CLDN6對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響及其在胰腺癌組織中的表達(dá)和臨床意義

孫生安，白明輝，韓保衛(wèi)，王云帥

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率高，5年生存率低于10%[1]，手術(shù)切除輔以新輔助化療是其主要治療方法[2-3]，但胰腺癌起病隱匿，多數(shù)患者就診時已是進(jìn)展期，喪失了手術(shù)治療時機(jī)[4]。近年來，分子靶向治療顯著提高了胰腺癌的治療效果，但腫瘤耐藥仍是目前亟待解決的問題。不斷深入研究胰腺癌的分子機(jī)制、尋求新的藥物作用靶點對于胰腺癌個體化精準(zhǔn)治療意義重大。

緊密連接(tight junctions，TJs)的破壞是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要原因[5]，而閉合蛋白(claudin，CLDN)是構(gòu)成TJs的蛋白之一[6]。CLDN家族目前有27個成員，分布于不同位置，并發(fā)揮著不同的作用，如CLDN1主要分布于心、腦及肺；CLDN4主要分布于卵巢、胰腺及唾液腺；CLDN6則在乳腺、結(jié)腸、卵巢及肝臟中均有表達(dá)[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，CLDN6不僅可作為抑癌基因在乳腺癌、結(jié)腸癌及宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，又可作為促癌基因在肝癌及卵巢癌中表達(dá)上調(diào)[10-14]。這種特性提示其作為腫瘤標(biāo)志物的潛力。研究表明CLDN4在胰腺癌中高表達(dá)，且與胰腺癌進(jìn)展關(guān)系密切[15]，CLDN6在胰腺癌中表達(dá)的情況目前尚未見報道，本研究擬通過多種實驗方法研究CLDN6在胰腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，以期為尋找胰腺癌新的潛在診療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2014年1月至2018年6月在鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院行手術(shù)切除的50例胰腺癌組織及癌旁組織(距癌灶邊緣>3 cm)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)腫瘤，且未合并其他臟器轉(zhuǎn)移；②手術(shù)可切除，術(shù)前術(shù)后均未行新輔助化療或免疫治療；③術(shù)后標(biāo)本經(jīng)我院病理科兩位醫(yī)師分別閱片確診為胰腺癌；④一般情況良好，可耐受外科手術(shù)；⑤依從性好，可規(guī)律隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他臟器轉(zhuǎn)移或為繼發(fā)腫瘤；②因多臟器侵犯或腫瘤包繞血管等因素?zé)o法行手術(shù)切除，或術(shù)前術(shù)后無法予以輔助治療。本研究資料齊全，無失訪，且在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意下進(jìn)行。

