視黃酸相關孤兒受體-白介素-23信號通路誘導病理性Th17細胞分化介導血壓升高機制研究

王 敏，吳春立，魏芳晶，于賽華，陰淑瑩，李愛英，任保軍

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管內科，內蒙古 呼和浩特 010010)

原發(fā)性高血壓是以體循環(huán)動脈壓升高為主要臨床表現(xiàn)的心血管綜合征，是重要的心腦血管病危險因素，可損傷重要器官如心、腎、腦的結構和功能，最終導致這些器官功能衰竭，探索高血壓發(fā)病機制并積極開展有效防治刻不容緩。人們對于高血壓病的發(fā)病機制進行了大量的研究，表明多種因素參與了高血壓病的發(fā)病機制，包括遺傳環(huán)境、解剖、適應性、神經系統(tǒng)、內分泌體液因子以及血流動力學。鹽敏感性是連接鹽與高血壓的遺傳基礎，是原發(fā)性高血壓的一種中間遺傳表型。不同的患者對鹽的敏感性存在差異，分為鹽敏感性和非鹽敏感性患者，前者患高血壓的幾率相對較大，約為50%～60%[1-2]。與血壓鹽敏感性相關聯(lián)的高血壓稱為鹽敏感性高血壓 (Saltisensitive hypertension，SSHT)。研究表明，鹽敏感人群的高血壓發(fā)病率和病死率均高于鹽抵抗性人群[3-4]，但發(fā)病機制不明。

既往研究證實內皮功能障礙、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)異常、交感神經系統(tǒng)激活、離子轉運異常等參與SSHT的發(fā)生和發(fā)展。同時高血壓是一種慢性炎癥綜合征，免疫異常參與其中，其中尤以病理性輔助性T 細胞17(T helper cell 17,Th17)明顯。Th17分泌白介素-17A(Interleukin-17，IL-17A)可引起血管內皮功能異常，誘發(fā)內源性一氧化氮(NO)減少至血管收縮，同時產生炎癥損傷導致血管重構，血管硬化、血壓升高[5]。白介素-23(Interleukin-23，IL-23)是促使Th17分泌IL-17及維持病理形態(tài)的重要細胞因子，它通過上調IL-23受體(IL-23R)并與之結合產生以上效應。視黃酸相關的孤兒受體(RORγt)是Th17細胞發(fā)育所必需的，RORγt在IL-23R的產生過程中發(fā)揮著重要的作用，RORγt缺陷可致Th17分化過程中IL-23R明顯減少，因此高鹽可能通過以上位點在高血壓發(fā)病中發(fā)揮作用。本項目將從高鹽導致病理性Th17細胞分化這一全新的視角，首次探討RORγt-IL-23R信號通路在SSHT發(fā)病中的作用，探討SSHT發(fā)病的免疫機制，為高血壓的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年6月至2019年6月在內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心內科病區(qū)住院的高血壓患者，經患者同意后，予鹽負荷試驗，通過此試驗篩選SSHT患者，及非鹽敏感性高血壓患者各30例，正常血壓人群健康志愿者30例為對照組，抽取外周靜脈血。其中，男52 例，女38例；年齡43～71歲，平均(57.63±9.24)歲。依據(jù)高血壓分級標準分為：高血壓Ⅰ級43 例，高血壓Ⅱ級27 例和高血壓Ⅲ級21 例。高血壓組和健康對照組性別、年齡等資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例納入標準：符合原發(fā)性高血壓診斷標準。排除標準：不同意參加實驗研究者，合并嚴重疾病者。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象都簽訂了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 Th17細胞分化機制：①樣本收集與分組：選擇內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心內科病區(qū)住院的高血壓患者，經患者同意后，予鹽負荷試驗，通過此試驗篩選SSHT患者，選取SSHT及非鹽敏感性高血壓患者各30例，正常血壓人群健康志愿者30例，抽取外周靜脈血。②檢測正常血壓人群健康志愿者、鹽敏感性高血壓患者及非鹽敏感性高血壓患者外周血CD4+T細胞中Th17細胞比例：將各組外周靜脈血高速冷凍離心機梯度離心，分離外周單個核細胞，使用抗IgG磁珠陰性分選單個核細胞中總CD4+T細胞，釆用流式細胞技術檢測CD4+IL-17A細胞比例。 ③檢測正常血壓人群健康志愿者、SSHT患者及非鹽敏感性髙血壓患者外周血IL-17A：將各組外周血離心后取上層血清，ELISA檢測IL-17A。

1.2.2 RORγt-IL-23R信號通路：①檢測正常環(huán)境、不同濃度NaCl(10、20、40、80 mmol/L)下人初始CD4+T細胞中Th17細胞比例：分離正常血壓健康志愿者外周血總CD4+T細胞(方法如前述)，釆用流式活化細胞分選儀，分選初始CD4+T細胞(CD45RA、CD45RO、CD25、CD127)體外培養(yǎng)，此后分別加入不同濃度NaCl(0、10、20、40、80 mmol/L)， 4 h后釆用流式細胞技術檢測各組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例。②檢測正常環(huán)境、不同濃度NaCl(10、20、40、80 mmol/L)下外周血IL-17A：將各組外周血離心后取上層血清，ELISA檢測IL-17A。③40 mmol/L NaCl下CD4+T細胞分別加入RORγt拮抗劑、IL-23R拮抗劑，觀察對Th17細胞分化影響，檢測P38-RORγt-IL-23R信號通路：40 mmol/L NaCl下CD4+T細胞加入RORγt拮抗劑，檢測IL-17A表達變化，流式細胞技術檢測Th17細胞比例； 40 mmol/L NaCl下CD4+T細胞加入IL-23R拮抗劑，檢測IL-17A表達變化，流式細胞技術檢測Th17細胞比例。

