太原市冬季PM2.5對人源巨噬細(xì)胞U937毒性作用的研究

袁婉珺，魏海英，耿紅

（山西大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，山西 太原030006）

0 引言

PM2.5是一種常見的空氣污染物，可通過鼻腔和嘴部吸入并深入肺部，沉積在氣道和肺泡中，之后還可能進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)以引起肺和外部組織的反應(yīng)[1-3]，造成呼吸系統(tǒng)（急性支氣管炎，急性上呼吸道和呼吸道感染等）和心血管（心肌梗死，動脈粥樣硬化等）疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)，2016年全球城市和農(nóng)村地區(qū)的空氣污染估計每年導(dǎo)致420萬人死亡。PM2.5的化學(xué)成分多達(dá)數(shù)千種以上，可分為有機(jī)和無機(jī)兩大類[4]，有機(jī)成分中多環(huán)芳烴（PAHs）作為優(yōu)先控制的有毒有害污染物，具有致癌、致畸、致突變性等毒性，且在環(huán)境中廣泛分布[5]。

芳香烴受體（AhR）是一種配體依賴性胞內(nèi)受體，能夠參與環(huán)境毒素、致癌物和化學(xué)物的代謝，感應(yīng)調(diào)節(jié)生物節(jié)律變化，氧化應(yīng)激等[6]。AhR因此也成為控制許多生理過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，包括細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、黏附和遷移，參與調(diào)節(jié)自身免疫、感染和癌癥的免疫應(yīng)答。AhR為研究遺傳和外界環(huán)境因素對健康和疾病免疫應(yīng)答等生理過程的影響提供了一個模型信號通路，其可介導(dǎo)有毒的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)如PAHs、2，3，7，8-四氯二苯并-p二惡英（TCDD）或多氯聯(lián)苯（PCB）產(chǎn)生許多反應(yīng)，從而使AhR在介導(dǎo)炎性反應(yīng)和維持機(jī)體正常發(fā)育與生理功能中發(fā)揮著重要作用[7]。多項體外實驗表明，PM2.5的有機(jī)提取物暴露能夠引起炎性因子如環(huán)氧霉素-2（COX-2）、白介素-8（IL-8）、白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的mRNA表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥[8-9]。Vogel等人研究發(fā)現(xiàn)，城市揚(yáng)塵或柴油尾氣中顆粒物的有機(jī)提取物誘導(dǎo)了IL-8、COX-2和CYP1A1的高表達(dá)，這些基因被認(rèn)為參與了PM介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[10]。

關(guān)于PM2.5對巨噬細(xì)胞的研究，我們前期的研究主要集中于動物模型的肺泡巨噬細(xì)胞，并且表明苯并[b]熒蒽、菲的暴露對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞造成顯著的細(xì)胞毒性[11-12]，但是PM2.5對人體細(xì)胞巨噬細(xì)胞的毒性機(jī)制，特別是PM2.5吸附的PAHs與細(xì)胞毒性反應(yīng)的相關(guān)性尚不清晰，因此在本研究中采集太原市冬季PM2.5，分析其PAHs含量，并使用HepG2細(xì)胞模型檢測PM2.5是否可以激活芳香烴受體，之后將巨噬細(xì)胞U937暴露于太原市冬季PM2.5有機(jī)物提取液，分析了CYP1A1和炎癥細(xì)胞因子COX-2，IL-8、IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)情況，以闡明PM2.5對人源巨噬細(xì)胞毒性的具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人源肝癌HepG2細(xì)胞和單核系U937細(xì)胞株均購于美國ATCC公司；熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒和PTX.DIR質(zhì)粒購于Promega公司；RNA提取試劑盒來自Zymo research公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green核酸染料來自Applied Biosystems公司；實時熒光定量PCR基因引物來自美國IDT公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、葡萄糖、丙酮酸鈉、佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA）、二甲基亞砜（DMSO）、苯并[a]芘（B[a]P）均購于美國Thermo Fisher Scientific公司.