1.2 細(xì)胞實驗材料及試劑

實驗所需胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、PANC-1、HPAC、Hs 766T、MIA Paca-2及正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE均購自中山大學(xué)腫瘤防治中心；胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自美國Gibcol公司；Trizol RNA提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒(ZR103)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；CLDN6-siRNA、Cy3標(biāo)記的siRNA及陰性siRNA購自南京恩晶生物科技有限公司；PCR引物(CLDN6正向引物為5′-TTCATCGGCAACAGCATCGT-3′，反向引物為5′-GGTTATAGAAGTCCCGGATGA-3′；β-actin正向引物為5′-TACCTCCCAAGTCCTGTATGAG-3′，反向引物為5′-TGAGCAGCATCAAACTGTGTAG-3′)、RIPA裂解液、BCA蛋白檢測試劑盒、ECL發(fā)光液均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CLDN6、MTT顯色劑購于美國Sigma公司；兔抗人上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體、兔抗人神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)單克隆抗體、兔抗人波形纖維蛋白(vimentin，VIM)單克隆抗體、兔抗人纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)單克隆抗體、GAPDH抗體及羊抗兔IgG二抗購于美國Santa Cruz公司；紫外分光光度計及Bio-Rad CFX96 PCR儀購自上海譜元儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測CLDN6表達(dá)情況 手術(shù)標(biāo)本(胰腺癌組織及癌旁組織)經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋后制作連續(xù)切片(4 μm，各4張)，二甲苯脫蠟后固定，EDTA修復(fù)液修復(fù)2 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶(30 mol/L)，37 ℃孵育后用羊血清封閉20 min。加入兔抗人CLDN6多克隆一抗(1∶500)，對照組加入PBS，均重復(fù)上述操作后置入4 ℃冰箱過夜，加入羊抗兔IgG二抗，室溫烘烤30 min，PBS沖洗3次，再用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色10 min，清水沖洗后蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，中性樹膠封片固定行鏡下觀察。采用Thomas綜合計分法統(tǒng)計結(jié)果[16]：每張切片分別選取5個視野，觀察其染色廣度(陽性細(xì)胞所占百分比)及染色強(qiáng)度。其中，染色廣度計分標(biāo)準(zhǔn)：0分(0～10%)，1分(>10%～25%)，2分(>25%～50%)，3分(>50%～75%)，4分(>75%～100%)。染色強(qiáng)度計分標(biāo)準(zhǔn)：0分(無色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(黃褐色)。以染色廣度與染色強(qiáng)度得分相加評判CLDN6表達(dá)結(jié)果：0～4分為陰性表達(dá)；5～12分為陽性表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、PANC-1、HPAC、Hs 766T、MIA Paca-2及正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE分別放入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、95%相對濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時進(jìn)行細(xì)胞傳代，并取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 選取對數(shù)生長期的各細(xì)胞株分別接種于6孔板中(5×105/孔)，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時，將細(xì)胞分為實驗組及對照組：實驗組轉(zhuǎn)染CLDN6 siRNA沉默質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。按照Lipofectamine 3000說明書分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后采用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率(實驗重復(fù)5次)。

1.3.4 總RNA提取 取對數(shù)生長期細(xì)胞分別加入Trizol試劑(1 ml)作用10 min，再加入200 μl氯仿振蕩15 s后于37 ℃下靜置10 min，4 ℃離心15 min(12 000 r/min)。取上清液，等體積加入異丙醇，混勻后再次離心，收集下層沉淀，75%乙醇(1 ml)洗滌并晾干，加入DEPC液溶解后采用分光光度計測量總RNA濃度及在260、280 nm處的光密度(OD)值。設(shè)OD260/OD280在1.8～2.0為合格樣品。

1.3.5 qRT-PCR法檢測胰腺癌組織及癌旁組織中CLDN6表達(dá)情況 將胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織剪碎并以液氮研磨成粉末狀，參照RNA提取試劑盒提取組織總RNA，測定其濃度及純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)β-actin為內(nèi)參，按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用Bio-Rad CFX96 PCR儀測定CLDN6及內(nèi)參β-actin的mRNA表達(dá)情況。采用2-△△CT法計算相對表達(dá)量，其中ΔΔCT=(實驗組目的基因CT值-實驗組內(nèi)參基因CT值)-(對照組目的基因CT值-對照組內(nèi)參基因CT值)。

1.3.6 MTT法檢測轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞的增殖能力

將轉(zhuǎn)染后的胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3及對照組細(xì)胞分別接種于24孔板中，細(xì)胞濃度為5×104/ml，棄上清液后加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液(200 μl/孔)，并加入5 g/L的MTT液(20 μl/孔)，避光培養(yǎng)6 h，棄去上清，每孔加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min后待結(jié)晶溶解。使用自動酶標(biāo)儀測每孔于490 nm處的吸光度(A490)。計算細(xì)胞的增殖抑制率(%)=[(1-實驗組A490值)/對照組A490值]×100%。

