大白菜細(xì)菌性角斑病抗性鑒定方法的建立

任峻輝 劉 焱 吉晶晶 陳志強(qiáng) 張耀偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

大白菜細(xì)菌性角斑病是猝發(fā)性病害，對(duì)大白菜的產(chǎn)量及品質(zhì)影響較大。近年來(lái)該病害不僅發(fā)生得愈加頻繁而且發(fā)病地域越來(lái)越廣泛，華北、東北地區(qū)發(fā)生普遍，山東、河南、四川等地也均有發(fā)生，抗細(xì)菌性角斑病已成為大白菜育種的重要方向?？共∮N需要有抗病種質(zhì)資源，簡(jiǎn)單有效的接種鑒定方法是鑒定資源抗病性的前提，也是抗病育種的基礎(chǔ)。大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)現(xiàn)近60 年，發(fā)病呈上升趨勢(shì)，但至今還未見(jiàn)關(guān)于大白菜抗細(xì)菌性角斑病鑒定方法的報(bào)道。細(xì)菌性角斑病的病原菌為丁香假單孢菌（Pseudomonas syringae），能侵染多種蔬菜作物（Bull et al.，2004，2015；Harighi，2007；Takikawa &Takahashi，2014；Nay et al.，2019）。生產(chǎn)中黃瓜細(xì)菌性角斑病發(fā)病相對(duì)較重，較早地建立了黃瓜細(xì)菌性角斑病的抗性鑒定方法（關(guān)鐘燕，1990；馬柏壯 等，2013）。本試驗(yàn)研究了不同接種溫度、接種濕度、接種苗齡以及接種濃度對(duì)大白菜苗期細(xì)菌性角斑病發(fā)病的影響，以期建立大白菜細(xì)菌性角斑病的抗性鑒定方法，為大白菜抗細(xì)菌性角斑病種質(zhì)資源篩選以及抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大白菜細(xì)菌性角斑病病樣于2018 年8 月采自哈爾濱市向陽(yáng)鄉(xiāng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地大白菜育種譜地，供試大白菜為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院選育的自交系A(chǔ)224-1（感?。?64-1-1（感?。?03-1（耐?。┘?31-1（抗?。?。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌性角斑病病原菌分離 取發(fā)病株葉片，用清水沖洗干凈，在無(wú)菌環(huán)境下切取病健交界處5 mm × 5 mm 的小塊，浸入70%乙醇中消毒3～4 s，再用無(wú)菌水反復(fù)清洗4～5 次，每次清洗3 min；然后用滅菌玻璃棒將表面消毒后的病葉組織研碎，并加入少量無(wú)菌水稀釋，用涂布棒蘸取菌液均勻涂在KB 固體培養(yǎng)基上，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；待單菌落出現(xiàn)，挑取單菌落于KB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁菌株，備用（張吉光 等，2010）。

1.2.2 病原菌分子鑒定 采用16S rDNA 通用引物1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）/27F（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）、gyrB基因引物UP-1E（5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGCNG GRTCYTTYTCYTGRCA-3′）/APrU（5′-CAGGAAA CAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA-3′）和rpoD基因引物70R（5′-ACGACTGACCCGGT ACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT-3′）/70F（5′-ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYA TGMGNGARATGGGNACNGT-3′）對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Yamamoto et al.，2000），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)單一、清晰的亮帶進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物與Buffer 按4V∶1V混合，按上述步驟再進(jìn)行凝膠電泳，回收產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI 進(jìn)行比對(duì)、鑒定。

1.2.3 大白菜細(xì)菌性角斑病抗性鑒定方法 采用三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按L9（34）正交表（表1）設(shè)置9 個(gè)處理（表2），分析接種苗齡、濕度及溫度對(duì)大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病的影響。以噴接無(wú)菌KB 液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，每處理20 株，3次重復(fù)。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

將大白菜自交系A(chǔ)224-1 分3 期播種于7 cm ×7 cm 的營(yíng)養(yǎng)缽中，每期間隔5 d；每缽播3 粒，拉十字期留1 株；置于日光溫室內(nèi)，晝/夜溫度控制在25～28 ℃/15～18 ℃，待幼苗分別長(zhǎng)至3～4 葉期、5～6 葉期、7～8 葉期進(jìn)行接種試驗(yàn)。為達(dá)到最佳接種條件，接種試驗(yàn)在人工氣候室中進(jìn)行。病原菌菌株用KB 液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁，采用分光光度計(jì)法測(cè)定細(xì)菌懸浮液濃度并稀釋到1 × 108cfu·mL-1；采取噴接方式，每株選1 片幼葉進(jìn)行接種并做好標(biāo)記，每株接種量1.5～2.0 mL，接種后保濕48 h。于接種7 d 后調(diào)查發(fā)病情況。

