王黎明 孔維瑋 高華利 ,3 董普輝 閆雪芳 王春平 王洪剛 李興鋒
(1河南科技大學農(nóng)學院,471003,河南洛陽;2山東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/作物生物學國家重點實驗室,271018,山東泰安;3河南省黃泛區(qū)農(nóng)場,466000,河南周口)
脂肪氧化酶(LOX)是一種在自然界中廣泛存在的含非血紅素鐵的雙加氧酶,能夠催化含有順-順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多聚不飽和脂肪酸加氧反應(yīng)和生成具有共軛雙鍵的過氧化合物的酶蛋白,屬于多聚不飽和脂類的酶系家族[1-4]。目前,小麥LOX基因家族中共鑒定到至少50個成員,可分為9-LOX和13-LOX兩個亞家族,在50個TaLOX基因中有40個都是復制產(chǎn)生的,而TaLOX基因并非隨機分布,他們被分別定位在19條小麥染色體上[5]。LOX是一種存在于小麥籽粒中含量很低的酶蛋白,是茉莉酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[6-7],對小麥加工品質(zhì)和色澤起著重要作用[8-10],LOX也是影響小麥面粉及其制品的口感、營養(yǎng)價值以及其能否吸引消費者的重要指標[11-14]。Leenhardt等[11]和Irvine等[12]的研究都認為小麥面粉中的LOX會偶聯(lián)氧化面粉中的類胡蘿卜素進行生物漂白,使小麥面粉具有白亮的色澤,從而使做出的面制品受到廣大消費者的青睞;LOX可以增強小麥中麥谷蛋白的交聯(lián)和氧化作用,提高麥類食品的口感和風味[13];同時LOX還可以氧化面粉及面粉制品中的脂類物質(zhì),使其失去原本的麥香味,影響口感[14]。
開展小麥LOX活性的分布及其與加工品質(zhì)的相關(guān)性研究是諸多小麥研究者關(guān)注的重要問題。Borrelli等[15-16]認為LOX在小麥籽粒中的分布從外到內(nèi)逐漸遞減,在胚和糊粉層中的活性最高。Bao等[17]研究表明,小麥中LOX的活性與全麥粉的白度呈顯著正相關(guān)關(guān)系,與全麥粉的黃度呈極顯著負相關(guān),并且產(chǎn)地不同的小麥品種(系)間的LOX平均活性的差異較大。王慧等[18]在對安徽省淮南片參加小麥區(qū)試5個生態(tài)點的10個小麥品種(系)的研究中發(fā)現(xiàn),全麥粉LOX活性與小麥粉LOX活性呈極顯著正相關(guān)。Trufanov等[19]認為LOX活性與面團強度、形成時間、穩(wěn)定時間和延展性呈顯著負相關(guān),與彈延比呈正相關(guān);LOX活性過高會氧化小麥面粉中的一些營養(yǎng)物質(zhì),造成營養(yǎng)流失[20-24]。所以LOX活性較低的小麥品種有利于提高小麥面粉的營養(yǎng)價值。低活性LOX的小麥品種還有利于小麥種子在儲藏過程中保持活力。Liu等[25]利用RNA i技術(shù)沉默了小麥LOX基因,發(fā)現(xiàn)小麥籽粒的LOX活性受到有效抑制。
鑒于LOX對小麥面粉及其加工品質(zhì)的重要影響,篩選小麥LOX活性等位基因并開發(fā)其特異標記是進行小麥LOX遺傳改良與分子育種的重要內(nèi)容。Geng等[9,26]通過雜交組合中優(yōu) 9507×CA9632構(gòu)建的重組自交系分別在染色體1AL和4B上檢測到了控制小麥LOX活性的QTL,2個基因?qū)ψ蚜OX活性的貢獻率分別為13.4%~25.2%和14.3%~27.0%,并在此基礎(chǔ)上克隆出等位基因TaLox-B1a和TaLox-B1b,這對等位基因位于普通小麥4BS上。根據(jù)等位基因TaLox-B1a和TaLox-B1b在第3外顯子上1個SNP的差異開發(fā)出了1對互補的顯性功能標記LOX16和LOX18[4],這2個標記在LOX活性高和低的品種中分別擴增出489bp和791bp片段。吳萍[10]根據(jù)小麥LOX1基因本身的序列信息[27]開發(fā)了一個新功能標記LOX1-wp01,該標記可靠性強,而且采用帶型統(tǒng)計的方法在檢測中進行統(tǒng)計,操作方便、易于觀察。綜上所述,開展LOX活性研究對于小麥品質(zhì)改良與分子育種都具有非常重要的作用。
本研究利用標記LOX16和LOX18對來自中國7個麥區(qū)的436份小麥種質(zhì)進行分子檢測,明確其在TaLox-B1位點的等位基因變異類型,并對其在不同生態(tài)區(qū)的分布規(guī)律進行分析,在此基礎(chǔ)上,對自選高代小麥品系進行分子鑒定,以期為選育優(yōu)質(zhì)小麥品種提供理論基礎(chǔ)。
供試小麥種質(zhì)包括來自7個小麥主產(chǎn)區(qū)的436份材料和課題組自選高代品系53個(表1)。所有材料均來自河南科技大學小麥種質(zhì)資源創(chuàng)新課題組,于2014-2016年統(tǒng)一種植于河南科技大學農(nóng)學院農(nóng)場,田間管理均按常規(guī)方法進行。
