北京、山東、陜西部分地區(qū)番茄褐色皺紋果病毒的檢測及同源性分析

高文征 范麗娜 李曉東 陳一帆 邱卓瑤 黃澤軍 李君明舒金帥劉磊 國艷梅 杜永臣 王孝宣*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 西安金鵬種苗有限公司，陜西西安 710018）

番茄褐色皺紋果病毒（tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV）是帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）病毒。ToBRFV基因組全長6 392 nt，是正義鏈RNA 病毒，包含4 個開放讀碼框（ORFs）：ORF1 和ORF2 編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白，ORF3 編碼運動蛋白（MP），ORF4 編碼衣殼蛋白（CP）（Salem et al.，2015）。ToBRFV 可導(dǎo)致番茄花葉、深綠色突起、葉片狹窄，葉脈黃化嚴(yán)重時壞死，花和果實數(shù)量減少，果實著色不均或出現(xiàn)黃色、褐色斑塊，果實變小，出現(xiàn)皺紋，發(fā)病嚴(yán)重時果梗壞死，嚴(yán)重影響番茄果實的品質(zhì)和商品性（張宇 等，2020）。通常情況下，選育含有Tm-2和Tm-22抗性基因的番茄品種可以抵御煙草花葉病毒屬病毒如煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）和番茄輕斑駁病毒（tomato mild mottle virus，ToMMV）等對番茄的危害，但研究結(jié)果表明含有Tm-22基因的番茄品種對ToBRFV 表現(xiàn)為感病，ToBRFV 已在國際上引起了廣泛的重視，目前歐洲植物保護組織（EPPO）已經(jīng)將其添加到警戒名單（Weber &Pfitzner，1998；de Ronde et al.，2014；Luria et al.，2017）。

ToBRFV 于2015 年在約旦被首次發(fā)現(xiàn)（Salem et al.，2015），2017 年在以色列被報道（Luria et al.，2017）。此后ToBRFV 在土耳其、德國、英國、意大利、美國、墨西哥等多個國家相繼發(fā)生，其范圍已遍布?xì)W洲、美洲和亞洲（Salem et al.，2015，2019；Luria et al.，2017；Alkowni et al.，2019；Fidan et al.，2019；Ling et al.，2019；Menzel et al.，2019；Panno et al.，2019；Rodríguez-Mendoza et al.，2019；Skelton et al.，2019）。2019年我國山東報道了ToBRFV 的發(fā)生（Yan et al.，2019）。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所番茄育種團隊2019—2020 年在北京南口、陜西白水、山東壽光發(fā)現(xiàn)了多份疑似感染ToBRFV 的植株，表現(xiàn)為果實上出現(xiàn)著色不均或黃色、褐色斑塊，果實變小，出現(xiàn)皺紋。本試驗通過對北京、山東和陜西的22份感病樣品進行ToBRFV檢測，發(fā)現(xiàn)7份陽性樣品，對7 份陽性樣品的保守結(jié)構(gòu)域ORF2 即RdRP基因進行RT-PCR 擴增檢測及測序，并進行ToBRFV的進化關(guān)系分析，擬為ToBRFV 的有效防治提供參考，且為進一步進行抗性材料篩選及抗性基因挖掘提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 參試22 份材料分別于2019 年和2020年收集于北京南口、山東壽光和陜西白水（表1）。

表1 參試材料的地理來源及品種特征

1.1.2 生化試劑和菌株、載體 RNA 提取試劑盒為北京華越洋生物科技有限公司的Quick RNA Isolation Kit，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為ABM 公司的OneScript?Plus cDNA Synthesis Kit，高保真酶為南京諾維贊生物科技有限公司的2× Phanta?Max Master Mix（Dye Plus），DNA 凝膠回收試劑盒為北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司的TSINGKE GE0101-200，克隆載體pMD18-T Vector Cloning Kit、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均由唯地2nd lab 提供。分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker Ⅲ由天根生化科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄果實總RNA 的提取及RT-PCR 擴增檢測 使用RNA 提取試劑盒提取番茄果實總RNA。取疑似感病番茄果實樣品3 個，在果實中間部位橫切，除去膠質(zhì)，取面積為1 cm × 1 cm 的外果皮，切成3 mm × 3 mm 的小碎塊，用液氮迅速冷卻，置于研缽研磨。取50～100 mg 研磨后的樣品于2 mL 無酶離心管中，依照試劑盒提取說明步驟提取總RNA，保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)試驗。以番茄果實總RNA 作為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用RTPCR 技術(shù)對ToBRFV 進行檢測，以cDNA 為模板，利用已發(fā)表的ToBRFV 檢測引物F-3666（5′-ATGGTACGAACGGCGGCAG-3′）與R-4718（5′-CAATCCTTGATGTGTTTAGCAC-3′）進行RT-PCR 擴增（Luria et al.，2017）。擴增體系50.0 μL，包括cDNA 2.0 μL，2× Phanta?Max Master Mix（Dye Plus）25.0 μL，上下游引物各2.0 μL，滅菌水19.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，63 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 ToBRFV 的RdRP基因擴增、序列克隆及測序 ORF2 是ToBRFV 的保守結(jié)構(gòu)，編碼1 個RdRP。使用ToBRFV 保守結(jié)構(gòu)域RdRP特異性引物F-3666 與R-4718 對其進行擴增，并克隆測序（Luria et al.，2017）。RT-PCR 擴增體系和反應(yīng)程序同1.2.1。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠回收試劑盒回收目的譜帶，回收產(chǎn)物克隆到pMD18-T Vector 上。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，經(jīng)驗證選取5 個陽性克隆，再分別選取3 個譜帶最明顯的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.3 序列分析 將得到的RdRp基因序列在NCBI網(wǎng)站中進行分析比對，根據(jù)比對結(jié)果，選取NCBI上已發(fā)表的ToBRFV 分離物的RdRp基因完整序列8 份。利用DNAStar 中的MegAlign 軟件對選定的序列進行同源性比對，利用Mega X 軟件的Clustal W 法進行多序列比對分析以及鄰接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)進化樹中各分支置信度（bootstrap）設(shè)置為1 000 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ToBRFV 的RT-PCR 擴增檢測結(jié)果及感病番茄癥狀