1.2 PM2.5收集和提取

采樣點位于山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院五層樓頂（N37°47′，E112°34′），距離地面約15 m，采用大流量采樣器（Thermo Anderson），流量為1.13 m3/min，配以3 μm孔徑的石英微孔過濾器（Whatman）來收集PM2.5。在采集前，將過濾器在450°C的條件下加熱24 h以去除內(nèi)毒素，并稱量濾膜在采集前的重量。樣品采集于2015年12月15日到12月21日，每次采樣24 h后取下濾膜并稱重，計算顆粒物重量，收集時間持續(xù)7 d。隨后將濾膜剪成碎片，置于裝有超純水（Milli-Q）的錐形瓶中，超聲1 h，提取液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾（大約100 mL），冷凍干燥得到粉末，置于-80°C備用。在使用之前，將提取的PM2.5溶于二甲基亞砜（DMSO；0.1%）中，以制備最終濃度為 10 μg/μL的 PM2.5懸浮液。

1.3 PM2.5中 PAHs的測定

16種PAHs的測定按照（GB-HJ 646-2013）中規(guī)定的方法使用索氏提取法提取濾膜上的樣品，使用GC-MS對各PAHs進(jìn)行測定。16種PAHs的GC-MS分析條件如下表1所示。

表1 GC-MS測定16種PAHs的分析條件Table 1 Analysis conditions of measuring 16 kinds of PAHs

1.4 熒光素酶的表達(dá)與檢測

前期研究表明，AhR能夠被PM2.5吸附的某些PAHs激活并在細(xì)胞中表達(dá)[13-14]。為了檢測太原冬季PM2.5是否可以激活A(yù)hR。本研究使用了人源肝癌HepG2細(xì)胞，因為其具有很高的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞內(nèi)可以檢測到很高的AhR蛋白含量，為檢測各種配體激活A(yù)hR提供了有效的載體[15-16]。將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的12孔細(xì)胞板中，細(xì)胞密度在 2×105和 2×106細(xì)胞 /孔之間。使用PTX.DIR（插入含有單純皰疹病毒胸苷激酶（TK）啟動子和熒光素酶報告基因的載體中，與CYP1A1轉(zhuǎn)錄起始位點相關(guān)的XRE序列5’-CTCCGGTCCT TCTCACGCAA CGCCTGGGCA-3’從核苷酸-1026延伸至-999）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實驗設(shè)有對照組（DMSO；0.1%），PM2.5組（10 μg/mL），和陽性對照組（B[a]P；10 μg/mL），對轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞進(jìn)行染毒，每組設(shè)置平行4個，37°C下培養(yǎng)4 h。使用熒光素酶檢測系統(tǒng)及熒光分光光度計進(jìn)行測定，數(shù)據(jù)以相對光單位（RLU）表示。

1.5 人體巨噬細(xì)胞U937培養(yǎng)與染毒處理

為了檢測太原冬季PM2.5暴露不同時間引起的巨噬細(xì)胞毒性反應(yīng)，將人源單核U937細(xì)胞置于12孔細(xì)胞板，含有10%胎牛血清，100 U青霉素和100 μg/mL鏈霉素補(bǔ)充4.5 g/L葡萄糖，1 mmol/L丙酮酸鈉和10 mmol/L HEPES的RPMI 1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞密度在2×105和2×106細(xì)胞/孔之間。為了誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞，將U937細(xì)胞用佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA；5 μg/mL）處理，并在37 °C含有5% CO2的組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。實驗設(shè)計分組同1.4，在37°C下分別培養(yǎng)：6 h，24 h和48 h。

1.6 RNA提取逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR

U937巨噬細(xì)胞暴露于PM2.56 h，24 h和48 h后，使用RNA提取試劑盒提取U937巨噬細(xì)胞中RNA，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)化cDNA。PCR的反應(yīng)體積為20μL，按每管10 μL SYBR，8.2 mL ddH2O、0.4 μL 正向引物、0.4 μL 反向引物、1 μL cDNA模板加樣，采用IQ5實時定量PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，均擴(kuò)增45個循環(huán)，將cDNA按1倍、3倍、9倍、27倍稀釋作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用IQ5軟件將所測結(jié)果與β-actin基因的結(jié)果作比值來確定目的基因的表達(dá)量。實驗中所使用的引物序列見表2。

表2 qPCR引物序列Table 2 Primer sequences for qPCR analysis

1.7 統(tǒng)計分析

使用Graphpad Prism 8.0軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）。使用單因素方差分析（one-wayANOVA）和Tukey檢驗用于確定不同處理組之間的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，當(dāng)P＜0.05時被認(rèn)定為其具有顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 PM2.5中PAHs的含量分析

表3為太原冬季PM2.5中PAHs濃度，由表可知，PAHs的總濃度為70.38 ng/m3，占到PM2.5總量的0.91%。在16種優(yōu)先控制PAHs的中，茚并[1，2，3-cd]芘、苊烯、萘的含量較低，芘、熒蒽、?、苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝7種含量較高，尤其是苯并[b]熒蒽在所測有機(jī)物中濃度最高為13.66 ng/m3。由圖1可以看出，芘、熒蒽、?、苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝這7種化合物含量約占到了16種PAHs含量的72%。

