miR-499-5p靶向調(diào)控鈣通道電壓依賴性β1蛋白在慢性心房顫動、心房重構(gòu)中的作用研究

李世櫻，楊玲英 ，張棟梅，劉 勇

(1.簡陽市人民醫(yī)院超聲科，四川 簡陽 641400； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院，云南 昆明 650000)

心房顫動(Atrial fibrillation，AF)是多種因素造成的心房結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而以快速無序的顫動波代替整齊有序的電傳導(dǎo)致使心律失常的一種心血管疾病，簡稱房顫[1]。研究[2]表明房顫導(dǎo)致的心房電活動紊亂，促使患者出現(xiàn)血栓、心力衰竭、心房變性、外周血管栓塞、心動過速性心肌病，甚至缺血性腦卒中等嚴(yán)重危及生命的并發(fā)癥。目前房顫的發(fā)病機制尚未完全闡明，現(xiàn)有的治療手段和藥物不能使所有患者受益。因此尋找預(yù)防和控制房顫的手段，開展個體化的靶向治療，在臨床上具有重大意義。小分子RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。研究[3]表明,多種miRNA如miR-1、miR-133等因能調(diào)控心臟離子通道、鈣離子結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白等相關(guān)基因的表達(dá)與心房顫動直接相關(guān)。近來miR-499-5p在心房顫動患者的表達(dá)異常引起關(guān)注。崔淯夏等[4]研究表明房顫患者在射頻術(shù)后外周血中miR-499-5p的表達(dá)明顯降低，推斷miR-499-5p可能成為房顫診斷與治療的靶點，但是就miR-499-5p對房顫影響的機制報道較少。L型鈣通道是細(xì)胞進(jìn)行鈣離子交換的主要途徑。研究[5]顯示L型鈣通道的異常直接導(dǎo)致心臟鈣平衡受損，進(jìn)而使心房結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，誘發(fā)心房電重構(gòu)。鈣通道電壓依賴性β1蛋白(Calcium channel voltage-dependent β1protein,CACNβ1)是L型鈣通道蛋白的β亞基。Kumfu等[6]報道提高CACNβ1的表達(dá)能明顯改善地中海缺血小鼠的心血管障礙，阻止心房有效不應(yīng)期(Atrial effective refractory period，AERP)的縮短，抑制心房結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。本研究通過建立心房顫動的動物模型，從心房電重構(gòu)的角度探討miR-499-5p和 CACNβ1在房顫中的作用，希望為房顫的臨床治療提供一個新的靶向位點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:60只新西蘭雄性大白兔，體重2.5～3.2 kg，由我院實驗動物中心從四川大學(xué)實驗動物中心采購，動物的使用許可證號：SYXK(川)2018-185。

1.1.2 主要試劑:rAAV9-miR-499-5p-inhibitors、陰性對照rAAV9-miR-499-5p-inhibitors-NC由上海吉瑪生物有限公司設(shè)計完成。異氟烷、多聚甲醛采購自Sigma公司；HE試劑盒、JC-1試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)公司；蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosinstaining，HE)試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司；兔抗GAPDH、山羊抗兔IgG采購自美國abcam公司；Western blot試劑盒購自德國Rebstock公司。

1.1.3 主要儀器:Step One Plus熒光定量PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品； Nikon Eclipse Ti-SR熒光顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品；Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-rad公司產(chǎn)品；TECNAI G2 20電鏡，美國TWIN FEI公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型構(gòu)建和分組處理：將新西蘭大白兔用隨機數(shù)字表法隨機分成四組(n=15)：假手術(shù)組(sham組)、模型組、miR-499-5p-inhibitors-NC組(對照組)和miR-499-5p-inhibitors組(實驗組)。模型組、對照組、實驗組參照文獻(xiàn)方法[7]，將實驗兔以仰臥位固定在手術(shù)臺上，常規(guī)備皮，沿第3、4肋間，備皮，開胸，逐層剝離，暴露心臟，采用結(jié)扎左心耳的方法，將動物心臟起搏器(起搏電壓5 V，起搏頻次600次/min)以及電生理刺激儀測試電極(保證電極導(dǎo)線與心房肌接觸良好)固定在左心房上，引出電極，關(guān)胸，縫合傷口。用慶大霉素沖洗起搏器囊袋，并固定在動物背部脊柱旁。將起搏器和起搏電極連接固定，測試電極置于皮下，以測電生理指標(biāo)。術(shù)后所有動物靜脈滴注青霉素抗感染。sham組開胸后只是固定心房電極，不起搏。模型組、對照組、實驗組心房持續(xù)起搏3周后(每日對實驗動物進(jìn)行心電圖檢測，以確保起搏器正常工作)，常規(guī)喂養(yǎng)一周。術(shù)前48 h，對照組和實驗組分別以30 mg/kg劑量心臟冠脈注射[8]rAAV9-miR-499-5p-inhibitors-NC和rAAV9-miR-499-5p-inhibitors，另外兩組大白兔心臟冠脈注射等劑量的PBS緩沖液。實驗過程中，sham組無死亡，模型組動物術(shù)中因氣胸導(dǎo)致縱膈擺動死亡2只，對照組動物在復(fù)查心電圖中，發(fā)現(xiàn)一只因起搏閾值過高未能誘發(fā)房顫，實驗組1只術(shù)中死亡，2只因起搏器電極脫位未能誘發(fā)房顫，因此每組動物均以10只納入實驗觀察。

