呈逐年增加的趨勢[1]。雖然CRC的診療方法取得一定進展，但晚期CRC患者的預后仍然較差，這主要與CRC的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥有關(guān)[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個核苷酸且無蛋白編碼能力的一類轉(zhuǎn)錄本，其在人類癌癥進展中擔當著調(diào)控因子的角色[3]。研究顯示，LINC00909在膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，LINC00909高表達與病理分期晚、預后差相關(guān)，下調(diào)LINC00909可抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移及侵襲，從而抑制體內(nèi)腫瘤生長[4]。有研究指出,CRC患者血漿中LINC00909表達水平升高，提示LINC00909可作為CRC臨床診斷及預后監(jiān)測的潛在腫瘤標志物[5-6]。但LINC00909在CRC發(fā)生發(fā)展中的作用機制目前尚不清楚。本研究通過檢測結(jié)腸癌細胞中LINC00909表達水平，并研究下調(diào)LINC00909表達對結(jié)腸癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，探索LINC00909的潛在靶基因及可能機制，以期為結(jié)腸癌的基因治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

正常結(jié)腸上皮細胞NCM460、結(jié)腸癌細胞HCT8、Caco-2及DLD-1均購自中國科學院上海細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗均購自武漢普諾賽生命科技公司；TRizol試劑、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taqman Universal Master Mix Ⅱ購自美國Invitrogen公司；Prime Script Ⅱ第一鏈合成試劑盒、SYBR green master mix購自大連Takara公司；miRNA模擬物(miRNA mimics)、miRNA抑制物(anti-miRNA)、小干擾RNA(si-RNA)、熒光素酶報告基因載體均購自上海生工公司；細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit，CCK)-8購自上海碧云天生物研究所；Transwell小室及基質(zhì)膠購自美國康寧公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購自美國Sigma公司；增強型化學發(fā)光試劑盒、鼠源成纖維細胞生長因子結(jié)合蛋白1(fibroblast growth factor binding protein 1，F(xiàn)GFBP1)抗體、兔源細胞周期素D1(Cyclin D1)抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2抗體、兔源MMP9抗體、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG均購自上海艾博抗公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) NCM460、HCT8及DLD-1細胞均采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，Caco-2細胞采用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗。培養(yǎng)條件為含5%CO2的37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱。待細胞融合度達80%時，加入胰酶消化后按1∶2比例傳代。每周換液2～3次。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LINC00909、miR-365a-5p及FGFBP1mRNA相對表達量 用TRizol試劑提取NCM460、HCT8、Caco-2及DLD-1細胞總RNA。為檢測LINC00909及FGFBP1 mRNA表達量，利用Prime Script Ⅱ第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR green master mix于實時PCR系統(tǒng)上進行RT-qPCR。為檢測miR-365a-5p mRNA表達量，用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用Taqman Universal Master Mix Ⅱ進行RT-qPCR。用2-ΔΔCt法檢測LINC00909、miR-365a-5p及FGFBP1mRNA的相對表達水平。miR-365a-5p正向引物5′-CTGAGGGACTTTTGGGGGCAG-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；β-actin正向引物5′-CTACGTCGCCCTGGACTTCGAGC-3′，反向引物5′-GATGGAGCCGCCGATCCACACGG-3′；FGFBP1正向引物5′-CTTCACAGCAAAGTGGTCTCA-3′，反向引物5′-GACACAGGAAAATTCATGGTCCA-3′；LINC00909正向引物5′-AAAACGGAGAGCCGAAGGAG-3′，反向引物5′-TAGCATTCTCGCCTTGCACA-3′。

1.2.3 轉(zhuǎn)染及實驗分組 取2×105個對數(shù)生長期HCT8細胞接種于24孔板，當細胞融合度達60%時，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipfectamine 2000進行瞬時轉(zhuǎn)染。研究抑制LINC00909表達對HCT8細胞增殖、遷移及侵襲的影響時，分為si-NC組、si-LINC00909組；研究過表達miR-365a-5p對HCT8細胞增殖、遷移及侵襲的影響時，分為miR-NC組、miR-365a-5p組；研究抑制FGFBP1表達對HCT8細胞增殖、遷移及侵襲的影響時，分為si-NC組、si-FGFBP1組；研究LINC00909調(diào)控miR-365a-5p對HCT8細胞增殖、遷移及侵襲的影響時，分為si-NC+anti-miR-NC組、si-NC+anti-miR-365a-5p組、si-LINC00909+anti-miR-NC組、si-LINC00909+anti-miR-365a-5p組研究LINC00909調(diào)控miR-365a-5p/FGFBP1分子軸。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：取20 pmol轉(zhuǎn)染載體或片段溶于50 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，記為混合物A。取1 μl Lipfectamine 2000溶于50 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，記為混合物B。混勻后于室溫放置5 min，將混合物A及B混合后放置20 min。培養(yǎng)6 h后更換含血清新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，胰酶消化收集各組細胞，按照RT-qPCR步驟檢測轉(zhuǎn)染效果，合格后進行后續(xù)分析。