表3 太原冬季PM2.5中PAHs的濃度Table 3 Concentrations of PAHs of wintertime PM2.5 extract from Taiyuan

圖1 太原市冬季PM2.5中不同多環(huán)芳烴（PAHs）百分比Fig.1 Percentage of different PAHs in wintertime PM2.5 extract from Taiyuan

2.2 太原市冬季PM2.5在HepG2細(xì)胞中激活A(yù)hR的表達(dá)

PAHs能夠結(jié)合AhR并誘導(dǎo)一系列的靶向基因的表達(dá)從而產(chǎn)生毒性反應(yīng)[17]。為了檢測太原PM2.5中的PAHs能否誘導(dǎo)AhR表達(dá)，將10 μg/mL的PM2.5和B[a]P暴露于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測熒光素酶的活性，結(jié)果見圖2。與對照組（DMSO）相比，太原冬季PM2.5和陽性對照（B[a]P）均誘導(dǎo)熒光素酶活性顯著增強(qiáng)，分別為對照組的52和44倍（P＜0.01），表明PM2.5激活了HepG2細(xì)胞中的AhR。

圖2 太原冬季PM2.5對HepG2細(xì)胞熒光素酶活性的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=4）Fig.2 Effects of Taiyuan wintertime PM2.5extracton luciferase activity in HepG2 cells.（*P＜0.05，**P＜0.01 versus control，n=4）

2.3 太原冬季PM2.5在U937巨噬細(xì)胞中對CYP1A1表達(dá)的影響

很多研究將CYP1A1的表達(dá)量作為確定化合物激活A(yù)hR的依據(jù)[18]。為了進(jìn)一步證實PM2.5激活了AhR，本研究測定了CYP1A1mRNA的表達(dá)（圖3），在染毒 6 h，24 h和 48 h后，PM2.5組CYP1A1mRNA的表達(dá)與對照組（DMSO）相比，均顯著上調(diào)（P＜0.05）。在染毒24 h，與對照組相比PM2.5誘導(dǎo)CYP1A1的表達(dá)增加了36倍（P＜0.01）。

圖3 太原冬季PM2.5在U937巨噬細(xì)胞中對CYP1A1mRNA表達(dá)的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=4）Fig.3 Effects of wintertime PM2.5extract from Taiyuan on the expression ofCYP1A1mRNAin U937 macrophages（*P＜0.05，**P＜0.01versus control，n=4）

2.4 太原冬季PM2.5在U937巨噬細(xì)胞中對COX-2，IL-8，IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)的影響

為了證明PM2.5激活A(yù)hR后能夠進(jìn)一步引起了細(xì)胞炎性反應(yīng)，本研究測定了炎性細(xì)胞因子COX-2，IL-8，IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)情況（圖4）。PM2.5在U937巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)了各炎性因子mRNA的高表達(dá)，與對照組相比，均具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（P＜0.05）。在不同的染毒時間6 h，24 h和48 h，4種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05），在染毒24 h達(dá)到峰值（P＜0.01），尤其是COX-2和IL-8，其相比于對照組分別增加了4.8和5倍。

圖4 太原市冬季PM2.5在U937巨噬細(xì)胞中對COX-2，IL-8，IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of wintertime PM2.5extract from Taiyuan on the expression ofCOX-2，IL-8，IL-1βand TNF-αmRNAin U937 macrophages（*P＜0.05，**P＜0.01versus control，n=4）

3 討論

太原市以煤炭為主要能源，長期以來以冶金、機(jī)械、化工、煤炭為支柱產(chǎn)業(yè)，是以輸出能源、原材料、礦山機(jī)械產(chǎn)品為主的全國重要能源重化工城市。煤炭燃燒、工業(yè)排放等產(chǎn)生的污染物容易吸附于PM2.5表面，使得PM2.5含有很多包括PAHs在內(nèi)的有機(jī)化合物[19]。PAHs種類繁多，其中包括苯并[a]芘、苯并[g，h，i]苝、苯并[b]熒蒽等在內(nèi)的16種PAHs對人體健康影響最大。本研究中太原冬季PM2.5中 PAHs的含量為 70.38 ng/m3，其中苯并[b]熒蒽為16種PAHs中含量最高為13.66 ng/m3，苯并[a]芘的濃度為5.013 ng/m3，這幾種化合物的濃度都遠(yuǎn)超于《環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3095-2012）（2.5 ng/m3）[20]。此外芘、熒蒽、?、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝在PM2.5中的濃度也較高，PM2.5的有機(jī)組成部分尤其是PAHs通過一系列的細(xì)胞毒性反應(yīng)對人體各組織造成急性和慢性毒性[21]。

