干旱脅迫對(duì)盆栽“川丹參1號(hào)”生理指標(biāo)及主要活性成分含量的影響

鄧婉月 冷秋彥 楊在君 余 燕 吳一超

（西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，637002，四川南充）

近年來，隨著全球氣候變化，干旱頻發(fā)，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量的農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害之一。干旱會(huì)抑制植物正常生長和光合作用[1-2]，從而影響植物次生代謝產(chǎn)物積累和產(chǎn)量[3]。植物在進(jìn)化過程中為了適應(yīng)干旱等逆境，演化出了相應(yīng)的適應(yīng)機(jī)制，通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶體系等，以抵御或耐受干旱環(huán)境的影響，這也是藥用植物規(guī)范化種植領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[4]。

丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，別名血參、赤參以及紅根，是我國常用大宗中藥材[5]?！吨腥A人民共和國藥典》（2015版）以丹參干燥的根及根莖入藥，具活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩和涼血消癰之功效[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明丹參在治療心腦血管疾病[7]、抗癌[8-9]、抗炎[10-11]、抗氧化[8]和保肝[12-13]等方面都具有良好的效果。2010年，復(fù)方丹參滴丸成為我國第一例通過美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）Ⅱ期臨床試驗(yàn)并進(jìn)入FDAⅢ期臨床研究的中成藥[14]?！按ǖ?號(hào)”（CDS-1）（川審藥2011 002），是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)張利教授團(tuán)隊(duì)在四川省中江縣栽培丹參混雜群體中通過近9年的系統(tǒng)選育而成的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)丹參品種，是第一個(gè)真正意義上經(jīng)審定的川丹參品種。CDS-1具有出苗早、生育周期長、產(chǎn)量與上級(jí)率高、品質(zhì)優(yōu)良、區(qū)域適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)[15]。丹參主要活性成分為脂溶性的二萜醌類化合物（丹參酮類）和水溶性的酚酸類[16-17]。川丹參栽培區(qū)四川省中江縣每年都會(huì)有較嚴(yán)重的春旱和伏旱發(fā)生，嚴(yán)重影響川丹參的正常生長及丹參藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量，目前未見有關(guān)CDS-1抗旱能力和干旱適應(yīng)性的研究。因此，開展CDS-1的抗旱能力研究，有利于在規(guī)范化種植中通過科學(xué)控水，保證CDS-1的產(chǎn)量和品質(zhì)，也可以為其在川東北地區(qū)的進(jìn)一步推廣種植提供理論依據(jù)。

本研究以項(xiàng)目組具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的CDS-1為材料（由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)張利教授提供），利用不同濃度的PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，研究CDS-1在不同程度干旱脅迫下的形態(tài)和生理指標(biāo)變化規(guī)律，并采用HPLC法同時(shí)測(cè)定不同干旱處理下CDS-1主要活性成分含量的變化。探討CDS-1抗旱能力及干旱對(duì)丹參藥材品質(zhì)的影響，以期為CDS-1的引種栽培及規(guī)范化種植中的田間水分管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試材料為項(xiàng)目組自主培育的CDS-1。于2018年1月，選擇粗細(xì)均勻且無病蟲害的CDS-1根條，剪成約5cm的小段種植于花盆中（每盆土壤的質(zhì)量相等），置于實(shí)驗(yàn)室露臺(tái)培養(yǎng)，待丹參長出6～8片葉時(shí)（2018年6月1日）開始用Hoagland營養(yǎng)液配制的不同濃度PEG-6000溶液模擬長期干旱脅迫（表1），脅迫處理持續(xù)至2019年1月丹參收獲。設(shè)置4個(gè)模擬干旱處理組和1個(gè)對(duì)照組CK，每組5個(gè)重復(fù)。

表1 不同PEG-6000濃度模擬干旱脅迫處理Table 1 Different concentrations of PEG-6000 simulate drought stress treatments

1.2 試劑

試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA（純度＞98%，HPLC）購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇（HPLC級(jí)）和乙腈（HPLC級(jí)）購自美國Fisher Scientific公司；其他常用試劑均為分析純，購自成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 CDS-1生理指標(biāo)的測(cè)定

于2018年10月中旬采摘經(jīng)模擬干旱脅迫處理的CDS-1莖中部的葉片，測(cè)定不同處理樣品的生理指標(biāo)：采用乙醇－丙酮混合液浸泡法測(cè)定葉綠素含量[18]；采用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶（POD）活性，采用紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶（CAT）活性，采用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸（Pro）含量，以上均是在李合生等[19]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)修改；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MAD）含量[20]；采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量，采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[21]。

