長鏈非編碼RNA PCA3在胃癌中的預(yù)后價(jià)值及對胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

姜華基，崔磊，杜玉玉，黨勝春

根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2018年胃癌發(fā)病率和病死率分別位居全球惡性腫瘤的第五位和第三位[1-2]。因早期癥狀隱匿及缺乏特異性腫瘤標(biāo)志物，多數(shù)胃癌患者被檢出時(shí)已進(jìn)展至中晚期，以至于錯(cuò)過了最佳治療時(shí)間[3-4]。因此，探索早期診斷的有效標(biāo)志物及新的治療靶點(diǎn)，對促進(jìn)胃癌診療，提高患者預(yù)后具有重要意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)為長度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子，其本身不具備編碼蛋白的能力，但在多細(xì)胞生物的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著調(diào)控作用[5-6]。大量研究證實(shí)，LncRNA與胃癌在內(nèi)多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥及預(yù)后密切相關(guān)[7-9]。進(jìn)一步了解胃癌相關(guān)LncRNA的表達(dá)和作用機(jī)制將有助于開發(fā)早期篩查及預(yù)后評估標(biāo)志物，為胃癌靶向治療提供新的思路。

前列腺癌抗原-3(prostate cancer antigen-3，PCA-3)，又名DD3，是位于人類第一號(hào)染色體上9q21-22處的一條LncRNA，包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，長度為3735 bp[10]。本次研究首先通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)和基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(genotype-tissue expression，GTEx)，分析PCA3在胃癌組織和正常樣本中的表達(dá)，使用生存分析探索其預(yù)后價(jià)值并分析其與臨床資料的相關(guān)性。采用腫瘤免疫評估資源(tumor immune estimation resource，TIMER)數(shù)據(jù)庫分析PCA3在免疫浸潤物中的表達(dá)及對胃癌患者生存預(yù)后的影響，并從體外細(xì)胞水平探討PCA3對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞株(AGS、MKN-45和HGC-27)以及正常人胃上皮細(xì)胞系GES-1均來自于中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所。RPMI 1640(美國Invitrogen公司)，胰酶、10 %的胎牛血清(美國Gibco公司)。轉(zhuǎn)染試劑：聚凝胺(上海吉?jiǎng)P公司)，TRIzol試劑(上海普飛生物)，逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，DEPC(北京博奧拓達(dá)科技)，RNA 6000納米試劑盒(美國安捷倫公司)，反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)。CCK-8試劑(上海同仁化學(xué))，Transwell小室(美國Corning公司)。