1.3.7 平板克隆實驗檢測轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞的克隆形成能力 將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的AsPC-1、BxPC-3及對照組細(xì)胞接種于6孔板上，各設(shè)兩個細(xì)胞濃度(250、500個/孔)，放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)，每2天換液1次，10 d后取出，PBS沖洗，每孔加入1 ml甲醛，置入-20 ℃冰箱中固定20 min，再以0.1%結(jié)晶紫染液在室溫下染色20 min，去除染液，漂洗后風(fēng)干。任意選取5個視野，用倒置顯微鏡計數(shù)細(xì)胞，取平均值后用Image J軟件統(tǒng)計細(xì)胞克隆個數(shù)。

1.3.8 Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后E-cadherin、N-cadherin、VIM及FN表達(dá)情況 將對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后AsPC-1、BxPC-3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，濃度為5×104/ml，接種于24孔板中，室溫培養(yǎng)48 h。RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后每孔加入4 μg上樣緩沖液，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h。PBS沖洗后分別加入一抗(E-cadherin，1∶500；N-cadherin，1∶500；VIM，1∶1 000；FN，1∶1 000；GAPDH，1∶4 000)，4 ℃孵育過夜，PBS再次沖洗后加入羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，37 ℃下孵育2 h后用ECL發(fā)光液顯影，于暗室紅光下曝光，膠片晾干拍照。用Bandscan 5.0軟件行灰度分析，以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶灰度比值為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CLDN6在胰腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示CLDN6主要呈棕黃色表達(dá)于胰腺細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。胰腺癌組織中CLDN6陽性表達(dá)率為86%(43/50)，顯著高于癌旁組織中的30%(15/50)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.652，P<0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示，50例胰腺癌組織標(biāo)本中CLDN6表達(dá)量(19.44±1.22)明顯高于癌旁組織(1.35±0.71)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.288，P=0.001)；CLDN6在胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、PANC-1、HPAC、Hs 766T、MIA Paca-2中的相對表達(dá)量分別為14.18±0.88、11.90±0.39、7.33±0.22、6.99±0.91、8.20±0.44、5.06±1.01、5.71±1.12，均顯著高于人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE中的1.46±0.25，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 CLDN6在胰腺癌組織(A)及癌旁組織(B)中的表達(dá)(免疫酶標(biāo)法 ×200)

注：與HPDE比較，(1)為P<0.05圖2 CLDN6在各胰腺癌細(xì)胞株及正常胰腺上皮細(xì)胞株(HPDE)中的相對表達(dá)量比較

2.2 CLDN6的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

CLDN6在胰腺癌組織中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理學(xué)類型、腫瘤部位及血清CA19-9水平無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，TNM分期越晚、腫瘤分化程度越低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CLDN6陽性表達(dá)率越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 CLDN6的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 CLDN6表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示，CLDN6陽性表達(dá)患者的中位生存期為8.993個月，短于陰性表達(dá)患者的18.402個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率測定

將CLDN6相對表達(dá)量最高的胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3分別通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入CLDN6 siRNA沉默質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒。qRT-PCR結(jié)果顯示，AsPC-1細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)入沉默質(zhì)粒后CLDN6相對表達(dá)量為1.73±0.21；BxPC-3細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)入沉默質(zhì)粒后CLDN6相對表達(dá)量為1.09±0.48，均低于各自轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒后的相對表達(dá)量(12.37±0.84、10.96±0.53)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖4。

2.5 沉默CLDN6基因?qū)σ认侔┘?xì)胞增殖的影響

沉默CLDN6基因后，與各自空白對照組相比，AsPC-1、BxPC-3兩種細(xì)胞的增殖抑制率逐步升高，提示其增殖能力逐步下降，見圖5。

圖3 CLDN6陽性及陰性表達(dá)胰腺癌患者的生存曲線圖

圖4 AsPC-1、BxPC-3細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率

圖5 沉默CLDN6基因?qū)θ艘认侔〢sPC-1、BxPC-3細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.6 沉默CLDN6基因?qū)σ认侔┘?xì)胞克隆的影響