1.2.2 心臟超聲檢査各組大白兔心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化：將實驗動物以異氟烷腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺，心臟彩超檢查心臟功能。記錄左心房最大容積(Left atrial maximal volume,LAVmax)，左心房最小容積(Left atrial minimal volume,LAVmin)，左心房射血分?jǐn)?shù)(Left atrial ejection fraction，LAEF)，左心房內(nèi)徑(Left atrial diameter，LAD)等數(shù)據(jù)[9]。

1.2.3 各組實驗大白兔電生理指標(biāo)AERP和房顫誘發(fā)率的測定:實驗兔起搏3周后的AERP以S1S2程序遞減刺激法，輸出電壓的一半為起搏閾值通過電生理刺激儀進(jìn)行測定150 ms基礎(chǔ)周長時的AERP150，設(shè)置S1S2間隔遞減掃描(S1S2=10∶1，步長=10 ms)，重復(fù)測定3次。以40 ms 周長Brust刺激心房10 s，以2.5倍閾值起搏，房顫持續(xù)時間大于1 s為成功誘發(fā)房顫，每只實驗動物誘發(fā)4次，間隔時長30 s，成功誘發(fā)房顫的動物只數(shù)與Brust刺激動物總只數(shù)的比值即為房顫誘發(fā)率[10]。

1.2.4 各組大白兔心肌組織病理學(xué)以及超微結(jié)構(gòu)觀察:測試完畢，處死動物，剝離心臟，取出10%心肌組織，常規(guī)固定，室溫下,HE染色，上熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。取出10%心肌組織，制成厚度約為2 mm的切片，TECNAI G2 20電鏡下觀察實驗動物心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。將余下動物的心臟組織轉(zhuǎn)入深冷冰箱中待測。

1.2.5 JC-1染色法檢測各組大白兔的心肌細(xì)胞線粒體膜電位的變化:從冰箱中分別取出各組動物10%的心肌組織，均漿，裂解，按線粒體提取試劑盒要求提取線粒體，JC-1工作液染色后，封片，鏡檢,Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，以紅色熒光與綠色熒光的比值來評定各組大白兔心臟組織線粒體膜電位變化。

1.2.6 qRT-PCR檢測miR-499-5p和靶向鈣通道電壓依賴性β1蛋白(CACNβ1)的mRNA的表達(dá):從冰箱中取出各組動物10%的心肌組織，采用常規(guī)方法提取心臟標(biāo)本中組織細(xì)胞的總RNA，PCR儀測定目標(biāo)序列的表達(dá)量。目的基因[11]miR-499-5p(上游引物為5’- GACAACATACTGCTAACCGACTC-3’，下游引物為5’- TCACTCTTCACCTGCTCCACTG-3’)，CACNβ1的mRNA(上游引物為 5’- TCTACGCAGTGCTTCTTTGCC-3’，下游引物為 5’- AAGGGGGATCTTCAGCTTTAGTA-3’)。

1.2.7 Western blot檢測各組大白兔心肌組織中CACNβ1蛋白的表達(dá):從冰箱中取出各組動物10%的心肌組織，按照常規(guī)提取目標(biāo)蛋白，裂解勻漿器后離心，測定濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入一抗(均為1∶1000)，4 ℃孵育，過夜。次日，洗滌，加入二抗稀釋液(均為1∶10000)，顯色，以GAPDH作為內(nèi)參來表達(dá)目的蛋白的相對表達(dá)。