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞活力 取各轉(zhuǎn)染組的5×103個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，按照CCK-8使用說明書向各孔內(nèi)加入10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定各孔在450 nm處的光密度(OD450 nm)。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力 取600 μl血清含量為10%的細胞培養(yǎng)液加入到24孔板下腔室，取200 μl約含有6×104個細胞的無血清培養(yǎng)基添加到Transwell上室。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，去除非遷移細胞，固定、染色、成像。選取任意5個視野，對遷移細胞數(shù)量進行量化分析，以均值表示遷移細胞數(shù)。侵襲實驗時采用預先包被基質(zhì)膠的Transwell小室，加入細胞培養(yǎng)液水化后備用，其余步驟同遷移實驗。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測FGFBP1、Cyclin D1、MMP2及MMP9蛋白表達量 用預冷的RIPA緩沖液孵育細胞30 min，于4 ℃以1 000 r/min離心15 min后，棄去細胞碎片，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品先用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。依次對膜進行5%脫脂乳封閉、一抗孵育及二次雜交，用增強型化學發(fā)光試劑盒觀察蛋白印跡。以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?用LncBase Predicted v.2預測LINC00909和miR-365a-5p的結(jié)合位點，targetscan預測miR-365a-5p和FGFBP1的結(jié)合位點。將含有miR-365a-5p結(jié)合位點的野生型(WT)LINC00909序列、野生型FGFBP1-3′-UTR序列及突變型(MUT)LINC00909序列、突變型FGFBP1-3′-UTR序列克隆到雙熒光素酶報告質(zhì)粒，構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體WT-LINC00909、MUT-LINC00909、WT-FGFBP1、MUT-FGFBP1。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將WT-LINC00909、MUT-LINC00909、WT-FGFBP1、MUT-FGFBP1分別與miR-NC、miR-365a-5p mimics共轉(zhuǎn)染HCT8細胞，48 h后用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)檢測各組細胞的雙熒光素酶活性。同時將pcDNA-NC、pcDNA-LINC00909、si-NC、si-LINC00909分別轉(zhuǎn)染HCT8細胞，用RT-qPCR法檢測miR-365a-5p的相對表達量。將miR-NC、miR-365a-5p、anti-miR-NC、anti-miR-365a-5p分別轉(zhuǎn)染HCT8細胞，Western blotting法檢測FGFBP1蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌細胞與正常結(jié)腸上皮細胞中LINC00909、miR-365a-5p、FGFBP1的mRNA表達及FGFBP1蛋白表達水平比較

與正常結(jié)腸上皮細胞NCM460比較，結(jié)腸癌細胞HCT8、Caco-2、DLD-1中LINC00909 mRNA、FGFBP1mRNA及FGFBP1蛋白表達水平升高，miR-365a-5p mRNA表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western blotting檢測4種細胞中FGFBP1蛋白的表達

2.2 抑制LINC00909表達對HCT8細胞增殖、遷移及侵襲的影響

與si-NC組比較，si-LINC00909組HCT8細胞中LINC00909、Cyclin D1、MMP2及MMP9的表達水平顯著降低，細胞活力、遷移及侵襲細胞數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖2。

2.3 過表達miR-365a-5p對HCT8細胞增殖、遷移及侵襲的影響

與miR-NC組比較，miR-365a-5p組HCT8細胞miR-365a-5p表達水平顯著升高，細胞活力、遷移及侵襲細胞數(shù)顯著降低，Cyclin D1、MMP2及MMP9蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3、表3。

2.4 抑制FGFBP1表達對HCT8細胞增殖、遷移及侵襲的影響

與si-NC組比較，si-FGFBP1組HCT8細胞FGFBP1、Cyclin D1、MMP2及MMP9蛋白表達水平顯著降低，細胞活力、遷移及侵襲細胞數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4、表4。

表1 各細胞系中LINC00909、FGFBP1及miR-365a-5p表達水平比較

表2 抑制LINC00909表達對HCT8細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響

2A：Transwell檢測si-NC組細胞的遷移圖(×200)；2B：Transwell檢測si-LINC00909組細胞的遷移圖(×200)；2C：Transwell檢測si-NC組細胞的侵襲圖(×200)；2D：Transwell檢測si-LINC00909組細胞的侵襲圖(×200)；2E：Western blotting檢測Cyclin D1、MMP2及MMP9蛋白表達圖2 抑制LINC00909表達對HCT8細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響