表1 供試小麥品種(系)及其麥區(qū)分布情況Table 1 Wheat cultivars (lines) from different wheat regions of China
1.2.1 基因組DNA提取 每份供試材料取3粒代表性的種子培育發(fā)苗,取新鮮幼嫩的葉片,參照CATB法[28-29]提取基因組DNA,用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。
1.2.2 STS功能標記 利用小麥4B染色體上LOX活性基因的STS功能標記LOX16和LOX18,檢測不同生態(tài)區(qū)小麥的LOX活性差異。所用STS標記序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成(表 2)。
表2 小麥4B染色體上LOX基因功能標記及其引物序列Table 2 Functional markers and primer sequences of LOX gene on wheat 4B chromosome
1.2.3 PCR擴增與電泳檢測 PCR反應(yīng)體系20μL,含20.0mmol/L Tris-HCl (pH8.4)2μL,20.0mmol/L KCl 2μL,2mmol/L dNTPs 2μL,15mmol/L MgCl22μL,每條引物各 0.5μL,TaqDNA 聚合酶 0.3μL(1.5U),模板 DNA 2μL(80ng),ddH2O 8.7μL。反應(yīng)在T100Thermal Cycler(Bio-Rad)擴增儀進行,采用Touchdown PCR程序:95℃預變性4min;95℃變性45s,65℃~53℃退火30s(每個循環(huán)降低0.3℃),72℃延伸2min,40個循環(huán);72℃延伸5min;4℃保溫。擴增產(chǎn)物采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(39∶1)電泳進行檢測。緩沖液體系為1×TBE溶液,110V恒定電壓電泳3h(根據(jù)擴增片段大小、帶型及環(huán)境溫度適當調(diào)整電泳時間),銀染顯影后,用Tanon Gis-2010型凝膠成像系統(tǒng)掃描成像并存入計算機。根據(jù)每個材料的檢測結(jié)果推斷其LOX活性基因類型,并進行統(tǒng)計分析。
利用LOX16與LOX18分子標記,對436份小麥材料LOX活性等位基因進行分子檢測。其中LOX16在TaLox-B1a(高LOX活性)基因型的材料中擴增出489bp的片段,在TaLox-B1b(低LOX活性)基因型的材料中無PCR擴增片段(圖1);而LOX18標記在TaLox-B1b(低LOX活性)基因型的材料中擴增出791bp的片段,在TaLox-B1a(高LOX活性)基因型的材料中無PCR擴增片段(圖 2)。
圖1 標記LOX16檢測不同麥區(qū)部分小麥品種(系)TaLox-B1等位變異Fig.1 Allelic variation of wheat cultivars (lines) from different wheat regions tested by the marker LOX16 for TaLox-B1
圖2 標記LOX18檢測不同麥區(qū)部分小麥品種(系)TaLox-B1等位變異Fig.2 Allelic variation of wheat cultivars (lines) from different wheat regions tested by the marker LOX18 for TaLox-B1
對436份小麥材料控制LOX活性等位基因變異進行分子檢測和統(tǒng)計分析,共獲得TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型3種基因變異類型(表3)。
從表3中看出,檢測出變異類型為TaLox-B1a的材料共有83份,所占比例較少,為19.0%;TaLox-B1b基因型的材料共有307份,所占比例最大,為70.4%;剩余46份變異類型為雜合型,所占比例為10.6%。
表3 不同麥區(qū)小麥TaLox-B1等位變異的分子檢測Table 3 Molecular detection of alleles of wheat TaLox-B1 in different wheat regions
從整體看,含有與高LOX活性相關(guān)的基因型TaLox-B1a的數(shù)量較少。不同生態(tài)區(qū)各等位基因變異類型的分布情況也不盡相同:與高LOX活性相關(guān)的基因型TaLox-B1a在不同生態(tài)區(qū)的分布比例均較少,其中,在黃淮冬麥區(qū)、北部冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)分布數(shù)目較多,比例分別為21.1%、19.8%和17.6%;與低LOX活性相關(guān)的基因TaLox-B1b在不同生態(tài)區(qū)的分布比例均較多,其中,在西南冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)分布所占比例分別為87.9%和72.5%;基因型為雜合型的材料在北部冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)分布較多,分別有15份和26份,比例分別為14.2%和12.4%。