1.2.8 熒光素酶報告基因分析:以miR-499-5p mimic和mimic control轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，洗滌細(xì)胞，用含有目的蛋白CACNβ1的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，UTR)或突變重組(pGL3-CACNβ1-MUT)載體以及Renilla標(biāo)準(zhǔn)化對照pGL3再次轉(zhuǎn)染，通過熒光素酶檢測試劑盒(Dual-Glo luciferase assay system)檢測在48 h后測量細(xì)胞的熒光強度，對應(yīng)熒光素酶活性數(shù)值為求出螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶數(shù)據(jù)比值的平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行，作圖工具采用Graphpad 5.01軟件，兩兩組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物的心電圖監(jiān)測結(jié)果以及電生理參數(shù)比較 各組大白兔心電圖監(jiān)測如圖1所示，與sham組相比，模型組的AERP150明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，抑制miR-499-5p的表達(dá)后，實驗組的AERP150明顯升高(P<0.05)。模型組與對照組相比，差異不具有統(tǒng)計意義(P>0.05)。

sham組大白兔為竇性心律，經(jīng)burst刺激未能誘發(fā)心房房顫，模型組以及對照組大白兔經(jīng)burst刺激后成功誘發(fā)房顫(持續(xù)時間不短于30 min)房顫誘發(fā)率明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，實驗組的房顫誘發(fā)率明顯下降(P<0.05)。模型組與對照組相比，差異不具有統(tǒng)計意義(P>0.05)。

A:sham組；B:模型組；C:對照組；D:實驗組。與sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

2.2 心臟彩超檢測各組大白兔的心功能變化 心臟彩超結(jié)果如圖2所示，與sham組相比，模型組左心房的LAD，LAVmax，LAVmin明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，實驗組動物的LAD、LAVmax、LAVmin明顯降低(P<0.05)。模型組與對照組相比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 實驗大白兔的心臟損傷病理以及心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察 HE染色結(jié)果如圖3所示，sham組心肌纖維呈帶狀分布，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞核性狀規(guī)則的定位于肌纖維中央，間質(zhì)無水腫情況，細(xì)胞連接緊密；模型組、對照組動物心肌纖維排列紊亂，心肌橫紋消失，核質(zhì)界限不清，核膜破裂，間質(zhì)水腫明顯；與模型組心肌纖維的排列相比，實驗組明顯規(guī)整，肌纖維變性較輕，間質(zhì)水腫明顯緩解。超微結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖4所示：sham組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，性狀規(guī)整，核膜完整，胞核性狀規(guī)整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體以及肌漿網(wǎng)數(shù)量豐富，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰可辨，無腫脹，無異常；與sham組相比，模型組、對照組動物心肌纖維溶解明顯，胞核明顯擴張，變形明顯，線粒體出現(xiàn)空泡樣變性，嵴結(jié)構(gòu)不規(guī)則，或融合、或缺失、或重疊嚴(yán)重，胞膜凹陷明顯；實驗組動物的心肌線粒體損傷明顯緩解，嵴結(jié)構(gòu)損傷程度較模型組明顯減輕，心肌纖維排列較為規(guī)則，病變程度明顯得到緩解。

A:sham組；B:模型組；C:對照組；D:實驗組。與sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

A:sham組；B:模型組；C:對照組；D:實驗組

2.4 JC-1染色法檢測各組大白兔的心肌細(xì)胞線粒體膜電位的變化 各組大白兔心肌線粒體膜電位的檢測結(jié)果如圖5所示，與sham組相比，模型組動物心肌細(xì)胞紅色熒光與綠色熒光的比值明顯降低，說明線粒體膜電位明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，實驗組大白兔心肌細(xì)胞紅色熒光與綠色熒光的比值明顯升高，說明線粒體膜電位明顯升高(P<0.05)。模型組與對照組相比，差異不具有統(tǒng)計意義(P>0.05)。

2.5 各組大白兔心肌中miR-499-5p和CACNβ1的mRNA和蛋白的表達(dá)情況 各組大白兔心肌中的miR-499-5p和CACNβ1的mRNA和蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖6所示，與正常組相比，模型組miR-499-5p的表達(dá)明顯升高，CACNβ1的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；和模型組相比，實驗組和對照組miR-499-5p的表達(dá)明顯降低，CACNβ1的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。實驗組和對照組比較，蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 熒光素酶報告基因分析結(jié)果 miR-499-5p和CACNβ1的蛋白和mRNA的變化趨勢具有明顯的關(guān)聯(lián)性，通過生物信息網(wǎng)站(www.microrna.org)上查詢miR-499-5p和CACNβ1存在特異性結(jié)合位點。采用雙熒光素酶報告基因分析來觀察兩者的關(guān)系結(jié)果如圖7示，轉(zhuǎn)染miR-499-5p后，野生型CACNβ1的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，突變型CACNβ1的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，說明 miR-499-5p能靶向調(diào)控CACNβ1的表達(dá)。

