Ⅰ型膠原α2、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原表達(dá)與食管鱗癌的相關(guān)性研究

邢應(yīng)如，阿布都色麥爾·熱依木，張雪，胡萬(wàn)發(fā)，苗傳龍，吳靜，胡東

食管鱗癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一[1]，由于其侵襲性強(qiáng)、生存率低，被認(rèn)為是惡性程度最高的腫瘤之一[2-3]。臨床研究證實(shí)胃食管反流病、吸煙和酗酒可導(dǎo)致食管鱗癌[4]。隨著蛋白和基因組學(xué)的迅速發(fā)展，鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(squmaous cell carcinoma antigen，SCCAg)、糖類抗原-199(CA-199)等生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，提高了早期食管癌的診斷[5]。SCCAg是鱗狀細(xì)胞癌特異性的腫瘤標(biāo)志物，其與食管鱗癌臨床病理特征關(guān)系的探索，對(duì)促進(jìn)食管鱗癌的診斷及治療具有重要意義。Ⅰ型膠原α2(collagen type I alpha 2，COL1A2)基因編碼Ⅰ型膠原的α2鏈，Rong等[6]利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，COL1A2是胃癌37個(gè)差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，COL1A2蛋白可作用于細(xì)胞骨架并調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。此外，COL1A2表達(dá)失衡與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，可參與胃癌和胰腺癌的發(fā)生[6-7]。目前COL1A2在食管鱗癌中的表達(dá)及其作用尚不明確。本研究旨在探討COL1A2基因和SCCAg在食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集安徽理工大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2018年2月至2021年1月食管鱗癌患者的臨床病理資料、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果和石蠟?zāi)[瘤標(biāo)本，共計(jì)49例，其中女11例，男38例，中位年齡73(50～86)歲。臨床干預(yù)治療前SCCAg的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果35例；癌旁正常食管組織標(biāo)本18例；食管鱗癌組織標(biāo)本49例，其中65歲及以下14例，65歲以上35例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者31例；高分化8例，中低分化41例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期30例，Ⅲ、Ⅳ期19例。標(biāo)本使用征得患者或其家屬同意，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)發(fā)光發(fā)法 收集患者治療前空腹全血，離心取血清上化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)CEA、SCCAg(IVD，新產(chǎn)業(yè))，檢測(cè)項(xiàng)目每日質(zhì)控在控，結(jié)果方可發(fā)出。

1.2.2 免疫組化法 連續(xù)組織切片，厚度4 μm，脫蠟，乙醇水化，抗原修復(fù)于熱枸櫞酸鹽緩沖液中，于1∶200稀釋的抗COL1A2一級(jí)抗體(Cat: ab96723,Abcam)中封閉4 ℃過(guò)夜，封HRP標(biāo)記二級(jí)抗體(Cat: KGAA35，凱基生物)，DAB染色，蘇木精復(fù)染，中性膠密封。

1.2.3 Western Blot 取正常食管組織或食管鱗癌組織約50 mg，充分研磨， RIPA解液充分裂解，10 000 r/min，4 ℃離心5 min，分離上清加入上樣緩沖液，混勻上樣進(jìn)行凝膠電泳。轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，1%BSA溶液中封閉。COL1A2單克隆抗體(1∶2 000)4 ℃封閉過(guò)夜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 500，1 h)，制備ECL，以β-actin為內(nèi)參。凝膠成像分析COL1A2與β-actin條帶，分析COL1A2相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析COL1A2在腫瘤中的表達(dá)，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析本研究涉及的COL1A2在食管鱗癌中的表達(dá)，闡明COL1A2與TNM分期的關(guān)系，基于此數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析COL1A2差異表達(dá)與食管鱗癌患者生存時(shí)間的關(guān)系。在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出食管鱗癌差異表達(dá)基因，將基因表達(dá)矩陣導(dǎo)入基因集富集分析(GSEA)軟件，MSigDB選擇KEGG和GO聚集，隨機(jī)組合1 000次，校正富集分?jǐn)?shù)(NES)>1，篩選富集結(jié)果。

1.3 結(jié)果判斷

根據(jù)染色程度評(píng)分：0分(無(wú)染色)、1 分(淺棕色弱陽(yáng)性)、2分(棕色的中度陽(yáng)性)和3分(深棕色的強(qiáng)陽(yáng)性)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比評(píng)分：0分(0～5%區(qū)域陽(yáng)性)，1分(6%～25%區(qū)域陽(yáng)性)，2分(26%～50%區(qū)域陽(yáng)性)，3分(51%～75%區(qū)域陽(yáng)性)，4分(76%～100%區(qū)域陽(yáng)性)。評(píng)分結(jié)果乘積：0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)；其中，≤4分為COL1A2低表達(dá)，>4分為COL1A2高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS17.0軟件分析，t檢驗(yàn)分析組間計(jì)數(shù)資料的差異，χ2檢驗(yàn)分析各組間率的差異。P<0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析COL1A2在腫瘤中的表達(dá)及食管鱗癌分期相關(guān)性

TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)應(yīng)正常組織相比，COL1A2基因在多種腫瘤中高表達(dá)，COL1A2在食管癌(esophageal carcinoma,ESCA)中表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析也證實(shí)，COL1A2在食管鱗癌中的表達(dá)較正常組織高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。COL1A2的表達(dá)與食管鱗癌TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，圖2B)。

2.2 食管鱗癌患者血清中SCCAg的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

SCCAg在食管鱗癌患者中的陽(yáng)性率為48.6%(17/35，參考值: 2.5 ng/ml)，在高分化食管鱗癌患者血清中增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)，與其它臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。

注：*為SCCAg的表達(dá)在高分化鱗癌組高于中低分化鱗癌組(P<0.05)圖3 血清SCCAg在高分化鱗癌組與中低分化鱗癌組中的結(jié)果分析

2.3 免疫組化分析COL1A2在不同食管組織中的表達(dá)

對(duì)食管鱗癌(49例)以及癌旁正常食管組織(18例)進(jìn)行免疫組化染色分析，發(fā)現(xiàn)正常食管組織中COL1A2表達(dá)水平極低或不表達(dá)，而在食管鱗癌中高表達(dá)，見(jiàn)圖4。食管鱗癌組織COL1A2陽(yáng)性率及強(qiáng)陽(yáng)性率均高于正常食管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖4 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)COL1A2蛋白在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)(DAB顯色，蘇木精復(fù)染)

表1 COL1A2蛋白在食管鱗癌及正常食管組織中的表達(dá)

2.4 Western Blot分析COL1A2在不同食管組織中的表達(dá)

用Western Blot法檢測(cè)COL1A2在不同食管組織中的表達(dá)。COL1A2和β-actin的分子量分別為129 kda和42 kda。用image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，分別計(jì)算食管組織和正常食管組織中COL1A2和β-actin蛋白條帶灰度值，兩者相比，得出COL1A2相對(duì)于β-actin的表達(dá)水平。結(jié)果表明，食管鱗癌COL1A2基因的表達(dá)水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

注:為COL1A2在食管鱗癌組織表達(dá)高于正常食管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)圖5 COL1A2在食管鱗癌和正常食管組織表達(dá)水平比較

2.5 COL1A2蛋白高表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

COL1A2高表達(dá)與食管鱗癌臨床分期以及腫瘤組織分化程度相關(guān)，但與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。中低分化食管鱗癌組織中COL1A2表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性率(80.5%,33/41)高于高分化組織(37.5% ,3/8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；晚期(Ⅲ、Ⅳ期)食管鱗癌組織中COL1A2強(qiáng)陽(yáng)性率(89.5%,17/19)高于早期(Ⅰ、Ⅱ期)(63.3%，19/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.6 COL1A2蛋白過(guò)表達(dá)與食管鱗癌預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)分析，COL1A2高表達(dá)食管鱗癌患者的無(wú)瘤生存率(圖6A)低于COL1A2低表達(dá)患者(P<0.05)，但兩者總生存率無(wú)差異(圖6B)。

2.7 差異基因KEGG通路及GO分析

差異基因KEGG通路和GO分析為探討差異基因在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，將差異基因?qū)隚SEA中，對(duì)差異基因的KEGG途徑分析表明，差異基因主要集中在粘著斑通路(圖7A)。選擇GO分析最顯著的富集和分布，主要包括細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組分(圖7B)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織(圖7C)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔(圖7D)。

表2 COL1A2蛋白過(guò)表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

3 討論

SCCAg是食管鱗癌分化的指標(biāo)。SCCAg作為食管癌術(shù)后化療療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)，SCCAg<1.5 ng/ml患者總生存率升高[8]。同時(shí)，SCCAg水平可預(yù)測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，AUC分別為0.650(P=0.007)[9]。SCCAg在組織學(xué)高分化型腫瘤患者血清中的濃度高于低分化型，與正常上皮表達(dá)完整形式的SCCAg不同，高度分化的食管癌過(guò)度表達(dá)裂解形式的SCCAg2，增強(qiáng)鱗癌的侵襲性[10]。本研究結(jié)果中，SCCAg對(duì)食管鱗癌診斷敏感性為48.6%，且高分化鱗癌患者血清中SCCAg高于中、低分化者，表明血清SCCAg的高表達(dá)對(duì)食管鱗癌診斷及其組織學(xué)分化程度預(yù)測(cè)有一定的應(yīng)用價(jià)值。