3A：Transwell檢測miR-NC組細胞的遷移圖(×200)；3B：Transwell檢測miR-365a-5p組細胞的遷移圖(×200)；3C：Transwell檢測miR-NC組細胞的侵襲圖(×200)；3D：Transwell檢測miR-365a-5p組細胞的侵襲圖(×200)；3E：Western blotting檢測Cyclin D1、MMP2及MMP9蛋白表達圖3 過表達miR-365a-5p對HCT8細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白的影響

4A：Transwell檢測si-NC組細胞的遷移圖(×200)；4B：Transwell檢測si-FGFBP1組細胞的遷移圖(×200)；4C：Transwell檢測si-NC組細胞的侵襲圖(×200)；4D：Transwell檢測si-FGFBP1組細胞的侵襲圖(×200)；4E：Western blotting檢測FGFBP1、Cyclin D1、MMP2及MMP9蛋白表達圖4 抑制FGFBP1表達對HCT8細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響

表3 過表達miR-365a-5p對HCT8細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響

表4 抑制FGFBP1表達對HCT8細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響

2.5 LINC00909靶向調(diào)控miR-365a-5p表達，miR-365a-5p靶向調(diào)控FGFBP1表達

序列分析發(fā)現(xiàn)miR-365a-5p與LINC00909、FGFBP1-3′-UTR區(qū)域存在互補結(jié)合位點，見圖5A及5B。與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-365a-5p mimics能顯著降低WT-LINC00909及WT-FGFBP1的相對熒光素酶活性(P<0.05)；而MUT-LINC00909及MUT-FGFBP1的相對熒光素酶活性無顯著變化，見表5。pcDNA-LINC00909組HCT8細胞中miR-365a-5p的表達(0.45±0.04)較pcDNA-NC組(1.00±0.12)顯著降低；si-LINC00909組HCT8細胞miR-365a-5p的表達(1.40±0.12)較si-NC組(1.02±0.09)顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-365a-5p組HCT8細胞FGFBP1蛋白的表達(0.40±0.04)較miR-NC組(0.93±0.09)顯著降低；anti-miR-365a-5p組HCT8細胞FGFBP1蛋白的表達(1.29±0.11)較anti-miR-NC組(0.95±0.07)顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，圖5C。

5A：LncBase Predicted v.2對miR-365a-5p與LINC00909結(jié)合進行預測示意圖；5B：targetscan對FGFBP1與miR-365a-5p結(jié)合進行預測示意圖；5C：Western blotting檢測FGFBP1蛋白表達圖5 LINC00909靶向miR-365a-5p，miR-365a-5p靶向FGFBP1

表5 miR-NC組與miR-365a-5p組的熒光素酶活性比較

2.6 抑制miR-365a-5p表達能夠逆轉(zhuǎn)抑制LINC00909對HCT8細胞增殖、遷移及侵襲的影響

與si-NC+anti-miR-NC組比較，si-NC+anti-miR-365a-5p組HCT8細胞miR-365a-5p的表達顯著降低，細胞活力、遷移及侵襲細胞數(shù)顯著升高，Cyclin D1、MMP2及MMP9蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與si-LINC00909+anti-miR-NC組比較，si-LINC00909+anti-miR-365a-5p組HCT8細胞miR-365a-5p的表達顯著降低，細胞活力、遷移及侵襲細胞數(shù)顯著升高，Cyclin D1、MMP2及MMP9蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6、表6。

3 討論

CRC的發(fā)生發(fā)展涉及一系列的遺傳及表觀遺傳變化。lncRNA作為人類基因組的主要組成部分，其通過在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等不同水平調(diào)控基因表達，與CRC細胞增殖、侵襲以及腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。探討LINC00909在CRC細胞增殖、遷移及侵襲中的作用，有望為CRC基因治療提供潛在靶點。

本研究首先檢測LINC00909在結(jié)腸癌細胞中的表達水平，結(jié)果顯示結(jié)腸癌細胞中LINC00909表達水平顯著高于正常結(jié)腸上皮細胞NCM460，提示LINC00909高表達可能與結(jié)腸癌細胞的惡性生物學行為有關(guān)。選擇HCT8細胞進行功能驗證結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-LINC00909抑制LINC00909表達可降低HCT8細胞的活力、遷移及侵襲細胞數(shù)，并降低促增殖蛋白Cyclin D1、促遷移及侵襲蛋白MMP2及MMP9的表達水平，這表明抑制LINC00909表達對HCT8細胞的增殖、遷移及侵襲具有顯著抑制作用。與本研究結(jié)論類似，Ma等[8]研究發(fā)現(xiàn)，急性髓系白血病中LINC00909也呈高表達，LINC00909水平升高與細胞遺傳學及預后較差有關(guān)，抑制LINC00909表達可降低癌細胞的存活率，減弱癌細胞的遷移及侵襲能力，并誘導細胞凋亡。以上結(jié)果表明，抑制LINC00909表達可有效抑制HCT8細胞的增殖、遷移及侵襲。