PCA3及內(nèi)參GAPDH的特異性寡核苷酸引物由上海生工公司設(shè)計(jì)，PCA3正向引物：5′-AGAGCTAGTCCGCTGTGAGTC-3′，反向引物5′-CTGCCATTGAGATGTCTGTAGTC-3′；GAPDH正向引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，反向引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。PCA3的3個(gè)不同目標(biāo)shRNA序列(shRNA#1：5′-GGAAGCATCTCAAGATCTT-3′；shRNA#2：5′-CCTGAATGCCTAGA-CCCTT-3′；shRNA#3：5′-GGTTCACTCCTGGCAATAA-3′)，以及陰性對照序列(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)由上海吉?jiǎng)P基因有限公司設(shè)計(jì)。慢病毒載體GV493和病毒包裝的質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因有限公司，并經(jīng)測序證實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析資料 胃癌的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)TCGA-STAD-HT-Seq來自于TCGA的官方網(wǎng)址(https://portal.gdc.cancer. gov)，共獲得407個(gè)樣本，其中胃癌組織樣本375例，癌旁組織樣本32例，同時(shí)下載胃癌臨床樣本文件，共計(jì)443例樣本信息。在做預(yù)后分析以及使用臨床資料來進(jìn)行相關(guān)性分析時(shí)，需將測序數(shù)據(jù)與臨床信息合并，此時(shí)僅保留包含臨床資料的樣本，共剩下375例。正常人的胃組織測序數(shù)據(jù)來自GTEx官方網(wǎng)址(https://gtexportal.org/)，共獲得194個(gè)樣本。在使用前采用Redge R包對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，批次校正通過sva包中combat函數(shù)實(shí)現(xiàn)。利用腫瘤免疫評估TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析PCA3在B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等6種免疫浸潤細(xì)胞中的表達(dá)和對胃癌患者生存預(yù)后的影響。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 所有的細(xì)胞株均培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基當(dāng)中，其中添加有10 %的胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 mg/L)，并保持37 ℃和5 % CO2濃度。根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)挑選出高表達(dá)PCA3的細(xì)胞株用于后續(xù)研究。為了構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)PCA3的胃癌細(xì)胞，將PCA3的三個(gè)目標(biāo)shRNA序列以及陰性對照(Negative control，NC)序列克隆至GV493載體中，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。隨后收取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞并將其置于含有無血清培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板上，并維持5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度，當(dāng)融合度達(dá)到70%時(shí)，按使用說明通過聚凝胺將4 μl 慢病毒載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。培養(yǎng)16 h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至完全培養(yǎng)基中，并通過qRT-PCR檢測沉默效率。所構(gòu)建的低PCA3表達(dá)細(xì)胞將應(yīng)用于后續(xù)的研究。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR) 首先嚴(yán)格按照TRIzol試劑的使用說明從各細(xì)胞中提取出RNA，在收集的細(xì)胞中加入TRIzol試劑，隨后加入氯仿，混合均勻后離心分離上層清液。在上層清液中加入異丙醇沉淀RNA。RNA沉淀隨后用75 %的乙醇漂洗2次，并將其完全溶解于不含RNA酶的水中。提取出的RNA用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測定RNA濃度和A260、A280值。利用RNA 6000納米試劑盒對RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)。然后，用寡核苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶將總的RNA以25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min的反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過qRT-PCR對基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，PCR的反應(yīng)條件為95 ℃熱啟動(dòng)3 min，95 ℃變性10 min，56 ℃退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以(GAPDH)作為內(nèi)部參照，使用公式(2-ΔΔCt)來計(jì)算基因的相對表達(dá)。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將空白對照(Mock)組、陰性對照(NC)組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以2×103個(gè)/孔接種于96孔板(100 μl/孔)，每組5個(gè)復(fù)孔，分別于1 d、2 d、3 d、4 d及5 d后加入CCK-8試劑10 μl/孔，常規(guī)培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處的吸光度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml。將Mock組、NC組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液以100 μl/孔接種于Transwell小室的上室中，下室中加入750 μl/孔完全培養(yǎng)液。侵襲實(shí)驗(yàn)與遷移實(shí)驗(yàn)步驟類似，區(qū)別僅是將細(xì)胞懸液接種于基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室。將接種細(xì)胞后的Transwell小室置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用4 %多聚甲醛溶液固定，并進(jìn)行結(jié)晶紫染色。棉簽擦去上室面殘余細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量，以此反映細(xì)胞遷移和侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

TCGA數(shù)據(jù)庫中的測序數(shù)據(jù)通過Stawberry Perl(版本號(hào)5.3.0)、R軟件(版本號(hào)3.4.0)來進(jìn)行整理和預(yù)處理，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以及分析均在SPSS(版本號(hào)22.0)中完成，并使用GraphPad Prism(版本號(hào)7.0.4)來進(jìn)行作圖展示。兩組間比較采用配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。通過Kaplan-Meier法來繪制生存曲線，并用Log-Rank法檢驗(yàn)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCA3在胃癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

通過對TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織PCA3表達(dá)較高(圖1A，P<0.01)。通過繪制KM曲線并進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，PCA3表達(dá)水平與總體生存期相關(guān)(圖1B，P<0.01)，其表達(dá)越高，預(yù)后越差。

圖1 PCA3在胃癌組織中的表達(dá)(1A)及與預(yù)后的關(guān)系(1B)

2.2 PCA3與臨床病理特征之間的相關(guān)性

從TCGA數(shù)據(jù)庫提取375例胃癌患者的臨床和病理信息，根據(jù)PCA3的表達(dá)量中位數(shù)將樣本分為低表達(dá)組及高表達(dá)組。結(jié)果表明PCA3的表達(dá)水平與胃癌患者T分期、腫瘤G分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、N分期、M分期、TNM分期及胃癌家族史無明顯關(guān)系(P>0.05)(表1)。

表1 PCA3表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 PCA3 mRNA在胃癌組織中與多種免疫細(xì)胞的關(guān)系