利用功能標記LOX16與LOX18對53份自選高代品系的LOX活性進行分子標記輔助選擇,結(jié)果發(fā)現(xiàn),自選品系僅僅得到了TaLox-B1b和雜合型2種基因變異類型,未檢測到變異類型為TaLox-B1a的材料。其中,雜合型的材料所占比例最大,共有32個,所占比例為60.4%,基因型TaLox-B1b的材料21個,占比為39.6%;自選材料中不含與高LOX活性相關(guān)的基因型TaLox-B1a。因此,要想獲得高LOX活性小麥品種(系),需要借助分子標記輔助選擇(MAS)手段繼續(xù)對后代品系進行進一步的選擇與鑒定。
小麥品質(zhì)不僅受遺傳基因控制,也受環(huán)境因素影響,許多品質(zhì)性狀還會存在基因與環(huán)境互作的現(xiàn)象。小麥籽粒LOX是影響小麥面制品色澤的重要因素,了解不同生態(tài)區(qū)小麥品種(系)LOX基因等位變異類型及其分布有助于小麥LOX親本的選配及其早代LOX基因型的選擇。本研究結(jié)果顯示,供試小麥材料中具有LOX活性基因型TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型的頻率分別為19.0%、70.4%和10.6%。相吉山等[30]對195份新疆小麥品種的研究、張鈺玉等[31]對173份陜西小麥品種的研究和曹東等[32]對104份甘肅小麥品種的研究均表明:含有與高LOX活性相關(guān)的基因變異類型TaLox-B1a的比例遠遠低于含有與低LOX活性相關(guān)的基因變異類型TaLox-B1b,本研究的結(jié)果與其一致。造成這種結(jié)果的原因可能是由于LOX活性高的小麥籽粒往往不具有較高的耐儲藏性,因而在選育過程中遭到了淘汰。在生產(chǎn)過程中,可以根據(jù)不同的生產(chǎn)加工目的,分別選育適合加工高白度小麥制品的高LOX活性的小麥,或者是具有更高的耐儲藏性和營養(yǎng)價值更高的低LOX活性的小麥。Bai等[33]對123份新疆小麥品種的研究和張福彥等[34]對122份河南小麥品種的研究都表明,擁有TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a基因型組合的小麥品種(系)的LOX活性相對較高,而擁有TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b基因型組合的小麥品種(系)的LOX活性相對較低。
本研究利用標記LOX16和LOX18對TaLox-B1位點檢測,發(fā)現(xiàn)供試材料中存在TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型3種變異類型。其中,雜合型共有46份,15份來自北部冬麥區(qū),26份來自黃淮冬麥區(qū),該類型的出現(xiàn)可能與育種家選育的品種非純合等因素有關(guān)。
本研究利用LOX活性相關(guān)基因的功能標記LOX16和LOX18鑒定了供試材料TaLox-B1位點的等位基因變異類型,篩選出了具有高LOX活性基因位點(組合)的優(yōu)質(zhì)品種(系),為小麥面制品的顏色改良提供了材料基礎(chǔ)。當我們在應(yīng)用這些標記進行分子標記選擇輔助育種時,若能與小麥早代材料的LOX活性直接測定相結(jié)合,則可以提高選擇的可靠性和育種的準確性;另外,還需要考慮與顏色相關(guān)的其他基因、性狀、環(huán)境及地域等的綜合影響。
不同麥區(qū)小麥種質(zhì)在LOX活性基因TaLox-B1位點存在TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型3種基因變異類型。小麥TaLox-B1基因等位變異出現(xiàn)頻率不同,TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型的檢出頻率分別為19.0%、70.4%、10.6%。小麥LOX活性等位變異基因在不同麥區(qū)的分布存在顯著差異,其中,基因型TaLox-B1a在黃淮冬麥區(qū)、北部冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)分布較多,基因型TaLox-B1b在西南冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)分布較多;這為LOX活性特異種質(zhì)的篩選與引種提供了參考。對自選高代品系MAS檢測發(fā)現(xiàn),雜合型存在比例高達60.4%,說明MAS可以在早代有效檢出LOX基因等位變異位點的純合度,提高育種目標性狀的選擇效率。