得到最佳接種苗齡、接種濕度及接種溫度后，將供試菌株配制成3 個(gè)不同濃度菌液：1 × 108、1 × 1010、1 × 1012cfu·mL-1，分別接種于不同抗性的3 個(gè)大白菜自交系264-1-1、331-1 和203-1 上，保濕24 h。分別于接種后7、10 d 調(diào)查發(fā)病情況，從而確定最佳接種濃度。

1.2.4 病情分級(jí)與發(fā)病情況調(diào)查 采用Image J 軟件測(cè)量發(fā)病的葉片面積和病斑面積，以病斑面積與葉片面積的比率劃分病情等級(jí)：0 級(jí)，不發(fā)?。?級(jí)，病斑面積＜20%；3 級(jí)，20%≤病斑面積＜40%；5 級(jí)，40% ≤病斑面積＜60%；7 級(jí)，60%≤病斑面積＜80%；9 級(jí)，病斑面積≥80%。

群體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照“九五”國(guó)家攻關(guān)組制定的病毒病和霜霉病的群體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。免疫（I）：病情指數(shù)為0；高抗（HR）：0 ＜病情指數(shù)≤11.11；抗?。≧）：11.11 ＜病情指數(shù)≤33.33；耐病（T）：33.33 ＜病情指數(shù)≤55.55；感?。⊿）：55.55 ＜病情指數(shù)≤77.77；高感（HS）：77.77 ＜病情指數(shù)≤100.00。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將病情指數(shù)進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換后，采用DPS 9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析和差異多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜細(xì)菌性角斑病病原菌分離、鑒定

取田間發(fā)病株（圖1）進(jìn)行病原菌分離、純化，獲得ALP-1 菌株。該菌株在KB 固體培養(yǎng)基的表面上菌落顯現(xiàn)為乳白色，扁平、近圓形或略呈不規(guī)則形；單菌落的直徑為5～7 mm，中央凸起且具同心環(huán)紋；邊緣呈透明狀。菌體短桿狀，極生鞭毛。病原菌經(jīng)16S rDNA、gyrB和rpoD基因擴(kuò)增、測(cè)序，與NCBI 網(wǎng)站比對(duì)后鑒定為丁香假單孢菌Pseudomonas syringaepv.syringaevan Hall。按照柯赫氏法則，將ALP-1 菌株接種于大白菜自交系A(chǔ)224-1 上，發(fā)病癥狀與田間癥狀一致；取接種后病斑進(jìn)行病原菌再分離、鑒定，鑒定病原與接種的菌株ALP-1 完全一致。確定采自哈爾濱市向陽(yáng)鄉(xiāng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地的大白菜細(xì)菌性角斑病病原菌為丁香假單孢菌丁香致病型（Pseudomonas syringaepv.syringaevan Hall）。

2.2 接種苗齡、濕度及溫度對(duì)大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病的影響

2.2.1 不同處理的發(fā)病情況 從表2 可以看出，大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病率和病情指數(shù)最高的均是處理3，處理2 次之。參照“九五”國(guó)家攻關(guān)組制定的大白菜病毒病和霜霉病的群體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和其他病害抗性鑒定等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)（馬燕勤 等，2018；孫葉爍 等，2019），處理2 的病情指數(shù)為30.06，屬于抗病等級(jí)。而2018 年自交系A(chǔ)224-1 田間發(fā)病重于其他育種材料，同時(shí)7～8 葉期大白菜接種3 d后開(kāi)始發(fā)病，明顯早于3～4 葉期和5～6 葉期。綜合各方面因素考慮，處理3（苗齡7～8 葉期、接種溫度25～30 ℃、接種濕度90%～100%）為大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病的最佳條件組合。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析結(jié)果

2.2.2 病情指數(shù)極差分析 為了分析接種苗齡、接種溫度、接種濕度對(duì)大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病的影響程度，對(duì)這3 個(gè)因素進(jìn)行極差分析。由表2 可以看出，接種溫度的極差最大，其次為接種濕度，接種苗齡的極差最小。表明苗期抗性鑒定受接種溫度的影響最大，接種濕度影響次之，接種苗齡對(duì)其影響最小，且最佳優(yōu)化條件為A3B3C3。