A:sham組；B:模型組；C:對照組；D:實驗組。與sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

A:sham組；B:模型組；C:對照組；D:實驗組。與sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

圖7 miR-499-5p靶向調(diào)控CACNβ1的表達(dá)

3 討 論

目前隨著人口老齡化的進(jìn)程，發(fā)病率以及致殘率逐年升高的房顫，成為威脅公眾健康的重要疾病。隨著將導(dǎo)管射頻消融術(shù)的出現(xiàn)，房顫的治療技術(shù)有了較為明顯的提高，但是其費用昂貴、操作要求嚴(yán)格以及設(shè)備的限制，難以使所有的患者獲益[12]。房顫的分子生物學(xué)機制，闡明其發(fā)展歷程，尋求房顫治療的新方案，改善患者的心臟功能，仍是臨床醫(yī)師面臨的重大挑戰(zhàn)。

最新的研究顯示[13]心房重構(gòu)主要是由病理損傷或者負(fù)荷改變導(dǎo)致的心臟大小、形狀、組織以及功能等隨之改變，是心房修復(fù)、繼發(fā)以及代償性疾病的生理病理進(jìn)程。研究表明心房重構(gòu)是心房顫動的基礎(chǔ)病理改變。越來越多的實驗證實[14]了miRNA直接參與心房重構(gòu)的病理學(xué)進(jìn)程。Lan等[15]研究表明作為內(nèi)源性的調(diào)控基因，miR-101通過調(diào)控心肌細(xì)胞的離子通道蛋白的合成，干預(yù)跨膜離子流，影響心肌細(xì)胞的觸發(fā)活性，進(jìn)而影響心房的電重構(gòu)；Yun等[16]研究證實miR-34a能影響膠原纖維的積聚，調(diào)控膠原蛋白的表達(dá)，影響心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)。miR-499-5p與心血管疾病的關(guān)系引起廣泛關(guān)注。Xin等[17]研究表明作為肌球蛋白Myh7b基因家族中成員，miR-499-5p在急性心肌梗死患者的外周血中高表達(dá)，過表達(dá)的miR-499-5p影響鈉離子通道蛋白的表達(dá)，誘發(fā)了心房電重構(gòu)。Silva等[18]研究報道在心肌缺血再灌注損傷大白兔模型中抑制miR-499-5p的表達(dá)，能增強心肌細(xì)胞中線粒體膜的穩(wěn)定性，改善動物在損傷中的心臟重構(gòu)。本研究中冠脈注射rAAV9-miR-499-5p-inhibitors后，實驗組動物的AERP150明顯升高，房顫誘發(fā)率明顯下降，動物的心房電重構(gòu)明顯受限。病理學(xué)以及超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，實驗組動物的心肌損傷以及線粒體損傷明顯緩解，線粒體膜電位有所恢復(fù)，證實抑制miR-499-5p的表達(dá)后，慢性房顫實驗兔的心房重構(gòu)有所改善。

L型鈣通道是控制鈣離子進(jìn)出心肌細(xì)胞的電壓依賴性的通道。該通道與心肌細(xì)胞的物質(zhì)與能量代謝中的生理活動密切相關(guān)[19]。王增夏等[20]報道作為L型鈣通道的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，CACNβ1能夠調(diào)控心肌細(xì)胞的L-鈣電流，直接影響房顫進(jìn)程。高杰等[21]通過表達(dá)譜芯片技術(shù)以及miRNA芯片分析顯示與健康成人相比，CACNβ1基因在永久性房顫患者的左房組織中的表達(dá)明顯降低。Ling等[22]研究證明CACNβ1和miR-499在對慢性房顫的中具有潛在的臨床診斷價值。本研究從生物信息網(wǎng)站獲知miR-499-5p和CACNβ1之間存在特異性結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示miR-499-5p能靶向調(diào)控CACNβ1的表達(dá)，并且抑制miR-499-5p的表達(dá)后實驗組動物心肌中CACNβ1的表達(dá)明顯升高。

綜上所述，miR-499-5p在慢性心房顫動動物模型動物中表達(dá)升高，抑制其表達(dá)能明顯改善動物的心臟功能，抑制其心房重構(gòu)，這可能與靶向調(diào)控CACNβ1的表達(dá)有關(guān)。但是如何將miR-499-5p的靶向作用應(yīng)用到房顫的臨床治療中還需更深入的研究。