1.4 CDS-1活性成分的測(cè)定

1.4.1 樣品溶液的制備 于2019年1月采收各處理CDS-1的根，去除須根和泥土，陰干2d，40℃條件下烘干72h，粉碎過40目篩，于陰涼干燥處密封儲(chǔ)存。稱取干燥丹參粉約0.15g，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇50mL，密塞，稱重，超聲提?。?40W，42kHz）30min，冷卻后，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻后過濾，量取續(xù)濾液5mL，移至10mL量瓶中，加80%甲醇定容至刻度，然后搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

1.4.2 色譜條件 采用HPLC同時(shí)測(cè)定CDS-1中6種活性成分含量，色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（5μm，4.6×250mm），流速 1mg/mL，柱溫40℃，流動(dòng)相0.1%磷酸水（A）－乙腈（B），進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長270nm，具體洗脫程序：0～5min，20% B；5～15min，20%～25% B；15～25min，25%～61% B；25～40min，61%～90% B；后運(yùn)行5min。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別稱取迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA對(duì)照品，制得迷迭香酸0.0250mg/mL、丹酚酸B 0.1160mg/mL、丹酚酸A 0.0025mg/mL、隱丹參酮0.0050mg/mL、丹參酮Ⅰ 0.0050mg/mL和丹參酮ⅡA 0.0037mg/mL的混合對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣不同體積混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2）。

表2 CDS-1中6種活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of six active components of CDS-1

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)處理完全隨機(jī)，采用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬干旱脅迫對(duì)CDS-1植株形態(tài)的影響

從圖1可以看出，模擬干旱條件下，CDS-1生長受到明顯抑制。CDS-1株高隨脅迫程度的增加顯著降低，與對(duì)照相比，PEG-6000濃度為150和200g/L時(shí)株高降低30%～40%；莖分枝數(shù)明顯減少，在PEG-6000濃度為200g/L時(shí)莖分枝數(shù)僅為2。在干旱脅迫下CDS-1葉色變淺，因此干旱脅迫嚴(yán)重影響了CDS-1地上部分的正常生長及根系的長度和分布。同時(shí)可以看出水分過高也不利于丹參根部的生長。

圖1 不同濃度PEG-6000模擬干旱脅迫處理下CDS-1的形態(tài)Fig.1 Morphology of CDS-1 under PEG-6000 simulated drought stress with different concentrations

2.2 模擬干旱脅迫下CDS-1葉綠素含量變化

葉綠素是植物合成有機(jī)物的關(guān)鍵基礎(chǔ)，是反映植物光合作用能力的重要指標(biāo)之一，不同葉綠素的含量及比值對(duì)植物光合作用有很大影響[22]。表3結(jié)果表明，隨著模擬干旱脅迫程度的增加，CDS-1葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量均呈下降的趨勢(shì)。PEG-6000溶液濃度由0增加到100g/L時(shí)，葉綠素a和葉綠素b含量顯著降低，此后干旱脅迫程度進(jìn)一步增加，葉綠素含量下降速度減緩，在整個(gè)脅迫處理范圍內(nèi)葉綠素a/b的值逐漸上升，可能是干旱脅迫使CDS-1葉片中的葉綠素a轉(zhuǎn)化為葉綠素b的過程受阻，導(dǎo)致葉綠素b含量下降更為明顯[22]。與CK相比，200g/L PEG-6000處理的CDS-1葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量分別下降25.0%、40.8%和30.7%。

表3 不同濃度PEG-6000模擬干旱脅迫處理下CDS-1葉片的葉綠素含量Table 3 Chlorophyll content in leaves of CDS-1 under PEG-6000 simulated drought stress

2.3 模擬干旱脅迫下CDS-1葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸）對(duì)植物在逆境中維持細(xì)胞正常的滲透壓及活性起著重要作用[23]。由圖2可知，隨著PEG-6000溶液濃度的增加，CDS-1葉片中可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量整體呈上升趨勢(shì)。在PEG-6000濃度為150g/L時(shí)可溶性蛋白含量達(dá)到最大值0.35mg/g，較CK增加約20%；可溶性糖含量在PEG濃度為200g/L時(shí)達(dá)最大值5.43mg/g；脯氨酸含 量在PEG濃度為200g/L時(shí)達(dá)到最大值72.21μg/g，比CK增加43.5%。

圖2 PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)CDS-1葉片中可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的影響Fig.2 The soluble protein, soluble sugar and proline content in leaves of CDS-1 under PEG-6000 simulated drought stress