利用TIMER數(shù)據(jù)庫研究發(fā)現(xiàn)，PCA3 mRNA在胃癌免疫微環(huán)境中與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的表達(dá)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與腫瘤純度、CD8+T細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在胃癌組織免疫環(huán)境中的表達(dá)無確切關(guān)系，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

PCA3 mRNA表達(dá)水平與免疫細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)(偏相關(guān)系數(shù)均為正值)。巨噬細(xì)胞中PCA3 mRNA高表達(dá)相對于低表達(dá)組的胃癌患者生存預(yù)后較差，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而在其余免疫細(xì)胞中，高表達(dá)PCA3 mRNA對胃癌患者的生存差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4 PCA3在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

qRT-PCR檢測顯示，癌細(xì)胞株AGS(t=10.321，P<0.01)、HGC-27(t= 8.452，P<0.05)中PCA3的表達(dá)水平高于正常胃上皮細(xì)胞株GES-1，而MKN-45中PCA3的表達(dá)水平與GES-1相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.655，P>0.05)，見圖4A。其中，AGS中PCA3的表達(dá)水平最高，因此我們選擇此細(xì)胞株用于構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)PCA3的細(xì)胞模型。利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi來降低AGS細(xì)胞中PCA3的表達(dá)。如圖4B所示，轉(zhuǎn)染shRNA#3序列后，AGS細(xì)胞中PCA3的表達(dá)水平下降(t=-17.655，P<0.01)，選用shRNA#3序列用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

為了評估AGS細(xì)胞的生長和增殖，進(jìn)行了CCK-8實(shí)驗(yàn)。酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示，與Mock組及NC組相比，實(shí)驗(yàn)組(shRNA#3)的吸光度在培養(yǎng)了2 d(t分別為15.369和6.895，均P<0.05)、3 d(t分別為26.295和12.744，均P<0.05)、4 d(t分別為18.674和8.320，均P<0.05)和5 d(t分別為36.454和19.047，均P<0.05)后均有降低，見圖5。表明AGS細(xì)胞的增殖速度在PCA3沉默之后減慢。

2.6 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲

Transwell小室法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Mock組及NC組相比，實(shí)驗(yàn)組(shRNA#3)AGS 細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制(均P<0.01)，見圖6。

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAs在多種腫瘤中呈異常表達(dá)，并且某些LncRNAs的表達(dá)具有腫瘤特異性[11-12]。如LncRNA MALAT-1在非小細(xì)胞癌中與Bcl-2相互作用，在具有轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞中呈高表達(dá)，與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)[13]。LncRNA HOST2在肝細(xì)胞癌中通過激活JAK2-STAT3通路，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，繼而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[14]。一些LncRNAs如HULC、LINC00152、H19及GHET1等已被證實(shí)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中具有癌基因活性，而GAS5、LEIGC及FER1L4被認(rèn)為是胃癌抑制因子[15]。這些研究表明，LncRNAs可能為一種新型腫瘤診斷標(biāo)志物，有助于腫瘤的早期篩查及預(yù)后評估。

3A～3E：B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中高表達(dá)PCA3 mRNA與胃癌患者的生存預(yù)后無關(guān)(P>0.05)；3F：巨噬細(xì)胞中PCA3 mRNA高表達(dá)組胃癌患者生存預(yù)后較差(P<0.05)圖3 腫瘤免疫細(xì)胞表達(dá)水平對胃癌患者生存率的影響