平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)，沉默CLDN6基因后，兩種細(xì)胞株在250及500兩個鋪孔密度下的細(xì)胞克隆數(shù)均比各自的對照組細(xì)胞克隆數(shù)明顯下降(均P<0.05)，見圖6。

圖6 平板克隆實驗檢測胰腺癌細(xì)胞克隆形成能力

2.7 沉默CLDN6基因后上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Western blotting結(jié)果顯示，實驗組中AsPC-1、BxPC-3兩種細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)量均明顯高于對照組，而N-cadherin、VIM及FN表達(dá)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖7。

圖7 沉默CLDN6基因后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比較

3 討論

CLDN6是CLDN家族成員之一，位于染色體16p3.3，可通過羧基末端的結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)細(xì)胞間的緊密連接，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[17]。大量報道證實CLDN6與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，且其在不同腫瘤中的作用也不盡相同[18-20]。但目前關(guān)于CLDN6在胰腺癌中的作用尚未見相關(guān)報道，本研究旨在探討其在胰腺癌中的表達(dá)及可能的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供參考。

3.1 胰腺癌組織及細(xì)胞中CLDN6的表達(dá)情況

本研究首先通過免疫組化法及qRT-PCR法檢測50例胰腺癌組織及癌旁組織中CLDN6的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌組織中高表達(dá)，且與胰腺癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后顯著相關(guān)，進(jìn)一步檢測胰腺癌常見細(xì)胞株中CLDN6的表達(dá)情況，并與胰腺正常上皮細(xì)胞株比較，均發(fā)現(xiàn)CLDN6在胰腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，初步證實CLDN6可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

3.2 CLDN6對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及可能的機(jī)制

以先期的細(xì)胞檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)一步選取CLDN6相對表達(dá)量較高的AsPC-1、BxPC-3兩種細(xì)胞株，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功構(gòu)建，沉默CLDN6表達(dá)的細(xì)胞模型。MTT法檢測發(fā)現(xiàn),沉默CLDN6基因后的兩種細(xì)胞增殖能力均顯著下降，細(xì)胞增殖抑制率顯著上升。平板克隆實驗顯示，在不同鋪孔密度下，沉默CLDN6基因后的細(xì)胞克隆能力均顯著降低。以上實驗說明CLDN6可促進(jìn)人胰腺癌AsPC-1、BxPC-3細(xì)胞的增殖及克隆形成，沉默CLDN6可顯著抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞克隆能力。

EMT是指上皮細(xì)胞極性喪失，獲得具有間充質(zhì)表型的生物學(xué)特性后轉(zhuǎn)移、侵襲能力增加的過程，其促進(jìn)了多種腫瘤的轉(zhuǎn)移過程[21-24]。EMT的主要特征是細(xì)胞黏附蛋白E-cadherin表達(dá)的減少及間充質(zhì)樣蛋白(N-cadherin、VIM及FN蛋白)表達(dá)的升高[25-27]。其中，E-cadherin是鈣黏蛋白的一種，在維持正常細(xì)胞及細(xì)胞間的連接中發(fā)揮重要作用，而N-cadherin蛋白、VIM蛋白及FN蛋白作用卻相反，可使細(xì)胞間黏附作用減弱，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲[28-31]。本研究行Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，沉默CLDN6基因后兩種胰腺癌細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著升高，而N-cadherin、VIM及FN蛋白表達(dá)水平卻明顯降低，結(jié)合上述細(xì)胞增殖檢測結(jié)果，提示CLDN6可促進(jìn)EMT進(jìn)程，沉默CLDN6基因可使E-cadherin蛋白表達(dá)升高，而N-cadherin、VIM、FN蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程，并最終抑制細(xì)胞的增殖及克隆形成。

綜上所述，本研究初步證實了CLDN6在胰腺癌中高表達(dá)，且與胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本課題研究小組后續(xù)將致力于CLDN6在胰腺癌中可能存在的其他分子信號通路的相關(guān)研究，以進(jìn)一步探討其在胰腺癌診治中的潛在應(yīng)用價值。