已有研究已經(jīng)證實，PAHs是PM2.5誘導(dǎo)激活A(yù)hR的主要因素[17，22]。AhR作為一種細(xì)胞溶質(zhì)受體蛋白，可以結(jié)合各種配體，依據(jù)結(jié)合時間，暴露途徑和細(xì)胞因子環(huán)境的不同會不同程度地影響機(jī)體免疫系統(tǒng)[23]。正常情況下，AhR在細(xì)胞中處于不活躍的狀態(tài)，但是與PA H s結(jié)合后，使A h R與芳香烴受體蛋白（ARNT）締合組成異源二聚體，AhR-ARNT復(fù)合物與特定的脫氧核糖核酸（DNA）識別位點二惡英反應(yīng)元件（DRE）特異性結(jié)合可誘導(dǎo)一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞色素P450家族基因CYP1轉(zhuǎn)錄活動[24]。本研究的結(jié)果也證實了這一反應(yīng)機(jī)理，在PTX.DIR轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中，太原冬季PM2.5誘導(dǎo)了熒光素酶活性的增強(qiáng)，表明AhR被激活。需要說明的是，本研究在熒光酶素測定中使用的是人體HepG2細(xì)胞，這是因為HepG2細(xì)胞有更高的轉(zhuǎn)染效率[15]，并且在我們前期進(jìn)行的預(yù)實驗中，使用PTX.DIR轉(zhuǎn)染U937和HepG2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)U937細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)低于HepG2，并且在熒光素酶測試中AhR在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)量大約是U937細(xì)胞的20倍。使用U937巨噬細(xì)胞是因為本研究主要側(cè)重于顆粒物對人體巨噬細(xì)胞的毒性反應(yīng)，有文獻(xiàn)表明人源巨噬細(xì)胞U937和THP1在檢測空氣PM2.5所表達(dá)的炎性反應(yīng)比較顯著[8，16]，所以我們選取了二者進(jìn)行了預(yù)實驗，在進(jìn)行qPCR檢測之后發(fā)現(xiàn)炎性因子在U937細(xì)胞中表達(dá)的更好。雖然HepG2和U937是兩種不同的人體細(xì)胞，但仍可為進(jìn)一步說明太原市冬季PM2.5中的PAHs激活了AhR提供有力依據(jù)。

CYP1A1是一種主要的肝外細(xì)胞CYP酶，其將多種外源性和內(nèi)源性化合物（包括PAHs）催化代謝成致癌衍生物的能力已被廣泛研究[25]。CYP1A1是AhR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因，是參與PAH代謝和清除的關(guān)鍵酶。作為體內(nèi)一種重要的代謝酶，CYP1A1除了誘導(dǎo)突變，還在感染及炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用[26]。已有研究證實，在感染或炎癥產(chǎn)生時，機(jī)體中不同細(xì)胞及器官中的CYP1A1表達(dá)存在差異，導(dǎo)致內(nèi)源性和外源性化合物的代謝發(fā)生變化，從而在宿主中發(fā)揮保護(hù)或損害等不同作用[27]。已有很多研究證實CYP1A1的芳香烴受體（AhR）依賴性調(diào)控機(jī)制，本研究在人體巨噬細(xì)胞U937中，染毒24 h后PM2.5誘導(dǎo)AhR介導(dǎo)的基因CYP1A1mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步證明了太原冬季PM2.5激活了AhR。

AhR也可以協(xié)同性地誘導(dǎo)炎癥信號通路中的COX-2或白介素類細(xì)胞因子表達(dá)導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生[28]。COX-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，分化和凋亡的重要酶，它的高表達(dá)與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)炎癥密切相關(guān)[29-30]，而IL-1β，IL-8和TNF-α都是被認(rèn)為與 PM2.5介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的重要標(biāo)志物。本研究中太原冬季PM2.5誘導(dǎo)了炎癥因子COX-2、IL-1β、IL-8和TNF-α在人體U937巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

綜上所述，太原市冬季PM2.5中的PAHs激活了AhR并且促進(jìn)了巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)，說明AhR在PM2.5誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用，但具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。