注：*P<0.05 ，**P<0.01

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

圖6 沉默PCA3對AGS細(xì)胞遷移和侵襲的影響

LncRNA PCA3最早發(fā)現(xiàn)于前列腺癌組織，已成為前列腺癌診治的重要標(biāo)志物[16]。Qi等[17]通過回歸分析發(fā)現(xiàn)，PCA3與BCAR4結(jié)合作為雙重標(biāo)志物可提高結(jié)直腸癌診斷的靈敏性和準(zhǔn)確性。絨毛膜癌細(xì)胞中PCA3通過與miR-106b結(jié)合釋放其內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)，促進(jìn)絨毛膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18]。Sajjadi等[19]研究報(bào)道，慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)患者血液中PCA3呈現(xiàn)高表達(dá)，并且PCA3過表達(dá)可能致使骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)表達(dá)增加，繼而刺激原始CML細(xì)胞的擴(kuò)增。雖然對PCA3的研究日益增多，不過其在胃癌中的作用尚無報(bào)道。本研究首先通過對高通量數(shù)據(jù)庫TCGA及GETx的挖掘，發(fā)現(xiàn)PCA3在胃癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.000 1)，表明PCA3表達(dá)水平可能與胃癌發(fā)生相關(guān)。隨后通過繪制KM曲線分析發(fā)現(xiàn)，PCA3高表達(dá)組患者的總體生存率低于PCA3低表達(dá)組(P<0.01)，顯示PCA3可以作為胃癌有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)。進(jìn)一步分析PCA3表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PCA3的表達(dá)與胃癌T分期及腫瘤分化程度相關(guān)(均P<0.05)，提示PCA3高表達(dá)可能與胃癌的惡性程度相關(guān)，可以促進(jìn)腫瘤的侵襲，加速腫瘤的進(jìn)展。

機(jī)體對腫瘤產(chǎn)生的免疫應(yīng)答主要是免疫細(xì)胞浸潤至腫瘤組織并參與腫瘤免疫循環(huán)的過程[20-21]。腫瘤中免疫細(xì)胞的浸潤與臨床結(jié)果密切相關(guān)，浸潤的免疫細(xì)胞有可能作為藥物靶點(diǎn)來提高患者的生存率[22]。本研究利用TIMER數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PCA3 mRNA表達(dá)水平在胃癌免疫微環(huán)境中與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在胃癌組織的免疫微環(huán)境中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(均P<0.05)，并且巨噬細(xì)胞中PCA3 mRNA高表達(dá)相對于低表達(dá)組的胃癌患者生存預(yù)后較差(P<0.05)，這提示在胃癌進(jìn)展期間，巨噬細(xì)胞中可能以促進(jìn)腫瘤發(fā)展的替代型M2巨噬細(xì)胞為主[23]，繼而重塑腫瘤微環(huán)境以調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展。PCA3與腫瘤中免疫細(xì)胞的共表達(dá)及影響腫瘤免疫微環(huán)境的具體機(jī)制為我們后續(xù)研究提供了新的方向。

腫瘤的增殖、遷移和侵襲涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、相關(guān)蛋白分子異常表達(dá)及腫瘤血管形成等生物學(xué)過程[24]。增殖、轉(zhuǎn)移為惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要特征，抑制腫瘤細(xì)胞增殖對提高腫瘤患者預(yù)后意義重大[25]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PCA3是否參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過程，我們利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi來降低AGS細(xì)胞中PCA3的表達(dá)，構(gòu)建了穩(wěn)定低表達(dá)PCA3的細(xì)胞模型。CCK-8實(shí)驗(yàn)生長曲線顯示，沉默PCA3的表達(dá)減緩了胃癌AGS細(xì)胞的生長和增殖(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，PCA3水平下調(diào)可降低胃癌AGS細(xì)胞的遷移及侵襲能力(均P<0.01)。上述細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，PCA3可促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，提示PCA3在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能起著癌基因的作用，與高通量數(shù)據(jù)庫(TCGA、GTEx)的挖掘結(jié)果相一致，提示其可能成為一種潛在的腫瘤生物標(biāo)志，為胃癌早期篩查及診斷提供新的思路。

綜上所述，PCA3在胃癌患者的腫瘤組織中表達(dá)水平增高，這可能與胃癌的惡性程度有關(guān)。TIMER數(shù)據(jù)庫分析顯示在免疫微環(huán)境中高表達(dá)PCA3 mRNA的巨噬細(xì)胞對胃癌患者生存預(yù)后較差。在胃癌AGS細(xì)胞中，通過降低PCA3表達(dá)可抑制AGS細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。今后，本課題組會(huì)進(jìn)一步分析PCA3及腫瘤組織中浸潤的免疫細(xì)胞與臨床病理特征的關(guān)系，并探究PCA3與免疫細(xì)胞相聯(lián)合對胃癌患者預(yù)后的影響。此外，更深入地研究PCA3在胃癌中的工作靶點(diǎn)及具體的調(diào)控機(jī)制，為尋找新的胃癌治療靶點(diǎn)提供更多依據(jù)。