2 結 果

2.1 各組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞比例 與對照組相比鹽敏感性高血壓組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例明顯增高，具有統(tǒng)計學意義，與對照組相比非鹽敏感性高血壓組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 CD4+Th17細胞占CD4+T細胞比例

2.2 各組外周血CD4+Th17細胞占IL-17A細胞比例 與對照組相比鹽敏感性高血壓組的IL-17A比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與對照組相比非鹽敏感性高血壓組的IL-17A 比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組外周血CD4+Th17細胞占IL-17A細胞比例(%)

2.3 不同濃度NaCl干預下各組 CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例 不同濃度NaCl培養(yǎng)人初始CD4+T細胞，CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例均增高，并且隨著NaCl濃度增高， CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例逐漸增高。見圖2。

圖2 不同濃度NaCl干預下各組 CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例

2.4 不同濃度NaCl干預下CD4+Th17細胞/CD4+T細胞 不同濃度NaCl培養(yǎng)人初始CD4+T細胞中IL-17A水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。并隨著培養(yǎng)基NaCl濃度的增高，CD4+T細胞中IL-17A水平逐漸增高。見表2。

表2 不同濃度NaCl干預下CD4+Th17細胞/CD4+T細胞(%)

2.5 40 mmol/LNaCl下CD4+T細胞分別加入RORγt拮抗劑、IL-23R拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例 40 mmol/L NaCl培養(yǎng)人初始CD4+T細胞組做對照組，與對照組相比加入RORγt拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例減少，與對照組相比加入IL-23R拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例減少。見圖3。

圖3 加入RORγt拮抗劑、IL-23R拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例

3 討 論

2017中國心血管病報告，中國心血管患者仍然持續(xù)增加，心血管病現(xiàn)患人數(shù)2.9億。隨著我國人民生活水平的提高和人口老齡化，冠心病、高血壓疾病患病率明顯增加[6]。 以高血壓為危險因素誘發(fā)的心腦血管疾病目前持續(xù)上升趨勢，進行高血壓有效防治意義重大，探索其發(fā)病機制刻不容緩。鹽敏感性是鹽與高血壓的鏈接基礎，但機制不明。SSHT[7-9]的特征在于響應于膳食鹽攝入增加的血壓升高，并且與心血管和腎臟疾病的風險增加相關。其與種族、地理環(huán)境、社會因素、腎臟功能、激素和飲食習慣等相關。近年來的研究發(fā)現(xiàn)高鹽可使初始CD4+細胞向病理性的TH17細胞分化[10-11]。近年來的研究表明，高血壓伴有局部和系統(tǒng)性的炎癥反應，與免疫炎癥相關的淋巴細胞及其細胞因子參與了高血壓的發(fā)生與發(fā)展[12-14]。研究表明，抑制高血壓 T 淋巴細胞參與的炎癥反應，就能夠減輕血壓升高及其導致的靶器官損害[15]。

Th17細胞屬CD4+效應T細胞亞群,參與介導炎性反應、自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。分化成熟的Th17分泌IL-17,在多種自身免疫性疾病和炎性疾病中起關鍵作用[16]。TH17在高血壓的發(fā)病中起著重要作用，TH17分泌IL-17A可引起血管內皮功能障礙，導致內源性NO減少血管收縮，同時炎癥損傷導致血管重構，血管硬化、血壓升高[17-18]。實驗結果顯示鹽敏感性高血壓組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例明顯高于健康志愿者組。不同濃度NaCl培養(yǎng)人初始CD4+T細胞，CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例均高于健康志愿者組，并且隨著NaCl濃度增高， CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例逐漸增高。表明SSHT患者外周血TH17細胞比例及IL-17升高，并與鹽濃度顯正相關。說明TH17細胞引起的免疫反應參與了高血壓的進程，促進SSHT的發(fā)生。

IL-23 是一種新的免疫調節(jié)因子，研究證明IL-23在一些自身免疫性疾病中存在前炎性反應活性[5]。IL-23是促使Th17分泌IL-17及維持病理形態(tài)的重要細胞因子，它通過上調IL-23受體(IL-23R)并與之結合產生以上效應。視黃酸相關的孤兒受體(RORγt)是Th17細胞發(fā)育所必需的，也在IL-23R的產生過程中發(fā)揮著重要的作用，RORγt缺陷可致Th17分化過程中IL-23R明顯減少。 本研究結果顯示高濃度NaCl培養(yǎng)基下CD4+T細胞中分別加入RORγt拮抗劑、IL-23R拮抗劑CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例均較40 mmol/L NaCl培養(yǎng)人初始CD4+T細胞組CD4+Th17細胞占CD4+T細胞的比例降低，說明RORγt-IL-23R信號通路可誘導病理性Th17細胞分化從而導致SSHT的發(fā)生。

綜上所述，TH17細胞引起的免疫反應參與了高血壓的進程，促進SSHT的發(fā)生。RORγt-IL-23R信號通路可誘導病理性Th17細胞分化從而導致SSHT的發(fā)生。