利用ToBRFV 的特異性引物F-3666 和R-4718對22 份樣品進行RT-PCR 檢測，結(jié)果從7 份樣品（19g-273、19g-770、19g-850、19g-946、20g-212、20g-311 和20-YL）中檢測出分子量為1 052 bp 的ToBRFV 特異譜帶（圖1），其余15 份樣品沒有檢測出相應(yīng)的譜帶。其中從北京樣品中檢測出5份陽性樣品，從山東和陜西樣品中各檢測出1 份陽性樣品。

上述結(jié)果表明ToBRFV 已在北京、山東及陜西出現(xiàn)。健康番茄果實表面光滑，著色均勻，色澤鮮亮（圖2-A），輕度感染ToBRFV 的植株表現(xiàn)為果實著色不均（圖2-B～2-D），隨著感染程度的加重，果實表面出現(xiàn)黃色或褐色斑塊，并出現(xiàn)皺紋（圖2-E～2-G），發(fā)病嚴(yán)重時果實嚴(yán)重著色不均并伴有黃色或褐色斑塊，果實表面皺紋加重，完全失去商品價值（圖2-H）。

2.2 ToBRFV RdRP 基因序列分析

將來自北京、山東、陜西的7 份感病材料的ToBRFVRdRP基因序列與亞洲、歐洲、美洲的7個國家8 份ToBRFVRdRP基因序列（表2）進行序列同源性分析及進化樹構(gòu)建。結(jié)果表明，來自陜西白水、山東壽光和北京南口的7 份材料的ToBRFVRdRP基因同源性較高，來自亞洲、歐洲、美洲的其他8 份ToBRFVRdRP基因之間同源性較高，而北京、山東及陜西的7 份ToBRFVRdRP基因和來自其他國家的8 份ToBRFVRdRP基因之間同源性較低。

系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，2020 年來自陜西的感病材料20-YL 與2019 年來自北京的感病材料19g-946、19g-850、19g-770 的親緣關(guān)系比2019 年來自山東的感病材料19g-273 更近。2020 年來自北京的感病材料20g-212 和20g-311 與2019 年來自北京和山東、2020 年來自陜西的感病材料19g-273、19g-770、19g-850、19g-946、20-YL 處于2個分支，且與20-YL 親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。來自北京、山東和陜西的7 份感病材料的ToBRFVRdRP基因與其他國家的8 份ToBRFVRdRP基因在進化樹上處于2 個分支（圖3）。北京、山東及陜西的ToBRFV 起源于何處有待進一步研究。

3 討論與結(jié)論

ToBRFV 自首次被發(fā)現(xiàn)以來，迅速在全球傳播。歐洲植物保護組織（EPPO）已經(jīng)將其添加到警戒名單。本試驗結(jié)果表明，ToBRFV 在北京、山東及陜西都已發(fā)生，說明ToBRFV 已經(jīng)開始在國內(nèi)多地傳播，必須引起足夠的重視。2019 年在山東報道的ToBRFV 序列與ToBRFV-IL 和ToBRFV-Jo的親緣關(guān)系分別為99.91%和99.86%（Yan et al.，2019），而此次來自北京、山東及陜西的7 份感病材料ToBRFV 序列與ToBRFV-IL 和ToBRFV-Jo的親緣關(guān)系均小于90%，而同一取樣點不同年份感病材料的序列也有差異，這可能與不同年份種植材料的引種地不同有關(guān)，關(guān)于ToBRFV 在國內(nèi)傳播的起源有待進一步研究。

目前ToBRFV 的防治方法主要有物理防治和化學(xué)防治。物理防治主要是進行輪作，如茄子、馬鈴薯等作物對ToBRFV 表現(xiàn)抗性，可以將番茄與大蒜、馬鈴薯、茄子等進行輪作，以緩解ToBRFV 帶來的危害（Luria et al.，2017）。化學(xué)防治手段主要是噴灑病毒抑制劑，如20%嗎胍·乙酸銅可濕性粉劑、0.5%氨基寡糖素水劑、8%寧南霉素水劑等（楊芳，2018）。培育抗病品種仍是防治ToBRFV的最有效手段，但由于含Tm-22基因的材料對ToBRFV 表現(xiàn)為感病，所以急需挖掘針對ToBRFV的抗性基因，用于培育抗ToBRFV 的育種材料。關(guān)于ToBRFV 抗性材料篩選及抗性基因克隆的相關(guān)研究較少。荷蘭安莎公司、法國VILMORIN &CIE公司、荷蘭瑞克斯旺集團等都提出了針對ToBRFV培育抗性品種的解決方案（Hamelink et al.，2019；Ashkenazi et al.，2020；Zaden，2020）。荷蘭瑞克斯旺集團篩選出3 份有抗性的醋栗番茄（S.pimpinellifolium），并在11、12、6 號染色體上找到了3 個QTL（Hamelink et al.，2019）。這3 個QTL為不完全顯性，但將抗病材料與感病材料雜交得到的F1抗性不理想，仍需進一步篩選抗性更加優(yōu)良的材料。本試驗已經(jīng)獲得ToBRFV 感病番茄材料，ToBRFV 的接種體系建立及抗病材料篩選正在進行中。