2.4 模擬干旱脅迫對(duì)CDS-1葉片MDA含量和保護(hù)酶活性的影響

MDA含量是體現(xiàn)植物細(xì)胞膜受損程度的重要指標(biāo)，通過測(cè)定MDA含量可以評(píng)價(jià)不同程度干旱脅迫對(duì)CDS-1的損傷情況。由圖3A可知，隨著PEG-6000溶液濃度的增加，CDS-1葉片中MDA含量顯著上升，PEG-6000濃度為200g/L時(shí)達(dá)到最大值1.87nmol/g，較CK增加了5.06倍，說明在重旱條件下CDS-1葉片細(xì)胞受到了最為嚴(yán)重的損傷。細(xì)胞膜的損傷是導(dǎo)致植物組織受到傷害的重要誘因，在干旱脅迫下，膜脂過氧化是引起植物細(xì)胞膜損傷的重要因素，在進(jìn)化過程中，植物形成了一整套保護(hù)酶體系來應(yīng)對(duì)干旱的損傷[23]。SOD、POD和CAT等是主要的活性氧（ROS）清除酶[24]，通過測(cè)定這3種酶的活性，分析在PEG模擬干旱脅迫下CDS-1抗氧化酶體系的應(yīng)急響應(yīng)。圖3B顯示，隨著PEG-6000溶液濃度的增加，CDS-1葉片中SOD活性先上升后下降，在100g/L PEG處理下達(dá)到峰值，此后，隨著脅迫程度增加，SOD活性顯著下降，在PEG濃度為200g/L時(shí)最低，僅為CK的48%。圖3C顯示CDS-1葉片中POD活性隨PEG濃度增加顯著上升，在PEG濃度為200g/L時(shí)達(dá)到最大值，為CK的167%。而CAT活性隨著脅迫程度的增加呈下降趨勢(shì)（圖3D）。

圖3 PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)CDS-1葉片中MDA含量，SOD、POD和CAT活性的影響Fig.3 MDA content, and the activities of SOD, POD and CAT in leaves of CDS-1 under PEG-6000 simulated drought stress

2.5 模擬干旱脅迫下CDS-1活性成分的積累

圖4是不同處理下CDS-1的HPLC色譜圖。從表4可以看出，不同干旱脅迫處理對(duì)CDS-1中酚酸類成分含量影響顯著，處理液濃度為150g/L和200g/L時(shí)丹酚酸B含量略高于50和100g/L處理，與CK無顯著性差異。迷迭香酸和丹酚酸A在50～150g/L PEG-6000處理后均有所上升，在150g/L時(shí)達(dá)最高（分別為8.03和0.93mg/g），分別是CK的145%和175%，而濃度200g/L時(shí)明顯下降，其中丹酚酸A減少更為顯著，甚至低于CK。模擬干旱脅迫對(duì)CDS-1丹參酮類成分含量有顯著影響，總體趨勢(shì)是隨干旱脅程度增加先顯著上升，后急劇下降再回升。50和100g/L處理時(shí)的隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和總酮含量有顯著增加，其中除丹參酮Ⅰ，50g/L處理的各丹參酮類成分含量均最高（分別為0.09、0.32和0.64mg/g），與CK相比增幅都在60%以上，但在150g/L處理時(shí)丹參酮類成分含量顯著降低。迷迭香酸、丹酚酸A和丹酚酸B等酚酸類成分具有很強(qiáng)的抗氧化活性[16]，能清除植物內(nèi)的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，所以其含量在環(huán)境干旱程度較低時(shí)表現(xiàn)為增加，使植株對(duì)不良干旱環(huán)境有一定的抵抗能力。在輕度干旱脅迫環(huán)境下，CDS-1的酚酸類成分和丹參酮類成分含量顯著增加，說明一定程度的干旱脅迫有利于CDS-1活性成分的積累。

圖4 PEG-6000模擬干旱脅迫下CDS-1中6種活性成分HPLC色譜圖Fig. 4 The HPLC chromatography of six active components for CDS-1 under PEG-6000 simulated drought stress

表4 不同濃度PEG-6000溶液模擬干旱脅迫處理下CDS-1中6種活性成分含量Table 4 The contents of six active components of CDS-1 under PEG-6000 simulated drought stress mg/g

3 討論

諸多研究表明，干旱會(huì)使植物缺水而導(dǎo)致植物葉片枯萎、脫落，葉綠素減少和光合能力下降[25]，以及一系列生理指標(biāo)的變化[26]。長期干旱脅迫會(huì)嚴(yán)重抑制植物生長和次生代謝產(chǎn)物的積累，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡。