2.2.3 病情指數(shù)方差分析 進(jìn)一步的方差分析結(jié)果表明（表3），C 因素和B 因素的F值均大于F0.01=6.23，說(shuō)明這兩個(gè)因素各水平間差異達(dá)極顯著水平，二者對(duì)細(xì)菌性角斑病發(fā)病的影響均較大；A 因素F值小于F0.05=3.93，不同苗齡間差異不顯著。方差分析結(jié)果與極差分析的結(jié)果基本保持一致。

表3 大白菜細(xì)菌性角斑病病情指數(shù)方差分析結(jié)果

2.3 不同接種濃度對(duì)大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病的影響

確定大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病的最優(yōu)條件組合后，選取田間有抗感差異的3 個(gè)大白菜自交系264-1-1、203-1、331-1 進(jìn)行最佳接種濃度篩選。從表4 可以看出，當(dāng)菌液濃度達(dá)到1 × 1010cfu ·mL-1時(shí)，接種10 d 后3 個(gè)自交系的病情指數(shù)分別為33.21、40.27、57.95，分別表現(xiàn)為抗病、耐病、感??；1 × 108cfu·mL-1和1 × 1012cfu·mL-1濃度菌液接種10 d 以及3 個(gè)濃度菌液接種7 d，3 個(gè)自交系之間抗感差異區(qū)分度欠佳。所以最佳接種濃度為1 × 1010cfu·mL-1，應(yīng)在接種后10 d 進(jìn)行調(diào)查。

表4 不同接種濃度對(duì)大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病的影響

3 結(jié)論與討論

大白菜細(xì)菌性角斑病的最適發(fā)病溫度為25～28 ℃（張淑霞 等，2006），本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了3 個(gè)接種溫度：15～20 ℃、20～25 ℃和25～30 ℃，為了更接近于自然環(huán)境將晝夜溫差設(shè)置為5 ℃。試驗(yàn)結(jié)果表明溫度因素對(duì)細(xì)菌性角斑病發(fā)病影響較大，15～20 ℃不利于發(fā)病，25～30 ℃發(fā)病較重，說(shuō)明高溫有利于細(xì)菌性角斑病發(fā)病。本試驗(yàn)接種后發(fā)現(xiàn)濕度越大發(fā)病越明顯，在接種濕度為90%～100%的條件下最易發(fā)病，這一結(jié)論與張淑霞等（2006）陰雨天易發(fā)病且病菌會(huì)借風(fēng)雨和灌溉水等方式進(jìn)行傳播的研究結(jié)果相符。本試驗(yàn)確定適宜的接種溫度為25～30 ℃、接種濕度為90%～100%，符合細(xì)菌性角斑病田間發(fā)病規(guī)律和發(fā)病基本條件，筆者多年田間觀察發(fā)現(xiàn)大白菜細(xì)菌性角斑病多在8 月上中旬、大雨過(guò)后空氣潮濕的時(shí)候大面積發(fā)生，而且發(fā)病程度更為嚴(yán)重。

目前，關(guān)于大白菜細(xì)菌性角斑病接種的最適苗齡未見(jiàn)報(bào)道。據(jù)田間發(fā)病調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果，大白菜進(jìn)入蓮座期且遇陰雨天氣時(shí)易發(fā)病，而且多在大白菜外葉發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)病斑會(huì)相互連片。本試驗(yàn)結(jié)果表明，接種苗齡對(duì)發(fā)病的影響與接種溫度和接種濕度相比屬于次要因素，但是不同接種苗齡仍然對(duì)大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病產(chǎn)生影響，7～8 葉期接種更容易發(fā)病。說(shuō)明大白菜細(xì)菌性角斑病在大苗齡植株上更易發(fā)病，這也與田間觀察結(jié)果相符。

盡管到目前為止，還未見(jiàn)大白菜細(xì)菌性角斑病抗性鑒定方法方面的報(bào)道，但是接種濃度對(duì)蔬菜作物抗病性鑒定結(jié)果的影響應(yīng)該是很大的，濃度過(guò)低植株不易發(fā)病，而濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致耐病品種和抗病品種發(fā)病程度偏重，不易于區(qū)分不同品種間的抗性差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，接種濃度對(duì)大白菜細(xì)菌性角斑病發(fā)病的影響較大，菌液濃度為1 × 1010cfu ·mL-1時(shí)，接種10 d 后可以區(qū)分不同品種間的抗、感病差異，因此確定該濃度為大白菜苗期活體接種的最佳濃度。

本試驗(yàn)僅是對(duì)大白菜細(xì)菌性角斑病抗性鑒定方法的初次探討，希望能對(duì)我國(guó)大白菜抗細(xì)菌性角斑病育種提供借鑒。