近期研究表明，lncRNA可發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA作用，其通過吸附miRNA而減弱miRNA對靶基因的負調(diào)控作用，間接調(diào)控靶基因的表達水平，最終參與腫瘤調(diào)控過程[9-10]。為探討LINC00909在結(jié)腸癌中的作用機制，本研究通過序列分析發(fā)現(xiàn)miR-365a-5p是其潛在靶點。既往研究表明，非小細胞肺癌中miR-365a-5p表達降低，過表達miR-365a-5p通過靶向PELI3從而抑制腫瘤細胞活力、集落形成、遷移及侵襲能力[11]。抑制環(huán)狀RNA0058097(circRNA_0058097)通過上調(diào)miR-365a-5p進而抑制有效增強終板軟骨細胞的抗應激能力，保護終板軟骨退變[12]。然而，miR-365a-5p在結(jié)腸癌中的作用尚不清楚。本研究顯示結(jié)腸癌細胞中miR-365a-5p表達降低，轉(zhuǎn)染miR-365a-5p mimics升高miR-365a-5p表達水平可減弱HCT8細胞的增殖、遷移及侵襲能力，降低Cyclin D1、MMP2及MMP9表達水平。此外，轉(zhuǎn)染miR-365a-5p mimics還可降低WT-LINC00909的雙熒光素酶活性，且過表達miR-365a-5p能夠逆轉(zhuǎn)抑制LINC00909對HCT8細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用，進一步說明了LINC00909通過調(diào)控miR-365a-5p表達在結(jié)腸癌中發(fā)揮致癌作用。

6A：Transwell檢測si-NC+anti-miR-NC組細胞的遷移圖(×200)；6B：Transwell檢測si-NC+anti-miR-365a-5p組細胞的遷移圖(×200)；6C：Transwell檢測si-LINC00909+anti-miR-NC組細胞的遷移圖(×200)；6D：Transwell檢測si-LINC00909+anti-miR-365a-5p組細胞的遷移圖(×200)；6E：Transwell檢測si-NC+anti-miR-NC組細胞的侵襲圖(×200)；6F：Transwell檢測si-NC+anti-miR-365a-5p組細胞的侵襲圖(×200)；6G：Transwell檢測si-LINC00909+anti-miR-NC組細胞的侵襲圖(×200)；6H：Transwell檢測si-LINC00909+anti-miR-365a-5p組細胞的侵襲圖(×200)；6I：Western blotting檢測Cyclin D1、MMP2及MMP9蛋白表達圖6 抑制miR-365a-5p表達能夠逆轉(zhuǎn)抑制LINC00909對HCT8細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響

表6 抑制miR-365a-5p表達能夠逆轉(zhuǎn)抑制LINC00909對HCT8細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響

為探討miR-365a-5p下游的潛在靶基因，本研究進行生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFBP1與miR-365a-5p之間存在部分連續(xù)結(jié)合位點。FGFBP1是一種伴侶蛋白，其激活儲存在細胞外基質(zhì)中且具有副分泌功能的成纖維細胞因子(FGFs)，并將其呈現(xiàn)給相關(guān)受體，增強FGFs活性[13]。研究顯示，胰腺癌、肝癌、非小細胞肺癌中FGFBP1表達明顯增高，F(xiàn)GFBP1除參與腫瘤血管生成外，其上調(diào)還促進了腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移[13-16]。本研究結(jié)果顯示，HCT8細胞中FGFBP1表達增加，抑制FGFBP1表達可降低HCT8細胞的增殖、遷移及侵襲能力，與Schulze等[17]抑制FGFBP1表達可誘導結(jié)腸癌細胞凋亡、抑制腫瘤生長的結(jié)論類似。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-365a-5p對FGFBP1具有靶向負調(diào)控作用，進一步表明LINC00909通過調(diào)控miR-365a-5p/FGFBP1分子軸在結(jié)腸癌中發(fā)揮作用。

綜上所述，LINC00909在結(jié)腸癌細胞中表達上調(diào)，LINC00909通過負調(diào)控miR-365a-5p/FGFBP1分子軸促進了結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲。因此，LINC00909/miR-365a-5p/FGFBP1網(wǎng)絡可能成為結(jié)腸癌基因治療的潛在靶點。