本研究采用PEG-6000模擬干旱脅迫，分析了持續(xù)性干旱脅迫對(duì)CDS-1生長、生理指標(biāo)及主要活性成分積累的影響。干旱脅迫下CDS-1葉片葉綠素a和葉綠素b含量均隨干旱程度增加顯著降低，說明干旱脅迫抑制葉綠素合成并加速其分解，導(dǎo)致其含量急劇下降，顯著降低了CDS-1葉片捕獲和轉(zhuǎn)化光能的能力，且抑制程度隨干旱程度增加而增加。光合色素在植物光合作用中直接參與光能的吸收、傳遞和引起原初光反應(yīng)，其含量的高低直接決定植物光合作用強(qiáng)弱[27-28]，從而影響植物地上部分的正常生長。當(dāng)遇到干旱時(shí)，植物可通過積累大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，維持植株的生長[29]。干旱脅迫下，CDS-1的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量總體都顯著高于CK，在CDS-1對(duì)干旱環(huán)境的適應(yīng)中起著重要作用。

隨著干旱脅迫程度增加CDS-1葉片中MDA含量上升，與左小容等[30]研究的商洛丹參幼苗受干旱影響結(jié)果類似，這可能是由于干旱脅迫下保護(hù)酶（SOD和CAT）活性減弱，ROS不斷積累，引起膜脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，膜透性增大，MDA不斷積累。植物體內(nèi)ROS的積累會(huì)促進(jìn)抗氧化酶系統(tǒng)（SOD、POD和CAT等）活性增強(qiáng)，已有研究表明，在不同干旱脅迫程度下，植物葉片中抗氧化酶活性均有不同程度升高[26，31]。干旱脅迫中，CDS-1葉片SOD活性增強(qiáng)，清除自由基的能力提高，減少了細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，降低了因過氧化作用引起的質(zhì)膜傷害，當(dāng)干旱脅迫程度較大，自由基產(chǎn)生與清除平衡失調(diào)，導(dǎo)致SOD活性降低，對(duì)ROS自由基的清除能力也大大減弱，POD活性增強(qiáng)，清除CDS-1葉片水解氧化酶催化的氧化還原反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)H2O2的能力提高，防止ROS的大量積累對(duì)葉片組織的傷害，從而對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[32]；CAT可以協(xié)助SOD清除自由基產(chǎn)生的高濃度H2O2，二者結(jié)合起來可將有害的氧自由基和H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2，以此來抵抗其對(duì)細(xì)胞的傷害，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)[33]。CDS-1葉片中CAT活性隨干旱脅迫程度增加呈下降的趨勢(shì)，表明葉片清除自由基的能力逐漸減弱，因此干旱程度越高CDS-1受到的傷害越嚴(yán)重。

許多研究表明干旱脅迫可以增加植物次生代謝產(chǎn)物的生成和積累，Shi等[34]對(duì)丹參毛狀根研究結(jié)果也顯示，滲透脅迫降低根的干重，增加總丹參酮含量。這與水分脅迫增加了丹參根的數(shù)量，降低了丹參根的產(chǎn)量，而酚酸類成分主要分布于根內(nèi)部，丹參酮主要分布在根的表面有關(guān)[35]。本研究通過模擬長期干旱脅迫，表明中度干旱脅迫增加了CDS-1根中酚酸類成分含量（丹酚酸B除外），輕度干旱脅迫顯著增加了丹參酮類成分在CDS-1根中的含量。丹酚酸類活性成分迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A等具有很強(qiáng)的抗氧化作用[36-37]，能清除植物內(nèi)的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA等成分具有防病抗菌作用[38]。干旱脅迫下CDS-1酚酸類和丹參酮類物質(zhì)的增加，表明輕度的干旱脅迫可以提高CDS-1酚酸類和丹參酮類主要活性成分的積累，而干旱脅迫下CDS-1的抗氧化性與其次生代謝產(chǎn)物的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。項(xiàng)目組還在進(jìn)一步開展后續(xù)的田間控水對(duì)CDS-1品質(zhì)和產(chǎn)量影響的研究，以期獲得精確的田間控水?dāng)?shù)據(jù)，從而在生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)CDS-1的控水提質(zhì)。

4 結(jié)論

在50～200g/L的PEG-6000溶液模擬干旱脅迫處理下，CDS-1形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和活性成分均表現(xiàn)出適應(yīng)性變化，表明CDS-1具有一定的抗旱能力。輕到中度干旱脅迫（PEG-6000濃度為50～100g/L）有利于CDS-1活性成分的積累，特別是丹參酮類成分較對(duì)照組的增幅超60%。因此，在CDS-1規(guī)范化種植中可以通過控制田間含水量來提高丹參藥材的品質(zhì)。