COL1A2基因位于染色體7q22.1上，由52個(gè)外顯子和非編碼部分組成[11]。其編碼的前膠原α2鏈，是Ⅰ型膠原分子的組成成分。COL1A2是人體含量最高、表達(dá)最廣泛的蛋白質(zhì)，它發(fā)揮基質(zhì)結(jié)構(gòu)骨架的功能，是大多數(shù)實(shí)體瘤的間質(zhì)部分[12]。細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境中所含的這種特殊的基質(zhì)成分對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起著重要作用，在多種腫瘤中表現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)。COL1A2高甲基化也發(fā)生在惡性黑色素瘤[13]和膀胱腫瘤中，并誘導(dǎo)膀胱癌的增殖及侵襲[14]，表明COL1A2在腫瘤進(jìn)展中的作用不可忽視。然而，通過(guò)慢病毒對(duì)COL1A2基因的過(guò)度表達(dá)，發(fā)現(xiàn)COL1A2過(guò)表達(dá)能夠?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲進(jìn)行抑制[15]，說(shuō)明COL1A2蛋白在不同的癌癥中起著不同的作用。目前，COL1A2蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。

圖6 用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析COL1A2表達(dá)與患者無(wú)瘤生存率(6A)及總體生存率(6B)的關(guān)系

注:7A為粘著斑通路；7B為差異表達(dá)的基因富集于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組分；7C為差異表達(dá)的基因富集于細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織；7D為差異表達(dá)的基因富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔圖7 COL1A2在食管鱗癌中的富集情況

本研究中，通過(guò)TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示COL1A2在包括膽管癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、肝細(xì)胞肝癌和肺鱗癌等癌癥類型中，與其對(duì)應(yīng)的正常組織相比發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，在食管鱗癌中COL1A2的表達(dá)明顯較正常組織高，這與本研究結(jié)果一致，免疫組化顯示食管鱗癌組織COL1A2強(qiáng)陽(yáng)性率(73.5%)明顯高于正常食管組織(5.6%)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析關(guān)于COL1A2在食管鱗癌TNM分期中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)COL1A2表達(dá)與TNM分期有關(guān)(P=0.003)。COL1A2的過(guò)度表達(dá)與食管鱗癌的分化程度(P=0.012)和臨床分期(P=0.043)密切相關(guān)，表示隨著食管鱗癌的進(jìn)展，COL1A2的表達(dá)水平也逐漸增加，這與Rong等[6]在胃癌中COL1A2表達(dá)結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，COL1A2蛋白可能在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，COL1A2高表達(dá)食管鱗癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期低于COL1A2低表達(dá)患者(P<0.05)，但兩者的總生存期無(wú)顯著差異。以上結(jié)果預(yù)示，COL1A2的表達(dá)水平可能是評(píng)估食管鱗癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志之一。

本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載食管鱗癌GDS3838芯片數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)進(jìn)行差異基因表達(dá)分析篩選出482個(gè)差異基因。對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集分析，這些差異基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織，是在細(xì)胞水平上進(jìn)行的過(guò)程，涉及細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外部空間的結(jié)構(gòu)組裝、排列或結(jié)構(gòu)分解。細(xì)胞外基質(zhì)的正常合成和降解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，基因表達(dá)失衡時(shí)，可引發(fā)腫瘤的發(fā)生。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與粘著斑(Focal adhesion)通路。粘著斑通路在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞存活等重要生物學(xué)過(guò)程中起著重要作用，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起著一定的作用，有研究發(fā)現(xiàn)SEMA3F通過(guò)激活粘著斑通路來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)移[16]。另外，人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)以及粘著斑蛋白復(fù)合物的過(guò)量存在與癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲行為增加有關(guān)[17]。

綜上所述，血清SCCAg高表達(dá)與食管鱗癌的高分化程度相關(guān)，血清SCCAg的高表達(dá)對(duì)食管鱗癌診斷及其組織學(xué)分化程度預(yù)測(cè)有應(yīng)用價(jià)值。COL1A2蛋白可能與食管鱗癌的惡性進(jìn)展有關(guān)，對(duì)食管鱗癌的預(yù)后的判斷有臨床參考價(jià)值。進(jìn)一步探討COL1A2在食管鱗癌發(fā)生及發(fā)展中的具體機(jī)制，為食管鱗癌新的治療靶點(diǎn)的探索提供可靠理論依據(jù)。